Extracto
El tipo I proteína transmembrana con factor de crecimiento epidérmico y dos motivos follistatina 2 ( TMEFF2), se expresa principalmente en el cerebro y próstata. La expresión de TMEFF2 está desregulado en el cáncer de próstata, lo que sugiere un papel en esta enfermedad, pero el mecanismo molecular (s) que participan en este efecto no están claros. Aunque los andrógenos promueven
tmeff2
la transcripción, la entrega de andrógenos a los animales castrados que llevan xenoinjertos CWR22 aumenta los niveles de proteína TMEFF2 en ausencia de cambios de ARNm, lo que sugiere que
TMEFF2
también puede estar regulada post-transcripcional. Aquí nos muestran que la traducción de
TMEFF2
está regulada por andrógenos. La adición de concentraciones fisiológicas de dihidrotestosterona (DHT) a las líneas celulares de cáncer de próstata aumenta traducción de endógena de
TMEFF2
o transfectada
TMEFF2-luciferasa
fusiones, y este efecto requiere la presencia de marcos de lectura abierta aguas arriba ( uORFs) en la región 5 'no traducida (5'-UTR) de
TMEFF2
. El uso de la inhibición de siRNA del receptor de andrógenos (AR) y la química, se muestra que el efecto de los andrógenos en
TMEFF2
traducción está mediada por la AR. Es importante destacar que, DHT también promueve la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación de la traducción 2 (eIF2α) de una manera dependiente de AR, en paralelo con el efecto sobre la traducción
TMEFF2
. Por otra parte, el retículo endoplasmático (ER) condiciones de estrés, que promueven la fosforilación eIF2α, también estimulan
TMEFF2
traducción. Estos resultados indican que la señalización de andrógenos promueve la fosforilación eIF2α y la posterior traducción de
TMEFF2
a través de un mecanismo que requiere uORFs en el 5'-UTR de
TMEFF2
Visto:. Overcash RF, VA Chappell, camiseta verde, Geyer CB, Asch AS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) de señalización de andrógenos promueve la traducción de
TMEFF2
en células de cáncer de próstata a través de fosforilación de la subunidad α de la traducción inicio factor 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10.1371 /journal.pone.0055257
Editor: Hari Koul, Universidad de Colorado, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2012; Aceptado 27 de diciembre de 2012; Publicado: 6 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Overcash et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del Instituto Nacional del cáncer (1R15CA155873). Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que ningún interés en competencia existe
Introducción
señalización a través del AR los andrógenos desempeñan un papel esencial en el desarrollo normal de la próstata y contribuyen a la progresión del cáncer de próstata. La unión de los andrógenos a la AR promueve un cambio conformacional que conduce en última instancia a su translocación al núcleo y regulación de la transcripción de un conjunto específico de genes sensibles a andrógenos. La evidencia clínica y experimental sugieren que la progresión del cáncer de próstata se produce a través de la alteración de la señalización de andrógenos normal, reduciendo la especificidad o la cantidad de ligando requerida para AR proliferación y la supervivencia [1]. Es importante destacar que, los resultados recientes indican que la función de la AR es específica de la etapa de la enfermedad, lo que provocó un programa de expresión génica en diferentes dependiente de andrógenos en comparación con el cáncer de próstata independiente de andrógenos [2]. Si bien el papel de eje en la regulación transcripcional de señalización AR está bien documentada, se sabe muy poco acerca de su papel en la iniciación de la traducción propuesta en los primeros estudios [3], [4].
La proteína transmembrana con factor de crecimiento epidérmico y dos motivos folistatinas 2 (TMEFF2) es una sola proteína pase transmembrana. TMEFF2 se expresa en el embrión [5], [6] y de forma selectiva en el cerebro adulto y de próstata [7] - [9]. Un papel para TMEFF2 en el cáncer de próstata fue sugerida por estudios que indican que la expresión de TMEFF2 se altera en una fracción significativa de los tumores de próstata primarios y metastásicos [5] - [10]. Además, hemos demostrado que la TMEFF2 interactúa con deshidrogenasa sarcosina (SARDH), la enzima responsable de la conversión de la sarcosina a glicina [11]. Es importante destacar que la sarcosina se identificó como un marcador para la progresión del cáncer de próstata en una pantalla a gran escala de metabolitos a partir de muestras de próstata humanos [12]. El aumento de los niveles en plasma y orina de sarcosina distinguir el cáncer de próstata a partir de tejido benigno de la próstata, y se elevan aún más en el cáncer metastásico. Además, se demostró que el metabolismo de sarcosina y las enzimas que intervienen en ella (es decir SARDH) para actuar como reguladores de la invasión de células y la metástasis [12]. Por lo tanto, la interacción de TMEFF2 con SARDH sugiere además un papel para TMEFF2 en la progresión del cáncer de próstata. De hecho, también hemos establecido que las funciones TMEFF2 de longitud completa como un supresor de tumores y que este rol se correlaciona, al menos en parte, con su capacidad de interactuar con SARDH y modular los niveles celulares de sarcosina [11].
En este estudio se reporta que la traducción de
TMEFF2
está regulada por andrógenos, y este efecto requiere un AR funcional. Resultados utilizando modelos de xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata establecido que la expresión de TMEFF2 cambia en respuesta a los andrógenos y /o la condición dependiente de andrógenos o -independiente de las células [8], [10]. Como se ha demostrado por Gery et al., [8] estos cambios son, en parte, debido a la activación transcripcional de
tmeff2
en respuesta a los andrógenos. Sin embargo, el aumento de los niveles de proteína TMEFF2 en ausencia de un aumento correspondiente en los niveles de mRNA se han observado después de la adición de los andrógenos a animales castrados que llevan xenoinjertos de CWR22, lo que sugiere que
TMEFF2
también puede ser post-transcripcionalmente regulados [10].
El
TMEFF2
ARNm tiene varias fases de lectura abierta aguas arriba potenciales (uORFs) en su región líder, y el análisis de la secuencia sugiere que están bien conservadas entre los mamíferos. Aunque sólo está presente en el 5-10% de los ARNm celulares, uORFs son comunes en las regiones líder de los ARNm que codifican las oncoproteínas o proteínas implicadas en el control del crecimiento celular y la diferenciación, y funcionan mediante la modulación de la traducción de estos genes esenciales [13]. Después de ser traducido, uORFs generalmente bloquean la traducción de la principal región de codificación aguas abajo al dificultar el reinicio de la traducción en el codón de iniciación de la traducción principal. Sin embargo, uORFs pueden promover la traducción selectiva de la región codificante aguas abajo bajo estrés celular u otras condiciones que aumentan la fosforilación de la subunidad α de la eucariótica factor de iniciación de la traducción 2 (eIF2α) [13].
eIF2 en su GTP se requiere forma ligada para la selección del codón de iniciación de la traducción. La fosforilación de la subunidad α de eIF2 a Ser-51 (eIF2α-P) inhibe el intercambio de eIF2-PIB a eIF2-GTP, impidiendo el reconocimiento del codón de iniciación y la disminución de iniciación de la traducción mundial [14]. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los ARNm que contienen uORF-se traducen activamente en estas condiciones. Se han propuesto dos mecanismos para explicar este efecto. En el primero, ejemplificado por la
ATF4
mRNA que contiene dos uORFs, el reinicio de la traducción en el uORF aguas abajo inhibidor se pasa por alto en condiciones de eIF2α-P, debido al hecho de que los niveles más bajos de eIF2-GTP aumento el tiempo requerido para los ribosomas de escaneo para volver a adquirir eIF2-GTP y resaltar la traducción [15]. En el segundo, observado en mRNAs que contienen un único uORF, ribosomas de escaneo evitan el uORF inhibidora debido a la reducción de la eficiencia de la traducción en los codones de iniciación con un pobre secuencia de consenso Kozak [16]. En ambos casos, los resultados de derivación uORF en un mayor número de ribosomas a partir de la traducción en el codón de iniciación de la secuencia codificante principal, lo que aumenta la síntesis de esa proteína específica.
En este estudio, hemos demostrado que
TMEFF2
traducción está regulada por andrógenos. Andrógeno-regulación de los
TMEFF2
traducción requiere la presencia de los uORFs en la región líder de la
TMEFF2
ARNm y depende de eIF2α-P. Además, este efecto es mediado por la AR, puesto que no se observa cuando los niveles de AR se reducen por RNAi o la bicalutamida antagonista de AR, o en líneas de células que no lo expresan. Estos resultados apoyan un mecanismo de regulación de la señalización de andrógenos novela en la que los ARNm que contienen uORF se activan en traslación en respuesta a eIF2α-P.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
LNCaP y 22Rv1 células se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de FBS (Gemini Bio-productos) o 10% tratado con carbón vegetal en suero (Atlanta Biologicals). células PC3 (ATCC) se obtuvieron del Dr. D. Terrian (Universidad de Carolina del Este) y también se mantuvieron en RPMI 1640. ratón fibroblastos de embriones que expresan el tipo salvaje y mutante (Ser51 a Ala) eIF2 se obtuvieron del Dr. R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute) y se han descrito anteriormente [17]. Estas células se cultivaron en DMEM. Dihidrotestosterona, bicalutamida, y actinomicina D fueron adquiridos de Sigma-Aldrich.
construcciones y ensayos Reporter
La mutagénesis por PCR se utilizó para mutar los codones de inicio de los uORFs desde AUG a GUG en el
TMEFF2 página 5 'UTR. Los cebadores usados para la mutagénesis se muestran en la tabla 1. Los 5 'UTRs se insertaron aguas arriba de la Gaussia
luciferasa
gen en el vector pCMV-Gluc (New England Biolabs). El su-TMEFF2-myc construcción de fusión se ha descrito previamente (11). Para los análisis de uORF, las células fueron cultivadas a 70-90% de confluencia en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 1,5 g de cada construcción por pocillo y la misma cantidad de la pSEAP-Control Vector II (BD Biosciences). Las células fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y usando 4 l /pocillo de reactivo Lipofectamine. Las células y los sobrenadantes se recogieron 24 horas después de la transfección, y se determinó la actividad de luciferasa de los sobrenadantes utilizando el kit Biolux (New England Biolabs). los niveles de SEAP se midieron utilizando la gran evasión Seap quimioluminiscencia Kit 2.0 (Clontech Laboratories). Para ambos ensayos, se detectó la luminiscencia usando un
n 20/20 luminómetro (Turner Biosystems).
Para los ensayos de reportero de DHT estimulada, las células fueron hormona de hambre durante 48 horas en rojo-fenol medio libre que contiene 10% de suero tratado con carbón vegetal (CSS) antes de la estimulación con DHT. Veinticuatro horas después de la eliminación de la hormona se transfectaron las células usando el reactivo de transfección Fugene HD (Promega) siguiendo las recomendaciones del fabricante. En resumen, 10 g de cada constructo y 10 g de pSEAP2 se diluyeron en RPMI libre de suero junto con 30 l Fugene HD reactivo para un volumen total de 500 l. se añadieron 100 l de esta mezcla de transfección por pocillo de una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, se añadieron DHT o vehículo de etanol al fresco CSS-RPMI y se incubaron las células durante otras 48 horas antes de la recolección de las células y los sobrenadantes. Para medir los niveles de ARNm de luciferasa Gaussia, se aisló ARN de las células usando el kit RNAqueous (Ambion), siguiendo el protocolo suministrado. a continuación, se sintetizó ADNc utilizando el kit de iScript (BioRad Laboratories), y los niveles de mRNA de luciferasa se midieron mediante qRT-PCR utilizando IQ SYBR Green Supermix y el Sistema IQ5 Real-Time PCR de detección (BioRad Laboratories). los niveles de mRNA de luciferasa se normalizaron a beta-
actina
y la expresión génica se analizó usando IQ5 software del sistema óptico (BioRad Laboratories). En la tabla 1 primers utilizados para la QRT-PCR.
DHT Estimulación El curso temporal
Las células fueron hormona de hambre en medio libre de fenol rojo que contiene 10% de CSS durante la noche antes de la estimulación con 10 nM DHT o el control DMSO. Actinomicina D se utilizó a una concentración de 5 nM. Se aisló ARN de células usando el Kit RNeasy (Qiagen) y se sintetizó ADNc utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen).
TMEFF2
niveles de mensaje se midieron mediante amplificación por QRT-PCR utilizando TaqMan
TMEFF2
cebadores (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), y normalizado a
niveles de GAPDH
mensaje (amplificado con Hs99999905_m1, Applied Biosystems).
receptor de andrógenos Derribo
AR expresión se redujo en 22Rv1 células por medio de la en-blanco más piscina de SMART para la AR humana (Thermo Scientific). No la orientación siRNA se incluyó como un control. Brevemente, 5 l de ARN de silenciamiento y 7,5 l de reactivo de transfección DharmaFECT (Thermo Scientific) fueron diluidos cada uno por separado en el suero libre de 300 l, fenol RPMI sin rojo. Después de 5 min de incubación, las soluciones se combinaron y se incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente, después se añadieron a una monocapa de células confluentes 85% en un T-25 matraz que contiene 2,4 ml de RPMI completo fenol, libre de rojo.
Immunoblotting
Los lisados celulares se prepararon con radioinmunoprecipitación de ensayo (RIPA) buffer [25 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS] complementado con 0,1 mM β-glicerofosfato y cóctel mM ortovanadato de sodio 0,5 y inhibidor de la proteasa (Sigma). Veinte g de los lisados se separaron en geles de TGX Mini-proteicas (BioRad) y se transfirió a membranas de PVDF. Estos fueron bloqueados durante 30 min en 5% NFDM diluido en TBS-T y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Las incubaciones con una dilución 1:10,000 de anticuerpo secundario conjugado con HRP (Santa Cruz Biotechnology) eran durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección se llevó a cabo utilizando SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific) durante 5 min. En algunos casos, las transferencias fueron despojados con Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los anticuerpos contra TMEFF2, PSA, y eIF2α-P (Ser51) eran de Abcam, eIF2α y anticuerpos CREB2 /ATF4 fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, y P-eIF2α (Ser51) anticuerpos eran de Señalización Celular Tecnología.
Análisis polisomas
monocapas celulares se lavaron una vez con PBS frío 1X y se rasparon con tampón de lisis [100 mmol /L de KCl, 10 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 0,5% de NP40, 5 mmol /L MgCl
2, 100 mg /ml de cicloheximida], y se incubaron en hielo durante 10 minutos, seguido de un centrifugado 5 min a 10.000 rpm a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. las concentraciones de proteína iguales de extractos citoplasmáticos (1,8 mg) fueron entonces superpuestos en un gradiente de sacarosa lineal [15-45% (w /v) 10 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 100 mmol /L KCl, 5 mmol /L MgCl
2] y se centrifugó a 35.000 rpm durante 2 horas a 4 ° C en un rotor SW41-Ti sin el freno. El uso de una de ISCO UA-6, las fracciones se recogieron con el monitoreo UV continua a 254 nm. Se aisló ARN a partir de fracciones usando el reactivo Trizol (Ambion). Veinticinco microgramos de ARN se utilizaron para la síntesis de cDNA utilizando un kit de iScript (BioRad Laboratories). Una muestra de 0,1 g de cada preparación de cDNA se utilizó para amplificar
TMEFF2
,
ATF4
, y
β-actina
por PCR usando el sistema de Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad ( Invitrogen). Productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% y se analizaron utilizando el programa NIH Image J dominio público (desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud y disponible en Internet, en http://rsb.info.nih.gov/nih- imagen /).
inmunofluorescencia
Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células /pocillo en Lab-Tek 8 se desliza bien en la recámara (Nalge Nunc Internacional) y se incubaron durante la noche en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO
2. Las células se lavaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, se lavaron en PBS y se permeabilizaron con 0,1% Triton-X100 en PBS y se bloquearon con 5% de suero normal de cabra en 0,1% PBST. Las muestras se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos primarios indicados. Se añadieron los anticuerpos secundarios correspondientes a una 1:500 dilución en 5% de suero de cabra en PBS-T (0,1% de Tween 20): de cabra anti-IgG de conejo-AF488 (Invitrogen) y de cabra anti-IgG de ratón-AF488 (Invitrogen). Las células se lavaron 3 veces en PBS-T (0,1% de Tween 20). Los portaobjetos se secó por aire y montado en medio que contiene DAPI.
Fraccionamiento subcelular
Los extractos de las células cultivadas en presencia de 10 nM de DHT, o DMSO como control, se fraccionaron en citosólica, membranosa, fracciones nucleares y citoesqueleto utilizando el kit de extracción subcelular Proteoma (Calbiochem).
Análisis estadístico
los datos se expresan como media ± desviación estándar. Las diferencias fueron analizados utilizando pares, pruebas t de dos colas. Los valores de p ≤ 0,05 (*) o ≤0.01 (**) se consideraron significativos.
Resultados
El
TMEFF2
5'-UTR contiene varios uORFs que bloquean la traducción de la proteína TMEFF2
el 5 'UTR del
TMEFF2
ARNm contiene varios uORFs potenciales (Figura 1) que, si se traduce potencialmente bloquear la traducción del
TMEFF2
codificación principal secuencia, y por lo tanto contribuir a la regulación de los
TMEFF2
expresión. Para investigar el papel de los uORFs en la regulación de la expresión de proteínas TMEFF2, nos preguntamos si el bloqueo de la traducción de los uORFs afectaría traducción de la proteína TMEFF2 en líneas celulares de cáncer de próstata humano. Un TMEFF2-luciferasa Gaussia (gluc) reportero se ha generado para este fin mediante la clonación del
TMEFF2
5'-UTR, incluyendo cuatro uORFs, aguas arriba de las secuencias (gluc-gluc pTM1234; Figura 1B). El
TMEFF2 sobre Fusion -Gluc se colocó bajo el control del promotor CMV. La contribución de regulación de los uORFs a
TMEFF2
traducción se evaluó mediante la mutación de los codones de inicio (AUG) de los cuatro uORFs potenciales (AUG a GUG, la Figura 1B) y la determinación de su efecto sobre la expresión gluc en el dependiente de andrógenos línea celular de cáncer de próstata LNCaP y su línea celular derivada C4-2B independiente de andrógenos óseo metastásico. Se observó un aumento de seis a siete veces en la expresión de luciferasa cuando los AUGs de los cuatro uORFs fueron mutados (pTMXXXX-Gluc; Figura 1C). mutaciones individuales en los AUGs de la segunda, tercera o cuarta uORFs promovido un aumento de 3-4 veces en la expresión gluc, mientras que la mutación de AUG de la primera uORF tuvo un efecto muy pequeño, lo que sugiere un papel mínimo, en su caso, en la regulación de TMEFF2 expresión. En consecuencia, las mutaciones combinadas de uORFs 2, 3, y 4 resultaron en un aumento de cinco a seis veces en la expresión de la luciferasa del reportero, similar a la observada cuando las cuatro uORFs fueron mutados (Figura 1C). Se obtuvieron resultados similares en otras líneas celulares de cáncer sensible a los andrógenos (22Rv1) y -independiente (PC3) de la próstata. La mutación de los uORFs produjo un aumento de la expresión de luciferasa del reportero gluc, aunque a veces de inducción variable (Figura 1D). En las construcciones utilizadas para estos experimentos, la expresión del gen de fusión fue dirigida por el promotor CMV, y la actividad de la luciferasa se normalizó a los niveles de mRNA. En conjunto, estos resultados sugieren que los uORFs en el 5'-UTR de
TMEFF2
función ARNm sinérgicamente para reprimir la traducción de los principales ORF aguas abajo.
A) Representación esquemática de 394 nt aguas arriba de la
TMEFF2
principal región codificante y la localización relativa de cuatro uORFs potenciales (aa = amino ácidos) dentro de la 5'-UTR. B) Representación esquemática del reportero TMEFF2-Gaussia luciferasa y constructos mutantes. La X indica la mutación del agosto a un GUG para prevenir la traducción de los uORFs mutados. se introdujeron mutaciones únicas y múltiples. la actividad de luciferasa C) demostrado por el pTM1234-Gluc y las diferentes construcciones mutantes en células LNCaP y C4-2. La actividad de luciferasa D) demuestra la pTM1234-Gluc y la construcción con todas las uORFs mutados (pTMXXXX-Gluc) en PC3 y las células 22Rv1. En C) y D) se midió la actividad luciferasa en el sobrenadante y calcula primero la normalización de los niveles de ARNm para cada construcción y luego a la actividad de la luciferasa se demuestra por el constructo reportero pTM1234-Gluc, que no tiene mutaciones en los uORFs, considerado arbitrariamente como 1. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos dos experimentos independientes con múltiples repeticiones. *,
p Hotel & lt; 0,05 y **,
p
. & Lt; 0,01
La traducción de un reportero de luciferasa-TMEFF2 está regulada por andrógenos a través de una mecanismo que requiere la presencia de los uORFs en el Líder Región ARNm
la transcripción del
tmeff2
gen está regulada por andrógenos [8]. Sin embargo, se ha sugerido que los andrógenos también afectan a
TMEFF2
expresión a nivel post-transcripcional [10], nos impulsa a examinar si
TMEFF2
traducción se vio afectada por los andrógenos. Se seleccionaron 22Rv1 células para estos experimentos ya que: i) se ha demostrado ser un valioso modelo para ensayos de gen reportero AR mediada [18], ii) demostraron el aumento más alto veces en la luciferasa expresión del gen indicador cuando se mutaron los uORFs ( véase la Figura 1D), y iii) que expresan niveles detectables de proteína TMEFF2 endógeno. 22Rv1 células fueron transfectadas con el reportero pTM1234-Gluc, cultivadas en medio libre de fenol complementado con rojo tratado con carbón vegetal (CS) FBS - para eliminar Hormonas esteroides y se trataron con diferentes concentraciones de dihidrotestosterona (DHT). La actividad de luciferasa se midió a partir de los sobrenadantes y se normalizaron a los niveles de mRNA. La adición de DHT aumento de la expresión de luciferasa de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A), lo que indica que los andrógenos estimulan la traducción de la ORF principal. Es importante destacar que se observó este efecto en las concentraciones de DHT en los niveles fisiológicos que se encuentran en suero humano [19]. La actividad de luciferasa de las células que llevan el constructo indicador pTMXXXX-Gluc, en el que se mutaron los AUGs de los cuatro uORFs, no cambió en respuesta a DHT, aunque, como se esperaba, fue mucho más alta (Figura 2A). Estos resultados indican que la traducción de la ORF principal aguas abajo de la
TMEFF2
5'-UTR está regulada por andrógenos en una forma dependiente de uORF.
A) actividad de luciferasa se demuestra por la pTM1234-Gluc y el mutante pTMXXXX-Gluc construir en 22Rv1 células en presencia de diferentes concentraciones de DHT. B) La actividad de luciferasa se demuestra por la pTM1234-Gluc construir en 22Rv1 células en presencia de diferentes concentraciones de DHT y DHT 20 M bicalutamida (BIC), un agonista de AR. C) La actividad de luciferasa se demuestra por la pTM1234-Gluc constructo en células PC3 en presencia de diferentes concentraciones de DHT. Para todos estos experimentos células fueron hormona de hambre en medio libre de fenol rojo que contenía suero despojado de carbón. La actividad de luciferasa se normalizó a los niveles de ARNm para cada constructo y luego a la actividad de la luciferasa se demuestra por cada una de las construcciones expresadas en las células cultivadas en ausencia de DHT, que se establece en 1. Los datos mostrados son la media ± S. D. de al menos tres experimentos independientes con múltiples repeticiones. *,
p Hotel & lt; 0,05 y **,
p
. & Lt; 0,01
Para determinar si el efecto de DHT en la traducción está mediada por la AR , los experimentos descritos anteriormente se repitieron en presencia de bicalutamida para bloquear la activación AR. La adición de este fármaco reduce la inducción mediada por DHT de la expresión del indicador de luciferasa pTM1234-Gluc a los niveles basales cerca de, aunque una pequeña de dos a tres veces de inducción se puede observar en 10 nM DHT (Figura 2B). Estos resultados indican que el efecto de la DHT en la traducción del constructo reportero requiere señalización AR. De acuerdo con estos resultados, no observamos traducción inducida por DHT del reportero pTM1234-gluc en células de cáncer de próstata PC3 que no expresan la AR (Figura 2C). En conjunto, estos resultados indican que la traducción inducida por DHT de
TMEFF2
requiere la activación de la AR y está mediada por los uORFs en la región líder del ARNm.
La traducción de la proteína endógena es TMEFF2 regulada por andrógenos
también se analizaron los cambios en la expresión de la proteína TMEFF2 endógena en respuesta a los andrógenos. Para este propósito, las células fueron cultivadas en 22Rv1 fenol medio libre de rojo suplementado con CS-FBS tratado con diferentes concentraciones de DHT, y los lisados se analizaron para la expresión de TMEFF2 por Western Blot. En ausencia de andrógenos, la expresión de TMEFF2 era apenas detectable. Sin embargo, la adición de DHT aumento de la expresión TMEFF2 (Figura 3A), y dio como resultado los niveles más altos dentro de la gama de concentraciones de DHT fisiológicas. expresión inducida por DHT de TMEFF2 endógeno también se observó en las células LNCaP de cáncer de próstata sensibles a andrógenos (Figura 3A). La expresión de andrógenos específico de la próstata (PSA), un objetivo de AR utilizado como control para la actividad transcripcional de andrógenos, se ha mejorado por la adición de DHT (Figura 3A). El tratamiento de las células con bicalutamida expresión inducida por DHT TMEFF2 y PSA notablemente inhibido que sólo se observó en las más altas concentraciones de DHT (Figura 3A). La inhibición de la expresión inducida por DHT TMEFF2 también se logró después de eliminar a la expresión de la AR usando siRNA (Figura 3B). En conjunto, estos resultados indican que la expresión de la proteína TMEFF2 endógeno está regulada por la señalización de AR.
A) transferencias de Western representativas que indican un aumento en la expresión de TMEFF2 en respuesta a la adición DHT en las células LNCaP y 22Rv1 (α = anticuerpo ). La adición simultánea de 20 M bicalutamida a 22Rv1 células (panel central) impidió el aumento de la expresión de TMEFF2 observado a una concentración fisiológica de DHT. PSA se utilizó como control positivo, ya que su expresión es inducida por andrógenos de una manera AR-dependiente. β-tubulina se utilizó como control de carga. B) Western blot que indica golpe eficaz hacia abajo de las dos formas de la AR en las células 22Rv1 utilizando siRNA (derecha). Representante de transferencia Western que indica que la adición de DHT no tiene ningún efecto sobre la expresión de TMEFF2 en células en las que los niveles de AR se redujeron en RNAi. PSA se utilizó como control y, como se esperaba, su expresión no se vio afectada por la DHT en las células AR-siRNA tratados. β-tubulina se utilizó como control de carga. C) Los cambios en
TMEFF2
niveles de mRNA en LNCaP líneas celulares y 22Rv1 en respuesta a DHT, según lo determinado por QRT-PCR. Los valores se normalizaron a beta-tubulina mRNA. Cada experimento se repitió al menos tres veces y, para las imágenes representativas presentadas, las membranas fueron despojados y re-probaron con los diferentes anticuerpos o las mismas muestras fueron re-correr en un gel diferente. β-tubulina se utilizó como control de carga cada vez que se realizaron las muestras.
Hemos observado un aumento en
TMEFF2
niveles de mRNA en respuesta a DHT, según lo determinado por QRT-PCR ( Figura 3C), coherente con un informe anterior que indicaba que los andrógenos estimulan
tmeff2
transcripción [8]. Sin embargo, el aumento modesto en los niveles de ARNm no probable explicar el aumento mediado por DHT observado en la expresión de proteínas. Para descartar la posibilidad de que el aumento de la proteína TMEFF2 endógena observado en respuesta a DHT era únicamente debido a aumento de la transcripción, se utilizó actinomicina D para bloquear la transcripción y evaluaron los niveles de la proteína TMEFF2 y mRNA en 22Rv1 células en diferentes puntos de tiempo después de la adición de DHT, para inducir
tmeff2
expresión, y /o los niveles de proteína actinomicina D. TMEFF2 aumentaron dramáticamente 60-120 minutos después de la adición de DHT, pero no DMSO, el control del vehículo (Figura 4A). Es importante destacar que, en presencia de actinomicina D, la adición de DHT todavía promovido un aumento de la expresión de la proteína TMEFF2, aunque a un nivel inferior que el observado en ausencia del inhibidor de la transcripción. Como se indica por el análisis de la
TMEFF2
los niveles de mRNA de QRT-PCR, la adición de actinomicina D inhibe basal y DHT inducida
tmeff2
transcripción (Figura 4B). La adición de DHT solo promovió un incremento inicial ligero en la transcripción (1,2 veces después de 20 minutos) que se redujo progresivamente a los niveles basales después de 60 min de tratamiento (no mostrado). Por lo tanto, estos resultados revelan que los andrógenos regulan no sólo la transcripción de la
tmeff2
gen sino también la traducción de la endógena
TMEFF2
mRNA, apoyando los resultados presentados anteriormente, usando un reportero de luciferasa-TMEFF2.
a) de transferencia de Western que demuestra la Representante proteína TMEFF2 en los puntos de tiempo indicados después de la adición de 10 nM de DHT en la presencia o ausencia de 5 nM actinomicina D (Act D) para bloquear la transcripción. DMSO o DHT y actinomicina D se añadieron simultáneamente. La cuantificación de las manchas se presenta a continuación la transferencia de western. Las intensidades de las bandas de las muestras tratadas con DHT se normalizaron primero a ß-tubulina y luego a los valores obtenidos para las muestras de DMSO en los puntos temporales correspondientes. B) Los cambios en
TMEFF2
niveles de mRNA en 22Rv1 células en respuesta a DHT o DMSO y actinomicina D del tratamiento según lo medido por QRT-PCR. Los valores se normalizaron a
GAPDH
. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
Otras proteínas que incluyen β-catenina y ocludina trasladar al núcleo o regiones de contacto celular después del tratamiento con andrógenos. Sin embargo, nuestros resultados indican que el tratamiento con andrógenos no alteró la localización subcelular de TMEFF2 (Figura S1).
andrógenos de señalización promueve la fosforilación eIF2α
La fosforilación de eIF2α reduce traducción global, sino que también proporciona un mecanismo que aumenta selectivamente la traducción de mRNAs uORF que contienen [13], [20]. Por lo tanto, la hipótesis de que la DHT promueve endógena de
TMEFF2
traducción a través de la fosforilación de eIF2α. El efecto de la DHT en la fosforilación eIF2α se examinó mediante análisis de transferencia Western en el cáncer de próstata y 22Rv1 células PC3 cultivadas en medio libre de fenol rojo suplementado con CS-FBS y se trata con diferentes concentraciones de DHT. Los niveles elevados de eIF2α-P fueron claramente detectados, de una manera dependiente de la dosis, en lisados de células 22Rv1 DHT tratadas pero no en lisados de células PC3 AR-nulo DHT tratados (Figura 5A), lo que indica que los andrógenos promueven eIF2α-P y que este efecto es dependiente de la presencia de un AR funcional. De acuerdo con estos resultados, el tratamiento previo de las células con el 22Rv1 bicalutamida antagonista de AR impedido aumentos mediados por DHT en eIF2α fosforilación (Figura 5B). Además DHT también promovió un aumento en la expresión de la proteína ATF4, un factor de transcripción regulado por eIF2α fosforilación (Figura 5A)
.
A) transferencias de Western representativas que indican un aumento en eIF2α-P en respuesta a la adición DHT en 22Rv1 células. Este efecto fue abrogada en las células PC3, que no expresan AR (derecha). los niveles de proteína ATF4 se midieron como un control positivo, ya que es inducida por eIF2α-P. β-actina se utilizó como control de carga. B) Adición de 20 M bicalutamida a 22Rv1 células impidió el aumento de la eIF2α-P observó después de la adición de DHT.