chino
Extracto
obligar a evidencias han sugerido que el grupo de alta movilidad cuadro-1 gen (HMGB1) desempeña un papel crucial en el desarrollo y progresión del cáncer. Este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) en
HMGB1
gen en la supervivencia del cáncer gástrico (CG) de los pacientes. Tres SNPs etiqueta de
HMGB1
gen se seleccionaron y se genotipo utilizando sistema de determinación del genotipo Sequenom IPEX en una cohorte de 1030 pacientes (GC 704 en el conjunto de entrenamiento, en el conjunto de validación 326). Multivariado de riesgos proporcionales de Cox modelo y la curva de Kaplan-Meier se utilizaron para el análisis de pronóstico. genotipos AG /AA de SNP rs1045411 en
HMGB1
gen se asociaron significativamente con una mejor supervivencia global (SG) en un conjunto de 704 pacientes con cáncer gástrico en comparación con los genotipos GG (HR = 0,77 IC del 95%: 0.60-0.97 ,
P = 0,032
). Este efecto pronóstico se verificó en un conjunto de validación independiente y análisis combinado (HR = 0,80 IC del 95%: 0,62 hasta 0,99,
P = 0,046
; HR = 0,78; IC del 95%: 0,55 a 0,98,
P
= 0,043, respectivamente). En el análisis estratificado, el efecto protector de rs1045411 genotipos AG /AA fue más prominente en pacientes con estratos adversa, en comparación con los pacientes con estratos favorable. Por otra parte, se observaron fuertes efectos predictivos conjuntas en el sistema operativo de los pacientes entre los genotipos GC rs1045411 y clasificación de Lauren, la diferenciación, la etapa o la quimioterapia adyuvante. Además, ensayo funcional indicó un efecto significativo de rs1045411 en
HMGB1
expresión. Nuestros resultados sugieren que rs1045411 en
HMGB1
se asocia significativamente con los resultados clínicos de los pacientes chinos GC después de la cirugía, especialmente en los que tienen categoría agresiva, lo que garantiza una mayor validación en otras poblaciones étnicas
Cita.: Bao G, Qu F, Él L, Zhao H, Wang N, Ji G, et al. (2016) Significado pronóstico de la etiqueta SNP rs1045411 en
HMGB1
del cáncer gástrico agresivo en una población china. PLoS ONE 11 (4): e0154378. doi: 10.1371 /journal.pone.0154378
Editor: Qing Yi-Wei, el Instituto del Cáncer de Duke, Estados Unidos |
Recibido: 23 Enero de 2016; Aceptado: 12 Abril de 2016; Publicado: 26 Abril, el año 2016
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
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Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81272201 y N ° 81572916 de GB; Nº 81200330 a NW)
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
. Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común en el mundo, lo que representa aproximadamente el 8% de los nuevos casos de cáncer y el 10% de las muertes por cáncer [1]. De estos casos, 70% ocurrieron en los países en desarrollo, y la mitad del total mundial se produjo en Asia Oriental, principalmente en China [2]. Durante las últimas décadas, a pesar del aumento significativo de la inversión y los avances en el diagnóstico y tratamiento de la GC, la supervivencia global (SG) para GC avanzada sigue siendo pésimo, con una tasa de supervivencia a los 5 años de menos que el 25% [3 ]. En la actualidad, la supervivencia y el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico todavía dependen de la etapa del tumor en el momento del diagnóstico. Sin embargo, debido a las diferencias claramente importantes dentro de la misma etapa, la etapa del tumor por sí sola no es suficiente para predecir el pronóstico de GC [4]. Por lo tanto, para descubrir nuevas firmas moleculares como marcadores pronósticos fiables para la GC es muy importante y exigente. En los últimos años, los estudios se han centrado en la investigación de las variantes genéticas que predisponen al desarrollo y la progresión de GC [5].
cuadro-1 grupo de alta movilidad (HMGB1), un miembro importante del grupo de alta movilidad superfamilia de proteínas, contiene dos dominios de ácido 80-amino de unión a ADN (A-caja y B-box) y una cola carboxilo ácido [6]. Funciona como una proteína estructural de la cromatina dentro del núcleo y una citoquina proinflamatoria extracelularmente. Como una proteína nuclear, HMGB1 se une no específicamente al surco menor del ADN y facilita el montaje de dianas de ADN específicas de sitio [7]. En contraste, las funciones de HMGB1 extracelular como una citoquina que se propaga a respuestas inflamatorias Infección o lesión-suscitó [8]. La constante liberación de HMGB1 de las células tumorales necróticas puede crear un microambiente se asemeja a la inflamación crónica; una condición conocida para contribuir al desarrollo de los tumores malignos epiteliales, especialmente el cáncer asociado a la inflamación [9]. De hecho, numerosos estudios han demostrado previamente la sobre-expresión de la HMGB1 en muchos tipos de cáncer [10-13], incluyendo GC [14]. Además, evidencias convincentes han confirmado además que HMGB1 sobre-expresión está estrechamente relacionada con el desarrollo de tumores por la mediación de la proliferación, invasión y migración de las células del cáncer [15, 16]. Por lo tanto, la HMGB1 puede ser un candidato interesante como marcador pronóstico novela o diana terapéutica para GC.
La acumulación de evidencias han sugerido que los antecedentes genéticos pueden influir en el riesgo y pronóstico de GC [17]. polimorfismo de nucleótido único (SNP) es la variación genética más común, y puede ser los biomarcadores sustitutos prometedores de las bases genéticas de los pacientes para predecir la respuesta terapéutica y el pronóstico [18]. Las variantes genéticas se han identificado en humanos
HMGB1
de genes [19], pero la asociación entre el
HMGB1
polimorfismo del gen y el resultado de supervivencia GC nunca ha sido determinada. Dado el papel crucial de la HMGB1 en el desarrollo y progresión del cáncer, es plausible que los polimorfismos de
HMGB1
puede afectar los resultados clínicos de GC. En esto, se evaluó el efecto de tres SNPs etiqueta en
HMGB1
en los resultados clínicos de los pacientes chinos 1030 GC (704 en el conjunto de entrenamiento, 326 en el conjunto de validación independiente) que recibieron tratamiento de resección radical. Además, el efecto de una etiqueta SNP de referencia definidos en la regulación de la expresión génica se examinó por un
in vitro
ensayo funcional. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio de la asociación entre los polimorfismos de
HMGB1
y el resultado clínico de GC.
Materiales y Métodos
Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Cuarta Universidad médica Militar. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas en la Declaración de Helsinki 1964 y sus modificaciones posteriores, o las normas éticas comparables. El consentimiento informado firmado se obtuvo de cada participante incluidos en el estudio.
Estudio de la población
Un total de 1030 pacientes chinos Han con adenocarcinoma gástrico primario se inscribieron a partir de dos sitios independientes, Tangdu hospital y Xijing el hospital de Enfermedades Digestivas, en Xi'an, china. Todos los casos de CG recibido resección quirúrgica y no tenían historia previa de otros tipos de cáncer o cualquier tratamiento contra el cáncer o la transfusión de sangre preoperatoria plazo de 3 meses antes de la cirugía. No había edad, el sexo o las restricciones estadio de la enfermedad para el caso de la contratación. Entre ellos, los 704 pacientes (Departamento de Cirugía General, Hospital Tangdu, entre julio de 2008 y junio de 2013) se utilizaron como un conjunto de entrenamiento en este estudio. Otro grupo de 326 pacientes (el Hospital Xijing de Enfermedades Digestivas, entre enero de 2008 y diciembre de 2010) se utilizaron como un conjunto de validación independiente. El objetivo fue identificar el valor pronóstico clínicamente significativa de SNPs en
HMGB1
gen del conjunto de entrenamiento y lo probó en el conjunto de validación independiente.
Los datos demográficos y clínicos
los datos demográficos y clínicos fueron recolectados a través de entrevistas en persona en la visita inicial o de seguimiento en las clínicas, registros médicos, o consulta con los médicos que tratan, incluyendo la edad, el sexo, la etnia, la región de residencia, momento del diagnóstico, el tiempo de cirugía y /o quimioterapia adyuvante (ACT), el tiempo de recaída y /o la muerte, el estadio tumoral, clasificación de Lauren, la diferenciación, el tipo histológico, y el protocolo de tratamiento. La información de seguimiento se actualiza en intervalos de 6 meses en el lugar a través de la entrevista, la comunicación telefónica, o la revisión de los registros médicos por especialistas de investigación formados. La última fecha de seguimiento fue junio 2015 y la duración mediana de seguimiento fue de 51 meses (rango 6-89 meses). El porcentaje de pacientes perdidos durante el seguimiento fue del 9,8%. OS se definió como el tiempo desde la cirugía a la muerte-GC específico. RFS (supervivencia libre de recurrencia) se definió como el tiempo desde la cirugía a la fecha de la primera recurrencia o metástasis a distancia de GC. se censuraron los pacientes vivos en el último seguimiento.
Recogida, tratamiento y conservación de muestras
Antes de la cirugía, se recogió sangre venosa de 5 ml cada paciente GC para extraer ADN utilizando el E.Z.N.A. DNA sangre Midi Kit (Bio-Tek Omega, Norcross, GA, EE.UU.). Sesenta tejidos cancerosos gástricas se recogieron de forma simultánea desde el conjunto de validación para los ensayos cuantitativa en tiempo real PCR de transcripción inversa (RT-PCR).
selección SNP y genotipado
La etiqueta SNPs candidato selección de
HMGB1
gen se llevaron a cabo como un procedimiento de dos pasos. En primer lugar, hemos utilizado un conjunto de herramientas de selección SNP basados en la web (http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) para buscar candidatos SNPs de
HMGB1
[20]. Todos los polimorfismos validados en
HMGB1 región
gen, incluyendo 5 kb aguas arriba del primer exón y 5 kb aguas abajo del último exón, se consideraron como candidato SNPs. Los SNPs con una frecuencia menor alelo ≥ 5% en el HapMap CHB (chinos Han en Beijing) la población y un desequilibrio de ligamiento por pares cuadrado coeficiente de correlación (r
2) & gt; 0,8 fueron seleccionados como candidatos SNPs. En segundo lugar, etiqueta SNPs se eligieron a partir de estos SNPs candidatos utilizando la base de datos internacional Proyecto HapMap fase II de la población china (http://www.hapmap.org/, consultado el 18 de noviembre de 2013) y HAPLOVIEW versión 4.2. Finalmente, tres SNPs etiqueta (media r
2 = 0.981) fueron seleccionados: rs1045411 (G & gt; A), rs1412125 (T & gt; C) y rs2249825 (C & gt; G) .Genotyping se llevó a cabo usando el sistema de determinación del genotipo Sequenom IPLEX (Sequenom Inc., San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las personas de laboratorio que llevaron a cabo los ensayos de genotipificación fueron cegados a la información de los pacientes. Los controles internos de calidad y controles negativos se utilizaron para asegurar la precisión de genotipado, y 5 muestras fueron seleccionadas al azar y genotipo por duplicado con 100% de concordancia. tipo de referencia para el genotipado osciló entre 99,3% y 99,7%. La información detallada de SNPs y genotipo resultados fueron listadas en la Tabla S1.
Funcional de ensayo
Los efectos funcionales de rs1045411 etiqueta SNP localizados en el 3'UTR de
HMGB1
gen se investigaron mediante el uso del ensayo indicador de luciferasa. Brevemente, 49 pb de ADN de doble cadena que lleva ya sea el genotipo salvaje o genotipo variante de rs1045411 fue sintetizado y clonado en el vector PMIR-INFORME (Ambion, Austin, Texas, EE.UU.) utilizando enzimas de restricción Spe I y Hind III (Takara, Dalian, China). Todos los constructos se confirmaron por secuenciación de ADN. líneas celulares GC humanos SGC-7901 y la línea celular de riñón embrionario humano HEK-293T, en el que tiene-miR-505 se indentified ser expresado positivamente utilizando el kit TaqMan microARN transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) como anteriormente se describe [21], fueron co-transfectadas con cualquiera de PMIR-rs1045411-A o PMIR-rs1045411-G (200 ng /pocillo) con o sin anti-miR-505 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y el control interno pRLTK plásmido reportero (Promega, Madison, WI, EE.UU.) (20 ng /pocillo) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en una placa de 24 pocillos con 2 × 10
5 células por pocillo. SGC-7901 y las líneas celulares HEK293 se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (CAS) (Shanghai, China), donde se verificaron mediante la detección de micoplasmas, ADN de huellas dactilares, la detección de isoenzimas y detección de vitalidad celular. Un vial congelado de cada línea celular 147, que fue ampliado y se congela cuando se recibe del proveedor de inmediato, fue resucitado y se utiliza para el presente estudio. Después de 48 h, las células se recogieron para determinar la actividad luciferasa utilizando un kit de sistema de ensayo dual reportero de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) con un luminómetro (Tecan, Mannedorf, Suiza). Todas las transfecciones se realizaron por triplicado, y todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.
A fin de evaluar el efecto de los genotipos de SNP rs1045411 etiqueta sobre la expresión de
HMGB1
ARNm, ARN total fue aislado de 60 muestras de tejido GC (30 con el genotipo AA y 30 con los genotipos AG /GG de rs1045411) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, el ADNc se sintetizaron utilizando PrimeScript RT kit de reactivos (Takara, Dalian, China). RT-PCR se realizó con los siguientes
HMGB1
cebadores: adelante, 5'-TAAGAAGCCGAGAGGCAAAA-3 '; revertir, 5'-AGGCCAGGATGTTCTCCTTT- 3 ', y β-actina se utilizó como control interno (cebadores: adelante, 5'-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3'; inverso, 5'-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3 ') [13]. expresión relativa de
HMGB1
niveles de mRNA se determinó utilizando el método de cuantificación relativa y 2 Análisis
-ΔΔCt.
El análisis estadístico
Estadísticas análisis se llevaron a cabo utilizando el IBM software de SPSS Statistics 19.0 (IBM). las variables continuas con distribución normal se expresan como media ± desviación estándar, mientras que las variables continuas distribuidas de manera anormal se expresaron como mediana y rango. χ de Pearson
se utilizó 2-test para poner a prueba las diferencias de las variables categóricas. La diferencia de las variables continuas con distribución normal entre los dos grupos se analizó mediante el uso de Student
t-test
, mientras que se empleó U de Mann-Whitney U test para la comparación de variables continuas distribuidas de manera anormal. Se aplicó multivariante de Cox modelo de regresión de riesgos proporcionales para evaluar el efecto de los SNP y las características de los pacientes en el sistema operativo o RFS. Las razones de riesgo (HR) y 95% de intervalo de confianza (IC) se calcularon con ajuste por edad, sexo, clasificación de Lauren, la diferenciación, el estadio TNM y ACT. Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank pruebas también se utilizaron para evaluar el efecto de los SNP individuales en el tiempo de supervivencia. Estadísticas significación se fijó en un nivel de 0,05 y todos
Los valores P
reportados en este estudio fueron dos caras.
Resultados
Distribución de las características de los pacientes y el pronóstico de análisis
GC características de los pacientes se resumen en la Tabla S2. Debido a la fecha de finalización a finales del reclutamiento de pacientes para el conjunto de entrenamiento, el tiempo medio de seguimiento fue menor en el conjunto de entrenamiento (46 meses, que van desde 6 a 80 meses) que en el conjunto de validación independiente (72 meses, que van desde 6-89 meses). Por lo tanto en comparación con los pacientes en el conjunto de validación independiente, los que están en el conjunto de entrenamiento tenían menores tasas de recaída (58,4%
vs
. 66,8%,
P = 0,005
) y la muerte (41,4%
vs
. 55,8%,
P
= 0,001). No hubo diferencias entre conjunto de entrenamiento y validación establecido en términos de edad, localización tumoral, clasificación de Lauren, el estadio TNM, la diferenciación y ACT (
P
valor que oscila entre 0,082 a la 0,898). En el último seguimiento, 641 pacientes (423 y 218 en el entrenamiento y validación del conjunto, respectivamente) presentaron recaída y 482 murieron (300 y 182 en el entrenamiento y validación del conjunto, respectivamente). Multivariante de Cox análisis de regresión mostró que había significativamente mayor riesgo de muerte y recurrencia en pacientes con el tipo difuso, pobre diferenciación y el estadio tumoral III y IV en comparación con aquellos pacientes con el tipo intestinal, así /moderada diferenciación y estadio tumoral I y II entre el conjunto de entrenamiento, conjunto de validación y análisis conjunto. Además, ACT basada en platino después de la cirugía mostró un efecto protector significativo tanto en OS y RFS de los pacientes GC (Tabla S3).
Asociación de
HMGB1
SNPs con el resultado clínico en pacientes con cáncer gástrico
Se evaluó la asociación de
HMGB1
genotipos SNP con el resultado clínico GC utilizando el análisis multivariado de regresión de Cox con ajuste por edad, sexo, localización tumoral, clasificación de Lauren, la diferenciación, el estadio TNM y ACT (como se muestra en la Tabla 1). Los resultados mostraron que la etiqueta SNP rs1045411 se asoció significativamente con el sistema operativo de pacientes con cáncer gástrico en el conjunto de entrenamiento. En comparación con los pacientes con el genotipo GG, aquellos con alelos variantes (AG y genotipos AA) tenían un riesgo significativamente menor de muerte (HR = 0,77 IC del 95%: desde 0,60 hasta 0,97,
P = 0,032
). Este importante hallazgo fue confirmado en el conjunto de validación independiente y análisis agrupado, con los CRI de 0,80 (IC del 95%: 0,62 a 0,99;
P = 0,046
) y 0,78 (IC del 95%: 0,55-0,98;
P
= 0,043), respectivamente. El análisis de Kaplan-Meier curvas también proporcionó una fuerte asociación con el sistema operativo. Los pacientes portadores de genotipos AG /GG de rs1045411 tuvieron una mejor SG que aquellos con el genotipo GG en el conjunto de entrenamiento (
P = 0,024
, la figura 1A), conjunto de validación (
P = 0,017
, la figura 1B ) y el análisis agrupado (
P = 0,001
, la figura 1C).
SG de los pacientes estratificados por GC rs1045411 SNP en el conjunto de entrenamiento (a), sistema de validación (B) y el análisis agrupado ( DO). El número de pacientes pueden no sumar el 100% de los sujetos disponibles debido a la falta de datos de genotipado.
El análisis estratificado en la asociación de rs1045411 con OS por variables del lenguaje principal
Hemos llevado a cabo estratificado análisis para evaluar las asociaciones entre los genotipos de rs1045411 y el sistema operativo de los pacientes GC por edad, clasificación de Lauren, la diferenciación, el estadio TNM y ACT. Los efectos protectores significativos conferidos por rs1045411 fue más prominente en subgrupos adversos con una gama HR 0,39 a 0,69 (Figura 2A). Para más detalles, la significativa disminución en el riesgo de muerte asociado con los genotipos que contienen variantes-(AG /AA) de rs1045411 se observó en los pacientes de mayor edad (HR = 0,69 IC del 95%: 0,48 a 0,99), tipo difuso (HR = 0,67, 95% IC: 0,47 a 0,95), la mala diferenciación (HR = 0,66; IC del 95%: 0,45-0,95), estadio clínico III y IV (HR = 0,58; IC del 95%: 0,37 hasta 0,93) y sin ACT (HR = 0,39, 95 % IC: 0,20-0,76). Además, la presente análisis estratificado mostró una tendencia similar para RFS con una gama HR 0,44 hasta 0,79 (Figura 2B). Los resultados indicaron que los genotipos AG /AA de rs1045411 confirieron el pronóstico más favorable en los grupos adversos.
El análisis estratificado de las asociaciones entre los genotipos de rs1045411 y sistema operativo de los pacientes con cáncer gástrico por edad, clasificación de Lauren, la diferenciación, estadio TNM y ACT (2A), y el efecto sobre la RFS de rs1045411 genotipos AG /AA en los grupos adversos (2B). El número de pacientes pueden no sumar el 100% de los sujetos disponibles debido a la falta de datos de genotipado.
efecto conjunto entre rs1045411 y clasificación de Lauren, la diferenciación, la etapa o ACT el OS de prueba
Los estudios previos han demostrado que tanto las variaciones genéticas y las características clínicas interactúan para desempeñar un papel fundamental en la progresión de GC [17]; y que cuando existen interacciones, los efectos de los elementos clínicos sobre la progresión del tumor serán modificados por los genotipos. Por lo tanto, se realizó un análisis conjunto para evaluar el potencial efecto modulador de rs1045411 en estas características clínicas (clasificación de Lauren, la diferenciación, la etapa y ACT) que representa el estado de progresión del tumor en el sistema operativo de los pacientes GC. Como se muestra en la Tabla 2, hubo una interacción significativa entre los genotipos de rs1045411 y clasificación de Lauren, la diferenciación, la etapa o ACT (todo el
P
interacción & lt; 0,001). En comparación con los individuos portadores de genotipos AG /AA y tipo intestinal, aquellos con el genotipo GG y el tipo difuso tenido un aumento significativo del riesgo de muerte (HR = 2,09; IC del 95%: 1,42 a 3,08,
P Hotel & lt; 0,001). Los resultados similares se encuentran también en los pacientes portadores del genotipo GG con pobre diferenciación (HR = 2,48 IC del 95%: 1,70 a 3,62,
P Hotel & lt; 0,001), en pacientes con el genotipo GG de estadio III /IV ( HR = 2,99 IC del 95%: 2,04 a 4,38,
P Hotel & lt; 0,001), y en pacientes que llevan el genotipo GG con ACT (HR = 4,49 IC del 95%: 2,70 a 7,45,
P
. & lt; 0,001) en comparación con el grupo de referencia correspondiente
efectos funcionales de rs1045411 en la expresión génica análisis
Bioinformática (http://www.microrna.org/microrna /home.do) reveló una estrecha proximidad de rs1045411 SNP etiqueta de la predicho microRNA sitios de unión (HSA-miR-505) en la región 3 'no traducida (3'UTR) del
HMGB1
de genes [22] (Fig 3A). En primer lugar confirmó la expresión de miR-505 en líneas de células HEK-293T SGC-7901 y, y se encontró que miR-505 tenía un nivel de expresión relativamente más alta (Fig 3B). Para investigar si los genotipos de rs1045411 SNP en la etiqueta de la 3'UTR de la
HMGB1
gen podría alterar la expresión génica, dos líneas celulares fueron transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa que contenían el salvaje (GG) o variante (AA) genotipo de SNP rs1045411 (figura 3C). Los resultados demostraron que rs1045411 SNP mostraron significativamente un efecto sobre la actividad de la luciferasa normalizada en células transfectadas. En comparación con las células transfectadas con las construcciones que llevaban el genotipo salvaje (GG) de rs1045411 SNP, células transfectadas con construcciones que llevan variante genotipo (AA) mostraron una significativa disminución de la actividad de luciferasa. El efecto de anti-miR-505 en la actividad de luciferasa de plásmidos informadores también se evaluó en el estudio. Los resultados mostraron que la actividad de la luciferasa de dos UTR construye (p-MIR-G y p-MIR-A) se incrementó significativamente por anti-miR-505 en ambas líneas celulares con diferencias eliminadas de la actividad de luciferasa entre dos plásmidos informadores. Por otra parte, hemos utilizado RT-PCR cuantitativa para investigar el efecto de los genotipos SNP rs1045411 en la expresión del ARNm de la HMGB1 en 60 tejidos GC (30 con el genotipo GG y 30 con genotipos AG /AA) del conjunto de validación. Como se muestra en la figura 3D, se encontró que el nivel de expresión del ARNm de la HMGB1 fue significativamente mayor en los portadores con salvaje (GG) de genotipo rs1056560 que los que llevó a los genotipos variantes (AG /AA) (1,04 ± 0,50
vs
. 0,79 ± 0,37,
P
= 0,004).
(A) La secuencia que incluye rs1045411 SNP en 3'UTR de
HMGB1
gen. (B) los niveles de expresión de HSA-miR-505 en SGC-7901 y las células HEK-293T. (C) El efecto de los genotipos de SNP rs1045411 en la expresión de
HMGB1
gen en SGC-7901 y las células HEK-293T. (D) relativo nivel de expresión de ARNm de
HMGB1
gen en 60 tejidos GC con diferentes genotipos SNP rs1045411. vector recombinante (PMIR-rs1045411-G o pMIR- rs1045411-A) y PTL-CT fueron co-transfectadas en SGC-7901 y las células HEK-293T. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Estudiante de
t
prueba se utilizó para examinar diferencia estadística.
Discusión
En este estudio, se investigó la asociación de los polimorfismos genéticos en
HMGB1
génica con el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico mediante el análisis de dos etapas de entrenamiento y validación conjuntos. Hemos demostrado que los genotipos AG /AA de rs1045411 SNP etiqueta en
HMGB1
3'-UTR se asocian significativamente con un mejor sistema operativo en una serie de 704 pacientes con cáncer gástrico en comparación con los genotipos GG. Esta asociación significativa fue confirmada en un conjunto de validación independiente de 326 pacientes con cáncer gástrico, así como un análisis combinado de todos los pacientes GC 1030. ensayo funcional indicado que los genotipos SNP rs1045411 tuvieron una influencia significativa en la expresión de ARNm de
HMGB1 Hoteles en tejidos GC, así como dos líneas de células tumorales. Además, el efecto pronóstico favorable de rs1045411 fue más evidente en los subgrupos de pacientes adversos GC. Además, el análisis conjunto se encontró una interacción significativa de elementos génicos-clínica. A lo mejor de nuestro conocimiento, este estudio por primera vez, informó la asociación entre el
HMGB1 polimorfismos de genes y el pronóstico
GC. Una vez validado,
HMGB1
rs1045411 SNP puede ser utilizado como un marcador pronóstico en combinación con factores tradicionales pronóstico clínico para la toma de decisiones de GC tratamiento individual.
Las evidencias sugieren que el aumento de la HMGB1 es elevada asociado con la metástasis tumoral y mal pronóstico [16, 23-26], haciendo HMGB1 un biomarcador tumor atractivo. Se ha sugerido que las funciones de HMGB1 como una proteína potencialmente oncogénico para promover el progreso del tumor [15, 27, 28], y su sobreexpresión en células de cáncer afecta a la anti-cáncer de respuesta de células T a través de la activación de la señalización intracelular [15, 29]. De hecho, la elevada expresión de la HMGB1 se ha detectado en los pacientes con GC y otros tipos de cáncer [30-32], y su expresión está estrechamente asociada con la tumorigénesis [33], invasión tumoral y metástasis [29]. Además, Chung et al [34] demostró que los niveles en suero de HMGB1 también se asociaron significativamente con la invasión tumoral, la metástasis, el crecimiento, así como un mal pronóstico. En conjunto, estos resultados apoyan un papel importante en la transformación de la HMGB1 cáncer, el crecimiento del tumor y la invasión.
A pesar de las extensas investigaciones de expresión HMGB1 en los tejidos y su correspondiente actividad serológica sobre la evolución del cáncer, hay algunos estudios centrados en el efecto de los SNPs en
HMGB1
gen en el pronóstico del cáncer o la respuesta al tratamiento hasta ahora. En un grupo de pacientes chinos con cáncer de pulmón, dos SNPs, rs2249825 y rs141215, se han asociado con las respuestas de quimioterapia basados en platino [35]. Del mismo modo, en los pacientes con carcinoma oral de células escamosas, otro
HMGB1
polimorfismo rs3742305 SNP en los que se ha asociado con la progresión tumoral y la supervivencia libre de recurrencia [36]. Sin embargo, se excluyeron los SNP rs3742305 del presente estudio, ya que se encuentra en fuerte desequilibrio de unión con los SNP rs1045411. En este estudio, se encontró que contenía variante (AG /AA) genotipos de SNP rs1045411 etiqueta se asociaron significativamente con una mejor SG en pacientes con GC, apoyando un papel importante en la evolución de la HMGB1 GC.
Desde SNP rs1045411 está situado en la región 3'UTR del
HMGB1
gen, que puede influir en la expresión de
HMGB1
génica en pacientes con cáncer gástrico. Hasta la fecha, sin embargo, no hay estudios para evaluar las funciones de los SNP rs1045411. Se encontró que rs1045411 está en estrecha proximidad a un sitio predicho microRNA unión (tiene-miR-505) [22], lo que sugiere que tal variación en esta posición puede afectar a la estabilidad del ARNm y la actividad de unión a microRNA, modulando con ello la expresión de genes [ ,,,0],37]. De hecho, nuestros ensayos de reportero de luciferasa confirmaron una influencia significativa de rs1045411 en la regulación post-transcripcional de
HMGB1
gen de una forma de miR-505-dependiente. Por otra parte, mediante el examen de nivel de expresión HMGB1 ARNm en muestras de tejido 60 GC con el genotipo de datos de rs1045411 SNP, se encontró que los tejidos que llevan contiene variante (AG /AA) genotipos había disminuido significativamente ARNm HMGB1 niveles de expresión en comparación con aquellos con salvaje homocigotos (GG ) genotipo. Tomados en conjunto, nuestros datos experimentales indican que el efecto pronóstico favorable conferida por la variante que contiene-(AG /AA) genotipos de rs1045411 estaba estrechamente asociado con la expresión aberrante de
HMGB1
.
Nuestro estudio demostró que se encontraron los efectos protectores significativos o dudosos de la variante que contiene-(AG /AA) genotipos de SNP rs1045411 en el sistema operativo y el RFS de pacientes con cáncer gástrico casi por completo en el adverso (pero no en pacientes favorables) estratos. Esto concuerda con estudios previos que muestran que los SNPs afectan a la supervivencia de cáncer más importante en los pacientes de subgrupos específicos. Por ejemplo, Wang
et al
[38] han informado de que
PSCA
rs2294008 se asocia significativamente con la supervivencia de los resultados entre difuso de tipo cáncer gástrico, pero no cáncer gástrico de tipo intestinal. Pu
et al
[39] también han sugerido que las variantes genéticas relacionadas con microARN-se asocia más notablemente con la pequeña supervivencia del cáncer de pulmón no de células en los pacientes en etapa temprana. También se observó un significativo efecto de la interacción entre los genotipos rs1045411 y elementos clínicos como la clasificación de Lauren, la diferenciación, estadio clínico, y la quimioterapia adyuvante en la modulación del pronóstico de GC. Estas correlaciones significativas sugerido que rs1045411 SNP pueden tener funciones de modulación posibles de estas características clínicas que representan la progresión tumoral. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún no se han investigado más a fondo en el futuro.
El presente estudio tiene varias características distintas. En primer lugar, los pacientes reclutados provienen principalmente de Shaanxi y zonas adyacentes, que es adecuado para la realización de la investigación basada en la población debido a la estabilidad geográfica con baja tasa de movilidad. En segundo lugar, el tamaño de la población grande en relación inscrito en el presente estudio nos permitió realizar un análisis estratificado etapa de entrenamiento y validación conjuntos, lo que limitaba los factores de confusión de tumor y la heterogeneidad del tratamiento. Una limitación importante de este estudio es que la pequeña población relativa en el conjunto de validación puede dar lugar a falsos negativos. Además, dado que nuestro estudio se limitó a los chinos Han, no podemos descartar la posibilidad de generalizar el problema. Se necesitan estudios futuros en poblaciones más grandes y otras etnias.
En general, como el primer estudio observando el efecto de
polimorfismos de genes
HMGB1 en el pronóstico de GC en una población china, nuestros datos sugieren fuertemente que la etiqueta rs1045411 SNP en
HMGB1
gen tiene un efecto significativo sobre el resultado clínico de los pacientes con cáncer gástrico, especialmente para los pacientes en estadio avanzado o cualquier otra condición clínico-agresiva. El presente estudio tiene un potencial importancia clínica para ayudar a refinar las decisiones terapéuticas en el tratamiento de la GC.
Apoyo a la Información sobre Table S1. La información y los resultados de genotipado de SNPs HMGB1
doi: 10.1371. /Journal.pone.0154378.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. Algunas características demográficas y clínicas de la población de pacientes de cáncer gástrico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154378.s002 gratis (DOC) sobre Table S3. Distribución de las características de los pacientes y el análisis de pronóstico en el conjunto de entrenamiento y el conjunto de validación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154378.s003 gratis (DOC)