Extracto
Antecedentes
El objetivo de este estudio es evaluar la eficacia de S-1 /oxaliplatino frente régimen doxifluridina /oxaliplatino e identificar miRNAs como potenciales biomarcadores de pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. La expresión de miRNAs candidatos se cuantificó a partir de muestras FFPE cáncer gástrico cincuenta y cinco de última fase
Diseño Experimental
pacientes con cáncer gástrico con un KPS & gt;. 70 fueron reclutados para el juicio. El grupo de control fue tratado con 400 mg /dos veces /día doxifluridina más
i.v.. Vaya con oxaliplatino a 130 mg /m
2 /primer ciclo día /4 semanas. El grupo de prueba se trató con S-1 a 40 mg /dos veces /día /4 semanas de ciclo y
i.v.. Vaya con oxaliplatino a 130 mg /m
primer ciclo de la semana 2 /día /4. ARN totales se extrajeron a partir de muestras normales y tumorales gástricas. Los niveles de miRNAs se cuantificaron utilizando en tiempo real análisis de la expresión de qRT-PCR.
Resultados
La tasa de respuesta objetiva global (RC + RP) de los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino fue de 33,3% (CR + PR)
vs.
17,6% (CR + PR) con doxifluridina /oxaliplatino en pacientes con cáncer gástrico en etapa avanzada. El promedio general de supervivencia para los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino fue 7,80 meses vs 7,30 meses con los pacientes tratados con doxifluridina /oxaliplatino. La expresión de miR-181b (
P = 0,022
) y miR-21 (
P = 0,0029
) se sobreexpresa significativamente en los tumores gástricos en comparación con los tejidos normales gástricas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los niveles bajos de expresión de miR-21 (Log rank test, razón de riesgo: 0,17; IC = 0,06 a 0,45;
P = 0,0004
) y miR-181b (Log rank test, peligro relación:. 0,37, IC = desde 0,16 hasta 0,87;
P = 0,018
) están estrechamente relacionados con la supervivencia global del paciente mejor para ambos regímenes S-1 y doxifluridina basados
Conclusión
los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino tuvieron una mejor respuesta que los tratados con doxifluridina /oxaliplatino. miR-21 y miR-181b tienen un gran potencial como biomarcadores de pronóstico en el cáncer gástrico en la etapa tardía
Visto:. Jiang J, X Zheng, Xu X, Zhou Q, H Yan, Zhang X, et al. (2011) Significado pronóstico de miR-181b y miR-21 en pacientes con cáncer gástrico tratados con S-1 /oxaliplatino o doxifluridina /oxaliplatino. PLoS ONE 6 (8): e23271. doi: 10.1371 /journal.pone.0023271
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de mayo de 2011; Aceptado: 10 de julio de 2011; Publicado: 18 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30950022 y 30972703) y de la Sociedad Planes de desarrollo, Departamento de Ciencia y Tecnología Changzhou (BS20092019). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico sigue siendo una de las formas más comunes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 870.000 nuevos casos y 650.000 muertes por año. El cáncer gástrico es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en China [1]. La detección clínica temprana de cáncer gástrico fue de menos de 15%, y alrededor de 85% de los casos se avanzó cáncer gástrico [2]. La tasa media de mortalidad de cáncer gástrico en China es más de un 26% para el sexo masculino y el 15% para el sexo femenino. El cáncer gástrico es una bastante complejo y enigmático trastorno y muchos factores probable conducir al desarrollo de la enfermedad. La epigenética juega un papel clave en el desarrollo del cáncer gástrico y la creciente evidencia mostró que los miRNAs no codificantes son uno de los principales contribuyentes al cáncer gástrico.
miRNAs son una clase de pequeños ARN no codificante de 20-22 nucleótidos de longitud, el cual se procesan de grandes pre-miRNAs por la enzima RNasa III Dicer (DICER1) en miARN dúplex [3]. Una hebra de Esto asocia dúplex con el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), mientras que la otra cadena es generalmente degradado por nucleasas celulares [3]. El complejo miARN-RISC se une al mRNA objetivos específicos, que conduce a la represión de traducción o la escisión de estos ARNm. Por lo tanto, miRNAs modulan la expresión de proteínas mediante la promoción de la degradación del ARN, inhibición de la traducción de ARNm, y en algunos casos, que afecta a la transcripción. Aunque los genes miARN mediada por la degradación del ARNm se produce en los mamíferos, se piensa que la mayoría de los mamíferos miRNAs para reprimir la expresión del gen diana a nivel de traducción [4], [5], [6] a través de imperfecto de apareamiento de bases de las regiones 3 'no traducidas (3' -UTRs) de sus ARNm diana. Esta forma de regulación de traducción proporciona a la célula con una forma más precisa, inmediata y eficiente de la energía de controlar la expresión de una proteína dada [7] ya que induce cambios rápidos en la síntesis de proteínas sin exceso de activación de la transcripción y posteriores pasos en el procesamiento del mRNA. Además, la traducción de control de la expresión génica tiene la ventaja de ser fácilmente reversible, proporcionando la célula con una gran flexibilidad en la respuesta a varios tipos de estrés.
fluoropirimidinas quimioterapia basada (por ejemplo, S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /oxaliplatino) permanece como una opción de tratamiento importante para los pacientes con cáncer gástrico avanzado. Estudios previos han descubierto una serie de miRNAs asociados con la quimiorresistencia a 5-FU y S1 terapia basada en el cáncer colorrectal [8], [9], [10], [11], [12], [13]. S-1 es una novela dihidropirimidina deshidrogenasa oral (DPD) fluoropirimidina inhibitoria (DIF) basado en una modulación bioquímica de 5-fluorouracilo (5-FU); S-1 contiene tegafur (FF) y dos tipos de inhibidores de la enzima, 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina (CDHP) y oxonato de potasio (oxo) en una relación molar de 1:0.4:1. Doxifluridina es un derivado de fluoropirimidina y se activa a 5-fluorouracilo por la uridina fosforilasa, que está más altamente expresado en las células malignas. Varios informes han demostrado la importancia de miRNAs en el cáncer gástrico [14], [15], [16], [17]. Sin embargo, actualmente no existe ningún estudio sobre miRNAs relacionados con el tratamiento de quimioterapia basada flupyrimidine. Hay una necesidad urgente de descubrir biomarcadores pronósticos para ayudar al manejo clínico del cáncer gástrico avanzado ya que esto ayudará a seleccionar a los pacientes que tendrán beneficio de supervivencia del tratamiento, evitar la toxicidad para los no respondedores, y reducir el costo de atención médica para los pacientes.
a pesar de que varios perfiles de miARN se han publicado estudios que revelan la importancia de los genes miARN en el cáncer gástrico con impacto en el control del ciclo celular, apoptosis, invasión tumoral y la metástasis [14], [17], en la actualidad no existe un informe de miARN enlace con los tratamientos de quimioterapia con S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /oxaliplatino. En este estudio, investigamos sistemáticamente la relación de miRNAs candidatos seleccionados (por ejemplo, el miR-21, miR-181b, miR-192, miR-140, let-7 g) en cuanto a su utilidad clínica en el cáncer gástrico utilizando muestras FFPE cáncer gástrico archivo . Estos miRNAs han sido anterior informaron que se asocia con la quimiorresistencia basado fluoropirimidina en el cáncer colorrectal [9], [10], [11], [12], [13]. Muestras previas a la quimioterapia fueron elegidos entre la S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /oxaliplatino en el cáncer gástrico avanzado. Tenemos anteriores demostraron que los miRNAs son bastante estables en muestras FFPE y es ideal para el descubrimiento de biomarcadores [18]. Los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino tuvieron una mejor respuesta que doxifluridina /oxaliplatino. Sin embargo, no hay ninguna diferencia en la supervivencia del paciente en general. Descubrimos que el miR-21 y miR-181b están asociados significativamente con los resultados del cáncer gástrico con S-1 /quimioterapia basada en oxaliplatino. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para demostrar la importancia pronóstica de miRNAs en el cáncer gástrico relacionado con S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /oxaliplatino tratamiento. miR-21 y miR-181b tienen un gran potencial como biomarcadores de pronóstico en el cáncer gástrico en la etapa tardía.
Métodos
Pacientes y muestras
cohortes de muestras clínicas utilizadas para este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión de la Institución Tercer hospital Afiliado de la Universidad Soochow. Los bloques de parafina que contienen las muestras fijadas con formalina de los tejidos (FFPE) fueron adquiridos de las colecciones de archivos del Departamento de Patología, y se utilizan para posterior extracción de RNA. Las características de estos pacientes se muestran en la Tabla 1.
Aislamiento de ARN
El uso de tejidos FFPE de archivo, se identificaron áreas separadas de tumor sólido y el epitelio gástrico normal utilizando la hematoxilina y eosina correspondientes secciones teñidas y núcleos de medición de 1,5 mm de diámetro y 2 mm de longitud se extrajeron (aproximadamente 0,005 g). Posteriormente, las muestras se trataron con desparafinación, hidratación, proteinasa K, y en última instancia ARN totales se aislaron usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, CA, EE.UU.) [18].
tiempo real el análisis de QRT-PCR de los genes miARN
expresión
el miR-21, miR-140, let-7 g, miR-181b, 200c miR-miR-192 y cebadores específicos del gen de control interno RNU44 fueron adquiridos de Applied Biosystems (CA, USA). la síntesis de ADNc se realizó por la alta capacidad de síntesis de cDNA Kit (Applied Biosystems) con cebadores específicos de genes miARN. cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) se llevó a cabo en un sistema en tiempo real de Applied Biosystems 7500 (ABI 7500HT instrumento) con cebadores específicos de genes miARN por el ensayo TaqMan Expresión Génica. La expresión de los valores miRNAs se normalizó de acuerdo con el control de RNU44 interna, y los valores relativos de expresión se trazan.
Análisis estadístico
Todo el análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 5.0. los valores de la expresión de genes de miRNAs? Ct de cada muestra se calcularon mediante la normalización de acuerdo con la expresión RNU44 control interno, y los valores de cuantificación relativa se representaron. Las diferencias entre el tumor y los tejidos normales se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon de pares emparejados. Una curva de supervivencia de Kaplan-Meier se generó mediante la realización de un análisis de riesgos proporcionales de regresión de Cox para evaluar el nivel de expresión de miR-21 y miR-181b con una tasa de supervivencia. La significación estadística se estableció para
P
. & lt; 0,05 en cada prueba
Resultados y Discusión
cantidad tremenda de los esfuerzos se han centrado en el descubrimiento de biomarcadores predictivos y pronósticos para gástrica cáncer [19]. Debido a la complicidad de la enfermedad del cáncer gástrico, todavía sigue siendo un reto importante para identificar biomarcadores útiles clínicos. Con el reconocimiento de la amplia repercusión de miRNAs contra objetivos múltiples y caminos, es de nuestro interés para identificar una nueva clase de biomarcadores predictivos y pronósticos en el cáncer gástrico sobre la base de miRNAs. Hay varias ventajas de usar miRNAs como biomarcador en comparación con mRNA como miRNAs tienen una amplia función reguladora, un número relativamente pequeño y una mejor estabilidad en muestras de FFPE de archivo [18]. Presentamos aquí que los niveles de expresión de miR-181b y miR-21 constituyen fuertes factores de pronóstico en pacientes con cáncer gástrico avanzado tanto en S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /Oxaliplatino regímenes. Los parámetros clínicos y patológicos de los pacientes con cáncer gástrico tratados con doxifluridina /oxaliplatino o S-1 /oxaliplatino se enumeran en la Tabla 1.
Expresión diferencial de miRNAs en el cáncer gástrico
cuidadosamente seleccionado una serie de candidatos miARN que han estado anterior al parecer, relacionados con la quimio-resistencia basada en fluoropirimidinas en el cáncer colorrectal [9], [10], [11], [12], [13]. Los niveles de expresión de miRNAs se cuantificaron mediante análisis en tiempo real QRT-PCR usando ARN total extraído de muestras FFPE de cáncer gástrico y tejidos gástricos normales como controles. Los niveles de expresión de los genes miARN se normalizaron más utilizando RNU44 control interno. La mayoría de los miRNAs (por ejemplo, el miR-140, miR-200c) hemos cuantificado muestran expresión diferencial entre los tejidos normales y tumorales (Figura 1). La expresión de un importante miARN, MIR-200c, se redujo significativamente en el cáncer gástrico. miR-200c se ha informado que asocia directamente con cheomosensitivity y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [20]. La expresión de miR-181b (
P = 0,022
) y miR-21 (
P = 0,0029
) se sobreexpresa significativamente más en los tumores gástricos en comparación con los tejidos gástricos normales (Figura 2). Nuestros resultados son coherentes con los informes anteriores de que estos miRNAs fueron desregulados en el cáncer gástrico [21].
Asociación de miR-21 y miR-181b con el cumplimiento de S-1 /oxaliplatino y doxifluridina /régimen de tratamiento oxaliplatino
La tasa de respuesta objetiva global (RC + RP) de los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino fue de 33,3% (CR + PR)
vs.
17,6% (CR + PR) con doxifluridina /oxaliplatino para el estadio III y IV de cáncer gástrico. Hemos seleccionado varios miRNAs que han demostrado estar asociados con la quimio-resistencia basada en fluoropirimidinas en el cáncer de colon [9], [10], [11], [12], [13] y evaluado sistemáticamente su potencial vínculo con doxifluridina /oxaliplatino y S -1 /oxaliplatino en el cáncer gástrico. La baja expresión de miR-21 (
P
= 0,001) y miR-181b (
P
= 0,001) se asociaron significativamente con los respondedores S-1 /Oxaliplatino (Tabla 2). Esto es muy consistente con el informe anterior de que la expresión de miR-181b se asoció con el tratamiento S1 en el cáncer colorrectal [8]. Se ha informado de que el miR-181b se asoció con múltiples resistencia a los medicamentos (MDR) por la orientación BCL2 [22]. Con respecto a miR-21, nuestros resultados fueron consistentes con un informe reciente que la supresión de miR-21 por anti-MIR sensibiliza líneas celulares de cáncer de páncreas a la gemcitabina (un análogo de fluoropirimidina) de tratamiento [23]. Sin embargo, la respuesta favorable no tuvo impacto en la supervivencia global de los pacientes como la supervivencia global media de los pacientes tratados con S-1 /oxaliplatino (7,80 mes) fue similar con los pacientes tratados con doxifluridina /oxaliplatino (7,30 meses). Esto no es sorprendente, ya que a menudo respuesta favorable de tiempo no se traduce en un beneficio de supervivencia.
miR-21 y miR-181b se asociaron significativamente con la supervivencia del paciente
Para determinar si algunos de éstos miRNAs han potencial como biomarcador pronóstico en el cáncer gástrico, se realizó un análisis de supervivencia del paciente utilizando la curva de supervivencia de Kaplan-Meier mediante análisis de regresión de Cox variantes Multi. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier por regresión de Cox reveló que los niveles bajos de miR-21 expresión (test de rangos logarítmicos, razón de riesgo: 0,17; IC = 0,06 a 0,45;
P = 0,0004
) y miR-181b (log rank prueba, razón de riesgo: 0,37; IC = 0,16-0,87;
P = 0,018
) están estrechamente relacionados con la supervivencia global del paciente para una mejor tanto S-1 y los regímenes basados doxifluridina (Figura 3). La importancia de miR-21 y miR-181b en el cáncer gástrico fue fuertemente apoyada por un informe reciente que las expresiones de miR-21 y miR-181b fueron activadas por STAT3 mediada por la IL-6. miR-21 y miR-181b actúan como un interruptor epigenética para inhibir PTEN y tumorales CYLD supresores, lo que lleva a un aumento de la actividad de NF-kB se requiere para mantener el estado transformado [24]. También reveló que la expresión tanto de miR-21 y miR-181b se asocia positivamente en términos de valor de expresión basado en el análisis estadístico (correlación de Pearson r = 0,38,
P = 0,018
; correlación de Spearman r
s = 0,38,
P = 0,018
). Es perfectamente concebible que el miR-21 y miR-181b actúan como un interruptor de epigenética en el desarrollo de cáncer gástrico y contribuir a la quimio-resistencia mediante la modulación de los genes supresores tumorales diana clave como PDCD4, ANP32A y los genes SMARCA4 [25]. Elevada expresión de miR-21 se ha reportado en muchos tipos de tumores, lo que sugiere la importancia de miR-21 como un oncogén de buena fe. Se ha informado de la miR-21 se asoció con
H. pylori
la infección y el desarrollo de cáncer gástrico, lo que sugiere que el miR-21 podría ser el vínculo potencial epigenético de la inflamación de
H. infecciones y tumores pylori
iniciación del cáncer gástrico [26].
En conclusión, se presenta aquí por primera vez que la expresión de miR-181b y miR-21 se asociaron con S- 1 /tratamiento con oxaliplatino y doxifluridina /oxaliplatino y la supervivencia del paciente. Además, apoya la noción de la importancia potencial de miR-181b y miR-21 en el desarrollo de la enfermedad del cáncer gástrico. Se establece una base para explorar aún más el mecanismo molecular que subraya el desarrollo de cáncer gástrico involucrado con miR-181b y miR-21, y para validar plenamente nuestras conclusiones a las grandes cohortes, en múltiples centros, los pacientes del ensayo clínico. miR-181b y MIR-21 también pueden tener potencial para ser como nuevas dianas terapéuticas en cáncer gástrico.
Reconocimientos
Haifeng Deng, Mingyang Lu, Bin Xu, Min Li, Liu Jian, Zhengguang Li y Hongbing Shi proporciona una excelente asistencia técnica.