Extracto
Antecedentes
Varios estudios anteriores han identificado una fuerte asociación entre la infiltración de células T y el resultado clínico en cáncer de ovarios. El papel de las células B sigue siendo controvertido, sin embargo.
Métodos
Se evaluaron Cuarenta y nueve muestras de epiplón incluidas en parafina procedentes de pacientes con cáncer de ovario epitelial de alto grado. Se realizaron análisis inmunohistoquímicos para caracterizar la expresión de CD19
+ células B y pSTAT3 tan alta (& gt; 50% de células con tinción positiva [PSC]) o bajas (& lt; 50% PSC). Se utilizó el método de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank para determinar la asociación entre los parámetros clínico-patológicas y la supervivencia global (SG). Una multivariable de Cox análisis de regresión de riesgos proporcionales incluyendo la naturaleza de la citorreducción (primaria
vs
secundaria), la histología, el grado del tumor, la recepción de la quimioterapia previa, se realizó la infiltración de células B y la expresión pSTAT3.
resultados
la mediana de SG fue de 160,6 meses en aquellos pacientes con baja expresión de células B
vs
47,3 meses en los pacientes con la expresión de células B de alta (P = 0,0015). Del mismo modo, la mediana de SG fue mejorado en aquellos pacientes con baja expresión pSTAT3 (160,6
vs
47,9 meses, p = 0,02). En un modelo multivariado para predecir la supervivencia, se retuvieron sólo el grado de infiltración de células B y el estadio clínico. pSTAT3 expresión no entró en el modelo final, posiblemente sea debido a una alta correlación positiva con la infiltración de células B (r = 0,82, p & lt; 0,0001)
Conclusiones
El aumento de la infiltración de células B. y la expresión pSTAT3 en el tejido omental se asocia con una peor supervivencia
Visto:. Yang C, Lee H, V Jove, Deng J, Zhang W, X Liu, et al. (2013) Significado pronóstico de células B y pSTAT3 en pacientes con cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (1): e54029. doi: 10.1371 /journal.pone.0054029
Editor: Goli Samimi, Kinghorn Centro del Cáncer, Instituto Garvan de Investigación Médica, Australia |
Recibido: 1 de octubre de 2012; Aceptó 7 de diciembre de 2012; Publicado: 10 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Dra. Los esfuerzos de Pal son apoyados por los Institutos nacionales de Salud K12 2K12CA001727-16A1. los esfuerzos del Dr. Yu son apoyados por el NIH U54 CA163117, NIH R01 CA122976-01, NIH P50 CA107399 y el Fondo de Markel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Un cuerpo acumulación de literatura apoya el papel de las células inmunes en la proliferación del cáncer de ovario. En 2003, Zhang
et al
informó de un estudio pionero en el que se evaluó el tejido de 186 pacientes para el grado de CD3
+ células T infiltrantes de tumor. [1] Se encontró que la presencia de estas células para predecir la recurrencia independientemente retrasado y prolongación de la supervivencia, con una gran magnitud del efecto. Varios otros estudios han arrojado a la misma conclusión, resumido recientemente en un meta-análisis de Hwang
et al.
[2] Con una experiencia acumulada de 1.815 pacientes en 10 estudios, se demostró que la falta de tumor- la infiltración de linfocitos (TIL) se asoció con una peor supervivencia (riesgo relativo [RR] 2,24; IC del 95%: 1,71 a 2,91). En estos estudios, los TIL se caracteriza por la expresión de CD3 y /o CD8. [1], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] Las correlaciones observadas entre la infiltración de células T y el resultado clínico es un biológicamente plausible uno -. específicamente, CD8
+ células T pueden causar un efecto antitumoral directo citolítica
Con una mayor comprensión de la biología de las células T, se ha hecho evidente que ciertos subconjuntos de T- las células de hecho pueden tener un efecto procáncer. Específicamente, Barnett
et al
han evaluado el grado de infiltración de regulación de células T (Treg) en una serie de 232 muestras de cáncer de ovario seroso primarios. [12] En esta serie, el grado de infiltración de Treg se asoció con un mayor grado de cáncer y el estadio clínico avanzado. Corroborar estos datos, las evaluaciones de sangre periférica de pacientes con cáncer de ovario sugieren y el aumento de número de células T reguladoras que circula acompaña progresión de la enfermedad. [13]
El papel de las células B en el cáncer de ovario es más difícil de discernir. [14] En los primeros estudios con modelos murinos de la deficiencia de células B, se sugirió que las células B pueden inhibir realmente el efecto antitumoral de tumor infiltrante linfocitos T. [15], [16] Como un mecanismo potencial, las células B se han demostrado para inhibir el efecto inductor de CD4
+ células T CD8 en
+ T-células. [17] A pesar de estas observaciones, la evidencia clínica apunta a un vínculo entre CD20
+ infiltrantes de tumores de células B y un resultado favorable en el contexto de cáncer de ovario. En concreto, Milne
et al
examinado los microarrays de tejidos (TMA) los datos derivados de 199 pacientes con cáncer epitelial de ovario seroso de alto grado (EOC). [18] En este informe, la presencia de CD20 + células intraepitelial se asoció con una mejoría en la supervivencia específica de la enfermedad (DSS). Sin embargo, es importante señalar que este informe se acompaña de otras observaciones paradójicas - por ejemplo, la presencia de FoxP3
+ células T reguladoras (Tregs) fueron también asociado con un DSS favorable. Este hallazgo contradice la preponderancia de evidencia que sugiere que las células T reguladoras puede tener un efecto pro-cáncer.
Es evidente que la relación entre las células B y las órdenes de evaluación de resultados clínicos más. En el manuscrito actual, evaluamos el grado de infiltración de células B en el tejido omental derivados de los pacientes con cáncer de ovario, y el intento de correlacionar el grado de infiltración con la supervivencia global (SG). Hemos demostrado previamente que el transductor de señal fosforilada y activador de la transcripción-3 (pSTAT3) desempeña un papel crítico en la inflamación y la progresión tumoral relacionada con el cáncer a través del reclutamiento de células mieloides y células T reguladoras. [19], [20] Más recientemente, se ha demostrado un papel fundamental de STAT3 en la promoción de células B mediada por la angiogénesis tumoral en modelos de ratones (datos no publicados). Con este fin, hemos explorado aún más la asociación de entre pSTAT3 y la infiltración de células B.
Métodos
Declaración de Ética
Los datos clínicos y patológicos evaluados en este estudio fueron convertidos en datos anónimos, y la investigación sobre las muestras clínicas fue aprobado por la Ciudad de la esperanza IRB (IRB COH 10072).
Población de estudio
la ciudad de la esperanza de muestras biológicas repositorio (COHBR) alberga tejido derivado de todos los procedimientos quirúrgicos realizado en la institución. A través de un protocolo aprobado por el IRB, se obtuvieron secciones en parafina de tejido omental de pacientes que poseían un diagnóstico de EOC de alto grado (es decir, de grado 2 ó 3) y tenía citorreducción primaria o secundaria se realiza en la institución. Los especímenes fueron derivados de los procedimientos realizados entre enero de 2000 y diciembre de 2009 de reducción de volumen, y muestra suficiente tenía que estar disponible para generar un total de 12 diapositivas no teñidas (4 micras de espesor). Para los pacientes que recibieron citorreducción primaria, el uso o no uso de (es decir, neoadyuvante) quimioterapia previa se caracterizó. Para los pacientes que recibieron citorreducción secundaria, el uso de la quimioterapia previa incluía quimioterapia adyuvante rindió después de la citorreducción primaria. La supervivencia se caracteriza desde el momento del diagnóstico de cáncer de ovario (importante, no desde el momento de la cirugía de reducción de volumen primario o secundario).
Los análisis de tejidos
tejido diapositivas de parafina con parafina se haya revocado de-xileno, re-hidratado a través de alcoholes graduados, y posteriormente en autoclave en Antigen Solución desenmascaramiento (vector Laboratories). Para la tinción de IF, secciones de tejido se incubaron con anticuerpo primario en una dilución de 1:50. Los portaobjetos se incubaron entonces en el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Las imágenes fueron tomadas por microscopía confocal utilizando CLSM 510 Meta microscopio confocal (Zeiss). Para la tinción IHC, secciones de tejido se trataron con 1% H
2O
2 en metanol durante 10 min a temperatura ambiente, y después se incubaron durante una hora en PBS que contenía 10% de suero de cabra (Sigma). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Después de la incubación con anticuerpos secundarios biotinilados, método de detección ABC /DAB se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories). Las secciones de tejido se contratiñeron posteriormente con hematoxilina durante 30 seg. El nivel de expresión de anticuerpo primario en los tejidos tumorales se visualizó mediante un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U (4 × aumento del objetivo) y fotografiado usando el software SPOT. Los anticuerpos primarios utilizados son anti-pY705-STAT3 (Señalización Celular) y anti-CD19, un marcador de células B humanas (ABD Serotec). En todos los casos, diez campos microscópicos con un mínimo de 1.000 células fueron contados por cada diapositiva para la puntuación. anotando resultado de secciones de tejido teñidas con IHC se ve confirmado por tinción SI en una sección consecutiva.
Análisis estadístico
A escala semi-cuantitativa se utilizó para evaluar el grado de CD19 y tinción pSTAT3. En concreto, se consideraron aquellas muestras con un 50% de células con tinción positiva (o mayor) "alta", y esos especímenes con menos fueron considerados "baja". Estas puntuaciones fueron asignados por forma independiente por dos investigadores (C. Y. y H. L.), y anota discrepantes fueron entonces arbitrados para producir una asignación uniforme. El método de Kaplan-Meier se utilizó para comparar la supervivencia en cohortes definidas por (1) citorreducción primaria o secundaria, (2) la tinción de células B (alta
vs
bajo), (3) tinción pSTAT3 (alta
vs
baja), y una combinación de estos parámetros. Se realizó un análisis de Cox de riesgos proporcionales de regresión multivariable para investigar si las células-B o pSTAT3 tinción proporciona poder predictivo adicional en la supervivencia más allá de la naturaleza de la citorreducción (primaria
vs
secundaria), la histología (seroso, mucinoso, endometrioide o
vs
de células claras o indiferenciado), el grado del tumor (2
vs página 3), o quimioterapia previa (sí
vs
no). Todos los análisis estadísticos realizados con el paquete R (disponible en http://www.r-project.org/).
Resultados
Características de los pacientes
Desde el COHBR, se identificaron un total de 110 especímenes patológicos, producido a partir de citorreducción cirugías de cáncer de ovario. De ellos, un total de 29 muestras representado histologías no pertinentes para el estudio actual (es decir, tumores de bajo potencial maligno tumores, carcinosarcoma, o células germinales). De los 81 casos restantes, 17 especímenes representado tumores de grado 1, y 15 muestras no tienen suficiente tejido omental para los análisis propuestos, dado como resultado un total de 49 muestras para el estudio actual. La edad media de los pacientes representados con la cohorte actual fue de 61 años (rango, 41-87), y la mayoría de los pacientes se caracteriza por tener seroso, endometrioide o la histología mucinosa (47 de 49, o 96%). Dieciocho pacientes (37%) tenían enfermedad de grado 2, mientras que 31 pacientes (63%) tenían enfermedad de grado 3. La mayoría de los especímenes se derivaron de cirugías primarias debulking (30 de 49, o 61%), y el resto, de reducción de volumen secundario. La mayoría de los pacientes que habían sido sometidos a citorreducción primaria habían recibido ningún tratamiento sistémico previo (3%), mientras que la mayoría de los pacientes que se habían sometido a cirugía citorreductora secundaria habían recibido quimioterapia (89%). La Tabla 1 presenta las características clínicas y patológicas subdividen el grado de expresión de células B. No se observaron diferencias significativas entre los grupos, con la excepción de la extensión de la tinción de pSTAT3 - específicamente, la preponderancia de los pacientes con tinción alta de células B también demostró alta tinción pSTAT3, mientras que aquellos con tinción bajo de células B demostraron bajo tinción pSTAT3 (P & lt; 0,0001). Ejemplos de la infiltración de células B de bajo y alto y expresión pSTAT3 se muestran en la Figura 1A. Por otra parte, se encontró que las células B y las células pSTAT3-positivas en la misma zona de tejido omental de pacientes (Figura 1B).
(A) tinción de inmunofluorescencia seguido de la microscopía confocal que muestra ejemplos de muestras representativas de un paciente con baja la infiltración de células B y la expresión bajo pSTAT3 (arriba a la izquierda ya la derecha), y un paciente por separado con alta infiltración de células B y la expresión de alto pSTAT3 (abajo a la izquierda y la derecha); barras de escala, 20 m. (B) que muestran imágenes IHC células B y células pSTAT3-positivas en la misma zona de los tejidos omental; barras de escala, 200 micras
de células B /Expresión pSTAT3 y el resultado clínico: Análisis univariante.
Teniendo en cuenta la población mixta de pacientes examinados en el estudio actual (es decir, pacientes sometidos a procedimientos citorreductora primaria y secundaria), la SG fue el criterio de valoración principal de examinar. OS media fue de 160,6 meses en los pacientes con baja expresión de células B en comparación con 47,3 meses en los que la expresión de alto de células B (P = 0,0015; Figura 2A). Del mismo modo, la mediana de SG fue mejorado en aquellos pacientes con baja expresión pSTAT3 en comparación con la expresión de alto pSTAT3 (160,6
vs
47,9 meses, p = 0,02; Figura 2B). Aunque hubo una mediana de SG mejorado en aquellos pacientes con enfermedad en estadio I /II
vs
estadio III /IV de la enfermedad (p = 0,001), la naturaleza de la cirugía de reducción de volumen (primaria
vs
secundaria; P = 0,56) y el grado del tumor (es decir, 2
vs página 3;. P = 0,16) no parecen tener un impacto en el resultado clínico (Tabla 2)
curva
de Kaplan-Meier que ilustra la duración de la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario en base a (a) el grado de infiltración de células B (p = 0,0015), el grado (B) de la expresión pSTAT3 (P = 0,02), (C) un sistema de clasificación histológica y (D) el estado de citorreducción .
análisis multivariado
el uso de un análisis multivariable de Cox de riesgos proporcionales de regresión que incorpora el estadio clínico inicial (I-II
vs
III-IV), la naturaleza de reducción de volumen (primaria
vs
secundaria), la histología (seroso, mucinoso, endometrioide o
vs
de células claras o indiferenciado), el grado del tumor (2
vs página 3), quimioterapia previa (sí
vs
no), la expresión de células B (alta
vs
baja) y la expresión pSTAT3 (alta
vs
baja), sólo el grado de B- infiltración de células (razón de riesgo, HR, 2,03; IC del 95%: 0,75 a 5,50) y la etapa (HR, 5,16; IC del 95%: 1,36 a 19,60) se mantuvieron en el modelo multivariado. Teniendo en cuenta esta observación, hemos explorado la correlación entre el escenario y la infiltración de células B y encontramos una correlación moderada (r = 0.38, P & lt; 0,001). pSTAT3 no entró en el modelo final, que puede ser, posiblemente, debido a su alta correlación positiva con la expresión de células B (r = 0,82, p & lt; 0,0001). (Tabla 2)
Discusión
varias observaciones únicas emergen del estudio actual. A mayor grado de infiltración de células B en el tejido omental parece correlacionarse con una peor supervivencia. infiltración de células B se asocia fuertemente con la expresión pSTAT3 en el tejido omental, y de hecho, el aumento de expresión en el tejido omental pSTAT3 también se asocia con una peor supervivencia. En el análisis multivariado, la infiltración de células B entró en el modelo multivariado final junto con el estadio clínico, y se observó una fuerte asociación entre la expresión pSTAT3 y la infiltración de células B.
Como ya se ha señalado, el impacto de la infiltración de células T está relativamente bien documentado en la configuración de cáncer de ovario, ahora se resume en un conjunto de datos meta-analítica. [2] Estos estudios correlativos han despreciado los esfuerzos para emplear la transferencia adoptiva de células T, tanto sola como en combinación con la terapia citotóxica. [21], [22], [23] Los efectos de los subgrupos de células T relevantes, tales como los efectos procáncer de células T reguladoras, también se han discernido. El papel de las células B sigue siendo más controversial - aunque tradicionalmente cree que tienen un efecto antagonista sobre la respuesta citotóxica de las células T, el conjunto de datos mencionado de Milne
et al
sugiere que la infiltración de las células B tumor puede ser un pronóstico positivo marcador. Sin embargo, es importante señalar que nuestro estudio se utilizó un marcador de células B distinto (CD19), y también evaluó un grupo más heterogéneo de los pacientes (pacientes que recibieron citorreducción secundaria y terapia sistémica anterior). Con respecto a esto último, no se encontraron diferencias significativas en el resultado en base a estas características clínicas, y sorprendentemente, la distribución de los biomarcadores no varió en estos subgrupos. Nuestro estudio también evaluó secciones individuales derivados de las muestras incluidas en parafina; en contraste con otros estudios que evalúan las TMA, este enfoque permitió la evaluación de múltiples campos (10 por espécimen) para proporcionar una evaluación más precisa de biomarcadores.
La estrecha asociación entre las células B y pSTAT3 en este estudio apoya datos preclínicos hemos informado anteriormente de delinear el papel de pSTAT3 en el reclutamiento de células inmunes. [24] Nuestros datos preclínicos sugieren también que la abrogación de la actividad STAT3 puede tener un efecto antitumoral, coherente con nuestra observación clínica de que mayor pSTAT3 puede estar asociada con el resultado clínico pobre. [25], [26] En combinación, si estas observaciones clínicas se confirman en serie más grande, esto puede servir como fundamento para perseguir ensayos terapéuticos de antagonistas de STAT3 para apuntar las células B en el cáncer de ovario. Como un ejemplo, hemos desarrollado un siRNA CpG conjugado dirigido a STAT3 en células mieloides y células B. [26] Mientras que la entrega de las terapias basadas en siRNA ha sido un reto formidable, cáncer de ovario puede ser una entidad ideal para acercarse a la enfermedad con estos agentes. La quimioterapia intraperitoneal tiene un beneficio bien establecida la supervivencia en los estudios de fase III, y la entrega intraperitoneal de productos terapéuticos basados en ARN puede eludir ciertos problemas de estabilidad y solubilidad. [27] Además de antagonizar directamente STAT3, un enfoque restos de dirección aguas arriba como JAK2 podrían ser considerados. Varios inhibidores de JAK2 se han desarrollado para el tratamiento de enfermedades mieloproliferativas llevan aberraciones en esta proteína; se ha demostrado que una de estas pequeñas moléculas, AZD1480, tiene un efecto antitumoral en la línea celular de cáncer de ovario MDAH2774. [28], [29].
Varias limitaciones deben ser reconocidas. En primer lugar, nuestro tamaño de la muestra era relativamente pequeña en contraste con otros informes publicados. [1], [30] En segundo lugar, no se evaluó la poblaciones de células T CD8 (es decir,
+ células T y FOXP3
+ células T reguladoras) para confirmar los hallazgos previamente reportados. [30] En tercer lugar, no está claro qué efecto ciertas variables de tratamiento (es decir, quimioterapia previa) pueden haber tenido sobre la célula B o la distribución observada pSTAT3 - esto justifica un mayor estudio en una serie más grande. Por último, nuestro estudio se centra exclusivamente en los marcadores basado en los tejidos. Aunque los marcadores séricos convencionales, tales como la CA-125 han caído en desgracia después de las evaluaciones prospectivos recientes, hay una multitud de nuevos ensayos basados en suero en el horizonte. [31] Por ejemplo, los estudios de perfiles de autoanticuerpos han identificado firmas que difieren entre los pacientes con cáncer de ovario y controles sanos. [32] Será curioso ver si una combinación de los biomarcadores que hemos propuesto en este documento con los demás puede producir herramientas pronósticas personalizadas superiores. A pesar de estas limitaciones, nuestros datos se suma a una muy limitada de la literatura relacionada con el impacto de la infiltración de células B en el resultado clínico en cáncer de ovario avanzado, y proporciona un mecanismo plausible para que esto ocurra (es decir, el reclutamiento de células B a través de STAT3-dependiente vías). Claramente, se necesitan esfuerzos más grandes para validar las observaciones formuladas en el mismo. Con un reparto sombra sobre biomarcadores tradicionales como la CA-125, marcadores inmunológicos tienen grandes promesas en el cáncer de ovario. [33] En vista de una tubería creciente de inhibidores de la vía JAK /STAT, nuestros datos que vinculan la expresión pSTAT3 y la infiltración de células B con el resultado clínico en última instancia, puede soportar una vía terapéutica novedosa para esta enfermedad.