Biológica
Extracto
La evidencia acumulada indica que numerosos microRNAs están involucrados en la carcinogénesis y la progresión del cáncer gástrico, mientras que la significación clínica de microARN-214 en el cáncer gástrico es poco conocida y la función exacta de microARN-214 en el cáncer gástrico sigue siendo oscuro. En el presente estudio, los niveles de expresión de microARN-214 en 80 tejidos gástricos de carcinoma, 18 tejidos gástricos nontumourous, y 4 tipos de líneas celulares de cáncer gástrico se cuantificaron mediante transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), y la relación entre la expresión de microARN-214 y las características cliniopathological incluyendo el pronóstico fue explorado. Para investigar el papel potencial de microARN-214 en el comportamiento biológico celular de cáncer gástrico, se realizaron ensayos de proliferación celular, apoptosis, migración e invasión en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico y una línea celular inmortalizada gástrica
in vitro
. Nuestros resultados mostraron que microRNA-214 se downregulated dramáticamente en los tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares de cáncer gástrico, en comparación con los tejidos gástricos nontumourous. Se observó la regulación por disminución gradual de la expresión de microARN-214 entre la mucosa gástrica nontumourous, nonmetastasis tejidos de cáncer gástrico y metástasis tejidos de cáncer gástrico. La expresión de microARN-214 fue significativamente inversamente correlacionado con la metástasis de los ganglios linfáticos y el tamaño del tumor, pero no tuvo correlación con el pronóstico del paciente. La expresión ectópica de microARN-214 podría inhibir la migración celular y la capacidad de invasión de las células del cáncer gástrico SGC7901 y MKN45. Y desmontables de microRNA-214 facilita significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión de una manera específica de la célula en MKN28, BGC823 y las células GES-1. Factor estimulante de colonias 1 (CSF1) se identificó como un gen diana de microRNA-214. En resumen, nuestros datos demuestran que el microARN-214 es un nuevo biomarcador prometedor para metástasis en los ganglios linfáticos en pacientes con cáncer gástrico. Y se identificó que la regulación negativa de microARN-214 puede regular la proliferación, la invasión y la migración de células de cáncer gástrico atacando directamente a CSF1
Visto:. Wang YW, Shi DB, Chen X, C Gao, Gao P (2014 ) Significado clínico-patológico de microARN-214 en el cáncer gástrico y su efecto sobre la célula biológica Comportamiento. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 25 de abril, 2013; Aceptado: 11 Febrero 2014; Publicado: 10 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172351 y 81372856). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de los estudios considerables en la génesis tumoral y la progresión de GC, la patogénesis de esta compleja enfermedad es poco conocida. Por lo tanto, es de valor clínico vital para identificar y caracterizar el mecanismo molecular preciso que participan en el desarrollo y progresión del carcinoma gástrico.
Aparte de la alteración genética y epigenética convencional de oncogenes codificantes de proteínas y genes supresores de tumores en la carcinogénesis de GC, los ARN codificante no proteicos, especialmente los microARN (miARN), han surgido como un nuevo jugador para arrojar luz sobre el mecanismo del desarrollo GC [2]. MiRNAs son endógenos 19-25 nt ARN no codificantes que regulan negativamente la expresión de la proteína mediante la promoción de la degradación del ARNm o la represión de la traducción de proteínas, a través de la interacción con la 3'-UTR del ARNm diana. se ha informado de un número creciente de miRNAs para participar en la carcinogénesis y el desarrollo de los cánceres humanos, incluyendo GC [2] - [4]. Estos miRNAs son generalmente dysregulated y la función o bien como supresores de tumores u oncogenes en la iniciación y progresión de carcinomas humanos. Por ejemplo, Tsukamoto et al. han demostrado que el miR-375 es downregulated en el carcinoma gástrico y ejerce su efecto proapoptótico a través de la regulación negativa de PDK1, una quinasa que fosforila Akt, ya su vez, suprime la vía PI3K /Akt [5]. Mientras que miR-21 se ha encontrado que la promoción de la proliferación tumoral y la invasión en GC regulando negativamente importantes supresores de tumores tales como PTEN, PDCD4, y RECK, y luego conferir células GC con el aumento de la invasividad y la capacidad de evitar la anoikis [6] - [8 ]. Anteriormente, hemos encontrado que miR-145 se downregulated en células de cáncer humano del colector y suprimió la cascada de la invasión de metástasis en GC mediante la inhibición de la traducción de proteínas N-cadherina [9], [10].
En la actualidad, la importancia clínica de microARN-214 (miR-214) en el pronóstico de los pacientes con GC no es muy conocida, y el papel exacto de miR-214 en GC sigue sin estar clara. A continuación, se investigó la asociación entre la expresión de miR-214 y cliniopathological parámetros, así como se evaluó el efecto de miR-214 en los comportamientos biológicos incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión de las células GC.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
Las muestras de tejido se prepararon de una manera similar como se describe anteriormente [9]. En resumen, 80 muestras (de 65 varones, 15 mujeres; 58,3 ± 17,49 y 61,5 ± 9,162 años de edad, respectivamente) de los tejidos GC fueron obtenidas de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Hospital Qi Lu, de la Universidad de Shandong de 2004 a 2006. mucosa gástrica Nontumourous más de 3 cm de distancia de los tumores fueron seleccionados al azar de 18 de estos pacientes y se utilizaron como controles. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento preoperatorio, como la radioterapia o la quimioterapia. Las muestras fueron mecanografiados histológicamente según Lauren y la Organización Mundial de la Salud (OMS) 's clasificaciones (IARC Press, Lyon, 2000), y se clasifican de acuerdo con la UICC 2002 clasificación TNM.
Declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong, Shandong, china (código de aprobación: 201 101 015). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en nuestro estudio.
Cultivo de células
Hay cuatro tipos de líneas celulares humanas GC se obtuvieron de la American Type Culture Collection (MKN28 y MKN45, Manassas, VA , EE.UU.) y el Instituto de Shanghai cáncer (BGC823 y SGC7901, Shanghai, china). La línea de la mucosa gástrica inmortalizada de células epiteliales GES-1 se obtuvo de Pekín ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China). Las células se mantuvieron en RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en un incubador de células humidificado con una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C.
Mirna extracción
el uso de un kit de miRNeasy FFPE (Bioteke, Pekín, china), aislamos miARN de tejidos embebidos en parafina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total de líneas de células se extrajo usando el reactivo Trizol (Takara, Dalian, China) siguiendo el protocolo del fabricante. La calidad y cantidad de las muestras de ARN fueron evaluados por métodos espectrofotométricos estándar (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se diluyeron a 2 ng /l para el análisis de RT-qPCR
Transcripción reversa seguida de tiempo real. reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR)
miRNA niveles de expresión se cuantificaron utilizando un kit de SYBR Primescript miARN RT PCR (Takara, Dalian, china) según las instrucciones del fabricante con un real Bio-Rad CFX 96 ™ C1000 -Tiempo sistema. Brevemente, las muestras de ARN se convierten a ADNc mediante un solo paso Primescript miRNAcDNA Síntesis Kit (Takara, Dalian, China), seguido por el tiempo real qPCR y normalizado utilizando U6 ARN pequeño nuclear (RNU6B) por la 2
-ΔCT Método. Los cebadores para el miR-214 y U6 eran de GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Todas las reacciones se realizaron por duplicado.
transfección celular
células en crecimiento exponencial (1,5 × 10
5) se sembraron en placas de 12 pocillos 12 h antes de la transfección y se transfectaron con 30 nM precursor de miR-214 (miR-214), anti-miR-214 inhibidor (miR-214 inhibidor), o el control negativo (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) utilizando el reactivo de transfección X-tremeGENE (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La eficacia de transfección se controló mediante RT-qPCR en 24, 48, y 72 h después de la transfección.
Para la expresión estable de miR-214, las células SGC7901 y MKN45 fueron transfectadas con lentivirus miR-214 que expresan vector LV3-hsa -miR-214 o un control negativo LV3NC, que tiene GFP como una proteína de marcador, de acuerdo con el protocolo del fabricante (GenePharma, Shanghai, china). Tres días después de la transfección, la expresión de la proteína GFP se monitorizó con un microscopio de fluorescencia. Las células transfectadas se seleccionaron con puromicina (1,5 mg /ml) para los que expresan de forma estable el miR-214.
La proliferación celular ensayo
Después de la transfección, se tripsinizaron las células, se contaron y se sembraron en 96 -Bueno placas a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo. Y a continuación, la proliferación celular se midió utilizando el ensayo de proliferación EdU como se informó anteriormente [11]. En resumen, 24 h después de la transfección, las células se cultivaron por triplicado a 5 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos el día antes de la incubación EdU (Ribobio, Guangzhou, China). Después del marcaje EdU, las células fueron tratadas con 100 l de 1 × Apolo cóctel de reacción, se tiñeron con 100 l de Hoechst 33342 (5 mg /ml) y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón). El porcentaje de células positivas EdU se define como la tasa de proliferación. Los datos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes y se presentan como media ± desviación estándar (SD).
apoptosis de las células de ensayo
Tres días después de la transfección de miR-214 precursor o inhibidor, se recogieron las células y se tiñeron usando el kit de Anexina V-FITC /PI apoptosis Detección (BestBio, Shanghai, china) como se describe anteriormente [12]. En breve, las células se tripsinizaron, recogieron y luego teñidas utilizando el Annexin V-FITC /PI Kit de detección de apoptosis siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la incubación con anexina V-FITC y PI, las células apoptóticas se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. Early se definieron células apoptóticas como la población que era PI negativo y Anexina V-FITC positivo, mientras que las células apoptóticas estaban tarde PI positivo y Anexina V-FITC positivo. La tasa de apoptosis total se calcula como la tasa de apoptosis temprana, más la tasa de apoptosis tardía. Anexina V-PE /7-AAD Kit de Detección de Apoptosis (keygen, Nanjing, China) se utilizó para el ensayo de apoptosis de células transfectadas de vector de lentivirus, similar a los protocolos anteriores. Cada experimento se realizó por triplicado, y los datos se presentan como medias ± SD.
La migración celular y la invasión ensayos
Se llevaron a cabo los ensayos de migración celular y la invasión como se describe anteriormente [13]. ensayo de migración se llevó a cabo con Transwell inserta con 8,0 mm de tamaño de poro de la membrana (formato de 24 pocillos, Corning, Nueva York, EE.UU.). Para medir la capacidad de invasión de las células de GC, los insertos previamente mencionados fueron pre-recubiertas con matriz de Matrigel (BD Ciencia, Sparks, MD, EE.UU.). Las células (1 × 10
5) se resuspendieron en medio libre de suero y se sembraron a la cámara superior. Las cámaras inferiores se rellenaron con medio de cultivo completo que contiene 10% de SFB. Después de incubación a 37 ° C durante 24 h, se fijaron las células migradas presentes en el lado inferior de la membrana, se tiñeron y se contaron. Cada experimento se realizó por triplicado.
se realizaron el ensayo de luciferasa
ensayos de luciferasa Dual-como [9] se describe anteriormente. Los fragmentos 3'-UTR del gen CSF1 que contiene el sitio de unión de miR-214 se amplificó por PCR a partir de ARN de células MKN45 usando los cebadores de la Tabla S1, y se insertaron en el sitio Xba1 de pmirGLO miRNA vector de expresión diana (Promega, San Lius Obispo, CA, EE.UU.). El vector resultante se denominó pmirGLO-CSF1. Para el ensayo de informador de luciferasa, MKN45 y BGC823 células se sembraron en una placa de 12 pocillos el día antes de la transfección. Las células fueron co-transfectadas con 30 nM de miR-214 precursor o inhibidor de miR-214, el control negativo y 30 ng pmirGLO-CSF1 usando el reactivo de transfección X-tremeGENE (Roche Applied Science). Después de 48 h de la transfección, se midió la actividad luciferasa utilizando el sistema dual de luciferasa de ensayo (Promega) y se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. Cada experimento se realizó por triplicado.
Western blot
A las 48 h después de la transfección con miR-214 precursor o inhibidor, las células se sometieron a análisis de transferencia Western como se describe anteriormente [19]. Brevemente, la proteína se extrajo a partir de células o tejidos. Los lisados se resolvieron mediante electroforesis, se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se transfirieron con anticuerpos contra CSF1 (1:1000, Epitomics) o β-actina (1:1000, Santa). Los datos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. Se realizaron
El análisis estadístico
Los análisis utilizando el paquete estadístico de software Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Las diferencias se analizaron con el de Student
t-test
entre dos grupos o con un modelo lineal entre los tres grupos. La correlación entre la expresión de miR-214 y el tamaño del tumor primario en el GC se calculó la correlación de Spearman. En la curva de supervivencia, los datos se analizaron mediante la prueba de log-rank. Para determinar en qué medida la expresión de miR-214 podría separar de manera eficiente diferentes subsettings clínicos, se construyó utilizando un análisis de característica (ROC) y el área bajo la curva (AUC) se calculó para evaluar la capacidad de miR-214 expresión de diferenciar entre los casos de cáncer y casos nontumourous, y para distinguir los tejidos metastásicos y no metastásicos tejidos.
P
-valores inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
miR-214 es downregulated en los tejidos de carcinoma gástrico y cuatro líneas celulares de GC, en comparación con la mucosa gástrica nontumourous
en comparación con 18 muestras de mucosa gástrica nontumourous, miR-214 se downregulated significativamente (aproximadamente seis veces) en 80 muestras de tejidos gástricos primarios (Figura 1A,
P
= 0,0001). El receptor curvas características de funcionamiento (ROC) de miR-214 refleja una fuerte separación entre los tejidos y los tejidos GC nontumourous, con un área bajo la curva (AUC) de 0,7764 (Figura S1 A, 95% intervalo de confianza (IC), 0,6466 a 0,9062). Por ello, la regulación a la baja de miR-214 fue validado en cuatro líneas de células gástricas. Como se muestra en la Figura 1C, el nivel de expresión de miR-214 en las líneas celulares GC MKN28, BGC823, MKN45, y SGC7901 marcadamente fue atenuada en comparación con 18 muestras de tejido gástrico nontumourous (
P
& lt; 0,05).
(a) en comparación con el 18 por mucosa gástrica nontumourous, miR-214 fue significativamente downregulated en 80 tejidos gástricos primarios (
P
= 0,0001). la expresión de miR-214 fue de correo es menor en los tejidos gástricos primarios con metástasis (metástasis) que los tejidos gástricos primarios sin metástasis (Nonmetastais). (B) Los tejidos gástricos primarios se dividieron en un grupo de bajo metástasis y un grupo de alto metástasis de acuerdo con el número de metástasis en los ganglios linfáticos. (El punto de corte se estableció como seis, que es un umbral para distinguir N0~N1 y N2~N3 en la etapa TNM (UICC, 2002). MiR-214 se redujo drásticamente en el grupo de alta metástasis en comparación con el grupo de bajo metástasis (
P = 0,0455
). (C) miR-214 regulación a la baja fue validado en cuatro líneas de células gástricas. en comparación con la línea celular bien moderadamente diferenciado MKN28, miR-214 se atenuó notablemente en mal línea de célula diferenciada MKN45 y BGC823, y moderadamente deficiente línea celular SGC7901 diferenciados y altamente metastásico. Sin embargo, se detectó una menor expresión de miR-214 en GES-1, una línea de células epiteliales gástricas inmortalizado, en comparación con cuatro células de cáncer gástrico (
*
P
& lt;.. 0,05) D) Asociación (entre la expresión de miR-214 y el tamaño del tumor en GC primaria se calculó la correlación de Spearman Nuestros datos sugieren que el miR-214 expresión se correlaciona inversamente con el tamaño del tumor (Spearman r = -0.2673,
P = 0,0083
).
Sin embargo, se han detectado aún más baja expresión de miR-214 en GES-1, una línea de células epiteliales gástricas inmortalizada, que en cuatro líneas de células GC (Figura 1C ,
P Hotel & lt; 0,05). Especulamos la discordancia puede ser debido al menos en parte a la diferencia entre muestras clínicas y líneas celulares, debido a que una línea de células, aislada de un paciente con una determinada enfermedad, representa la firma miARN expresión de sólo una muestra clínica y cambios de mayo durante celular cultura
in vitro
; en otras palabras, las muestras de tejido son mucho más como el contexto humano de líneas celulares. De este modo, se comenta que el miR-214 expresión en tejidos humanos GC es más representativa y creíble que la encontrada en las líneas celulares.
Disminución de la expresión de miR-214 en GC se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos y el tamaño del tumor, pero no tiene correlación con el pronóstico del paciente
Para determinar las posibles implicaciones clínico-patológicas de la expresión de miR-214 modificado, se combinaron los resultados qPCR y los parámetros clínicos. Las correlaciones entre el nivel de expresión de miR-214 y las características clinicopatológicas de GC se resumen en la Tabla 1. miR-214 expresión se correlaciona inversamente con el tamaño del tumor (Tabla 1,
t-test
,
P
= 0,0265; Figura 1D, Spearman r = -0.2673,
P = 0,0083
) y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 1, Figure1A,
t-test
,
P =
0,0164). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en otras características clínico-patológicas tales como el género, la metástasis distal, clasificación histológica de la OMS, y el tipo histológico de Lauren entre estos dos grupos.
Curiosamente, encontramos la regulación por disminución gradual de miR-214 entre mucosa gástrica nontumourous, nonmetastasis tejidos, y tejidos de metástasis (Figura 1A, un modelo lineal,
P = 0,0006)
. Para evaluar la expresión de miR-214 en GC como un nuevo biomarcador para la metástasis de los ganglios linfáticos, se establecieron curvas ROC. Hemos observado claras separaciones entre los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos y los que no tienen metástasis en los ganglios linfáticos, con una AUC de 0,5880 (Figura S1B, IC del 95%, 0,4526 a 0,7166). Los tejidos gástricos primarios se dividieron en un grupo de bajo metástasis y un grupo de alto metástasis de acuerdo con el número de ganglios linfáticos metástasis (MNV): bajo la metástasis se definió como casos con menos de seis MNV, y los casos con más de seis LNM fueron considerados como de alta metástasis. Como era de esperar, la expresión de miR-214 se redujo drásticamente en el grupo de alto metástasis en comparación con el grupo de baja metástasis (Figura 1B,
P = 0,045
).
De acuerdo con la muestra de tejido datos que indican la correlación entre la expresión de miR-214 y MNV, se encontró que, en comparación con la línea celular moderadamente bien diferenciado MKN28, miR-214 expresión era marcadamente menor en las líneas de células poco diferenciadas MKN45 y BGC823, y especialmente la línea celular metastásico SGC7901 [14] (
P Hotel & lt; 0,05)
sin embargo, nuestros datos demostraron ninguna diferencia significativa de la expresión de miR-214 en 18 muestras de tejido gástrico primario y la metástasis sus loci secundaria (Figura 1B. ,
P = 0,2676
). Estos resultados sugieren que la regulación a la baja de la expresión de miR-214 se produjo en la etapa temprana de desarrollo MNV y se mantuvo estable sin mayor atenuación en la última etapa de la metástasis.
Para estudiar más a fondo el efecto de miR-214 en el pronóstico de pacientes, se analizaron los niveles de expresión de miR-214 en los casos con diferentes condiciones de estado de recaída y supervivencia. Sin embargo, nuestros datos muestran que no hubo diferencias pronunciadas entre el grupo de recaída y el grupo sin recaída, o entre el grupo supervivencia y el grupo de la muerte (Figura 2A-B,
t-test
,
P
& gt; 0,05). De la nota, se dividió a los pacientes en grupos de alta expresión y de bajo de expresión basados en el nivel medio de expresión de miR-214, y Kaplan-Meier de supervivencia no mostró correlación significativa entre el miR-214 expresión y la supervivencia libre de recaída (Figura 2C , razón de riesgo (HR) de 1,23, 95% intervalo de confianza (IC) del 0,6596 a 2,285;
P = 0,5781
) o la supervivencia general (Figura 2D, HR 1,20, IC del 95%: 0,6667 a 2,151;
P
= 0,5832) en los pacientes con GC
.
() las muestras de tejido a se dividieron en un grupo de liberación y un grupo nonrelease de acuerdo con la evolución de los pacientes. Nuestros datos no mostraron diferencias significativas en la expresión de miR-214 entre estos dos grupos (
P Hotel & gt; 0,05). (B) como en (a), excepto las muestras clínicas fueron clasificados como grupo supervivencia y el grupo de la muerte (
P Hotel & gt; 0,05). (C, D) Dividimos a los pacientes en grupos de alto y bajo de expresión de expresión basados en el nivel medio de expresión de miR-214. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier no mostró correlación significativa entre la expresión de miR-214 y la supervivencia libre de recaída (razón de riesgo (HR) de 1,23, 95% intervalo de confianza (IC) del 0.6596, 2.285;
P = 0,5781
) o global la supervivencia (HR 1,20, IC del 95%: 0.6667, 2.151;
P = 0,5832
), aunque hubo una tendencia a que la alta expresión de miR-214 se asoció con la supervivencia libre de recidiva más corto (mediana de supervivencia: 28,00 meses frente a 74,50 meses, de alta expresión y baja expresión, respectivamente) o la supervivencia general (mediana de supervivencia: 40.00. meses frente a 47,50 meses, de alta expresión y baja expresión, respectivamente) guía empresas
Efecto de miR-214 en células proliferación de células GC
Para controlar la eficiencia de la transfección, se determinó la expresión de miR-214 por RT-qPCR a las 24, 48 y 72 h después de la transfección en el precursor de miR-214 o inhibidor células transfectadas y continuamente detectan miR 214 expresión de vectores de lentivirus células tratadas durante 4 semanas. Como era de esperar, la transfección del precursor de miR-214 resultó eficaz en importantes sobreexpresión de miR-214 (Figura S2A-B,
P Hotel & lt; 0,05) y el inhibidor de miR-214 reduce notablemente el miR-214 expresión en miR 214 células transfectadas con inhibidor de que los grupos negativos (Figura S3E-F, figura S4 A,
P Hotel & lt; 0,05). Además, encontramos que las células transfectadas con el vector de lentivirus LV3-HSA-miR-214 podría dar lugar a un cambio de 7 a 96 veces mayor de miR-214 expresión en SGC7901 y MKN45 células (Figura S3 A-D,
P
& lt; 0,05), con un 80% de células -90% expresan la proteína GFP marcador (Figura S3 a, B)
para determinar si el miR-214 podría afectar a la proliferación de las células de GC, se utilizó el ensayo de proliferación de EdU. detectar la capacidad de crecimiento de las células. Nuestros datos muestran que la sobreexpresión de miR-214 con vectores lentiviurs o miR-214 precursor de no influir en el crecimiento de células de SGC7901 (Figura 3A-B, Figura S2C-D, P & gt; 0,05) y líneas celulares MKN45 (Figura S2E-F, figura S5A-B, P & gt; 0,05). Sin embargo, se encontró que downregualtion de miR-214 podría promover la proliferación de BGC823 (Figura 3C-D,
P = 0,0010
) y GES-1 (Figura S4B-C,
P =
0,0474), pero no MKN28 línea celular (Figura S5C-D,
P = 0,0938
), en una celda de manera específica.
(a, C) fotografías representativas después de la transfección con lentivirus MIR -214-vector de expresión en células SGC7901 e inhibidor de miR-214 en células BGC823 (magnificación × 100). (B, D) El porcentaje de células positivas edu, calculados por células marcadas-EDU (rojo) en comparación con el número total de número de células (Hoechst-manchada, azul), se define como la tasa de proliferación. Los datos mostraron ninguna diferencia significativa de la tasa de proliferación entre el grupo-miR-214 transfectadas con LV3-HSA y el grupo de control negativo en SGC7901 células (
P Hotel & gt; 0,05). Si bien hemos encontrado que el miR-214 transfección inhibidor podría dar lugar a una capacidad de proliferación de aumentar notablemente BGC823 células (
P = 0,0010)
.
Papel de miR-214 en la migración celular y la invasión de las células GC
a medida que el miR-214 expresión se asoció inversamente con metástasis en los ganglios linfáticos, estábamos particularmente interesados en la capacidad de miR-214 a afectar la migración celular y la invasión. Nuestros resultados indican que las células SGC7901 y MKN45 transfectadas con LV3-hsa-miR-214 mostró una significativa disminución de la migración y capacidad de invasión, en comparación con el LV3NC células tratadas (Figura 4A-B, la Figura S6A-B,
P
& lt; 0,05). Y se observó que downregualtion de miR-214 podría facilitar la migración y la invasión de MKN28 (Figura 4C-D,
P = 0,0491
y
P = 0,0127
, respectivamente). Aunque desmontables de miR-214 no afectó a la migración de las células GES-1 (Figura S4D-E,
P = 0,0879
), el silenciamiento de miR-214 conducido a un aumento de más del 40% en las propiedades invasivas de estas células (
P = 0,0046
). Sin embargo, nuestros datos muestran que la transfección de miR-214 precursor no tuvo un efecto robusto sobre la migración celular y la invasión en SGC7901 (Figura S2G-H,
P Hotel & gt; 0,05) y MKN45 (Figura S2I-J,
P Hotel & gt;. 0.05) las células, en comparación con los respectivos controles negativos
(a, C) imágenes representativas de los ensayos de migración e invasión en células SGC7901 y MKN28 (magnificación × 200) se muestran . (B, D) Las células migraron fueron contados por la elección de cinco campos de cada cámara de forma aleatoria y calcular el promedio. Nuestros resultados mostraron que LV3-HSA-miR-214 transfección notablemente a disminuir la capacidad de migración e invasión de SGC7901 (
P = 0,0143
y 0,0210, respectivamente). Mientras desmontables de miR-214 con el inhibidor de miR-214 promueve la migración celular (
P = 0,0491
) y la invasión (
P = 0,0127
) en células MKN28.
Influencia de miR-214 en la apoptosis celular de las células GC
Para examinar el efecto de miR-214 en la apoptosis de las células, se realizaron ensayos de apoptosis utilizando el método de Anexina V-FITC /PI tinción. Nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión (miR-214 precursor y vector lentivirus) y desmontables de miR-214 no podrían afectar a la apoptosis de células obviamente en comparación con los controles negativos en cuatro líneas celulares de GC (Figura 5, Figura S2K-N,
P
& gt; 0,05) y la línea celular inmortalizada gástrico GES-1 (datos no presentados). De hecho, encontramos una tendencia de la capacidad pro-apoptosis de miR-214 en la línea celular precursora MKN45 (Figura S2M-N,
P = 0,0606
), sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa.
(a, C, e, G) Las células se marcaron con anexina V-PE /7-AAD o Anexina V-FITC /PI, y se analizaron por citometría de flujo. Todas estas cifras son representativos de tres ensayos independientes. estadísticas del cuadrante: necrosis o mecánicamente lesionadas-células en la parte superior izquierda (UL), las células de la apoptosis finales de los años en la parte superior derecha (UR), las células viables en la izquierda inferior (LL) y las células de la apoptosis en los primeros inferior derecha (LR). (B, D, F, H) El porcentaje de células de la apoptosis temprana, las células de la apoptosis finales y el total de células de la apoptosis se compararon respectivamente entre LV3hsa-miR-214 grupo transfectadas y el grupo NC, o entre el miR 214-grupo inhibidor transfectadas e inhibidor NC grupo. Nuestros datos demostraron que LV3-hsa-miR-214 o miR-214 inhibidor no tiene ningún efecto sobre la apoptosis de células en SGC7901, MKN45, MKN28 y BGC823 células (
P
& gt; 0,05). Aunque se observó una tendencia a la capacidad de pro-apoptosis de miR-214 en la línea celular MKN45, sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (
P = 0,0950
).
MIR 214 dirige directamente y regula a la baja CSF1 en células de cáncer gástrico
para identificar los objetivos de miR-214, hemos utilizado el algoritmo TargetScan para predecir miR-214 objetivos en el cáncer gástrico humano. Entre los numerosos candidatos posibles, escogimos los sobreexpresados en el cáncer y proliferation- y genes asociados a metástasis, incluyendo NOTCH2, FGFR1, CSF1 (Figura 6A), AGAP2, CREB1, para su posterior análisis. Nuestros resultados mostraron que miR-214 precursor transfección redujo significativamente la actividad de un gen informador de luciferasa fusionado a la CSF1 3'-UTR, con 29,60% y la reducción de 30,61%, en comparación con los grupos de control negativo (Figura 6B,
P
= 0,0227 y 0,0093, respectivamente, para las líneas celulares MKN45 y BGC823). Mientras que cuando se transfectó inhibidor de miR-214, la actividad luciferasa se incrementó en un 34.49% y 42.25% en MKN45 y BGC823 células en comparación con los controles (Figura 6C,
P = 0,0115
y 0,0085, respectivamente).
(A) las secuencias complementarias de la CSF1 mRNA 3'-UTR se muestran con la secuencia de miR-214. (B) La actividad de luciferasa en MKN45 y BGC823 células transfectadas con el miR-214 y pmirGLO-CSF1 fue significativamente fallecidos en comparación con los controles negativos (
P = 0,0227
y 0.0093, respectivamente). (C) Después de inhibidor de miR-214 se transfectó, la actividad luciferasa se incrementó dramáticamente en MKN45 y BGC823 células en comparación con los controles (
P = 0,0115
y 0,0085, respectivamente). (D) El efecto de miR-214 en los niveles de Csf1 se probaron en los lisados celulares GC por Western blot. (MI). Nuestros datos muestran que la expresión CSF1 relación fue significativamente menor en las células transfectadas con miR-214 precrusor en comparación con las células transfectadas con el control negativo (
P
= 0,0037 y 0,0066, respectivamente).
Se determinó además la expresión de la proteína CSF1 por Western blot en células transfectadas con GC miR-214 precursor o inhibidor. En consonancia con los resultados de la luciferasa, la expresión de la proteína CSF1 se redujo significativamente en las células SGC7901 y MKN45 (Figura 6D-E,
P
= 0,0037 y 0,0066, respectivamente) transfectadas con miR-214 precursor y un aumento en MKN28 y BGC823 células (Figura S7A-B,
P
= 0,0049 y 0,0416, respectivamente) transfectadas con inhibidor de miR-214, en comparación con los controles respectivos. Estos datos sugirieron que el miR-214 inhibe la traducción CSF1 en células de cáncer gástrico.
Discusión
Nuevas pruebas ha puesto de relieve el impacto crucial de la desregulación de los genes miARN en la génesis tumoral de los carcinomas humanos [3], [4] . MIRNA desregulación promueve la proliferación celular, confiere resistencia a la apoptosis, y mejora la capacidad de invasión y la metástasis, a través de la represión de los supresores de tumores aguas abajo o inducir la acumulación de oncogenes diana, y por lo tanto está implicado en la iniciación, progresión y metástasis de tumores humanos.
Entre la plétora de miRNAs, la desregulación de miR-214 se encontró en un montón de cánceres humanos [15] - [22]. Regulación a la baja de miR-214 en el cáncer cervical ha sido reportado por varios grupos, y miR-214 se ha demostrado que inhibe el crecimiento, la migración y la invasión de células de cáncer cervical por oncogenes dirigidos MEK3, JNK1, Plexin-B1, y GALNT7 [15 ] - [17]. Ueda et al. [28].