Extracto
Aplicaciones
microRNAs se han convertido en los principales reguladores de la expresión génica, y su expresión alterada se ha asociado con la tumorigénesis y el tumor progresión. Por lo tanto, tienen potencial como microRNAs ambos biomarcadores de cáncer y /o posibles nuevas dianas terapéuticas. A pesar de la evidencia acumulada sugiere que el papel de la expresión aberrante de microARN en la carcinogénesis endometrial, todavía hay pocos datos disponibles acerca de la importancia pronóstica de los microRNAs en el cáncer de endometrio. El objetivo de este estudio es investigar el valor pronóstico de los microARN clave seleccionados en el cáncer de endometrio mediante el análisis de tejidos embebidos en parafina de archivos fijado en formol.
Diseño Experimental
Total ARN se extrajeron de 48 emparejado muestras normales y tumorales endometriales utilizando enfoque basado Trizol. La expresión de miR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181b, miR-200c, miR-192, miR-215, miR-200c, y miR-205 se cuantificaron por análisis de la expresión de qRT-PCR en tiempo real. Los objetivos de miRNAs expresados diferencialmente se cuantificaron mediante inmunohistoquímica. El análisis estadístico se realizó mediante el GraphPad Prism 5.0
Resultados
Los niveles de expresión de miR-200c (P & lt; 0,0001). y miR-205 (P & lt; 0,0001) fueron significativamente superiores en los tumores de endometrio en comparación a los tejidos normales. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los altos niveles de expresión de miR-205 se asociaron con una baja supervivencia global del paciente (razón de riesgo, 0,377; prueba Logrank, P = 0,028). Además, la disminución de la expresión de un objetivo de miR-205 PTEN se detectó en tejidos de cáncer de endometrio en comparación con los tejidos normales.
Conclusión
miR-205 mantiene un potencial único como un biomarcador de pronóstico en el cáncer de endometrio.
Visto: Karaayvaz M, Zhang C, Liang S, Shroyer KR, Ju J (2012) Significado pronóstico de miR-205 en el cáncer endometrial. PLoS ONE 7 (4): e35158. doi: 10.1371 /journal.pone.0035158
Editor: J. Christopher Unidos, Universidad de Louisville, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2011; Aceptado: March 13, 2012; Publicado: 13 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Karaayvaz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de la Universidad de Stony Brook Investigación traslacional Laboratorio fondo inicial (Dr. Ju), R01CA155019 (Dr. Ju) y R33CA147966 (Dr. Ju). No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio es la neoplasia maligna más común del tracto genital de la mujer en los Estados Unidos [1]. La supervivencia global a cinco años de cáncer de endometrio es aproximadamente el 80% entre todas las etapas. Aunque tiene una tasa relativamente baja de la mortalidad en comparación con otros cánceres ginecológicos, ciertos tipos histológicos son altamente invasivo, con frecuencia metastásica y tienen tasas de supervivencia pobres. El subtipo más dominante, cáncer endometrial endometrioide (CEE) representa aproximadamente el 80% de los casos. La cirugía es curativa con la mayoría de los casos diagnosticados en una etapa temprana. Por el contrario, los pacientes en estadio avanzado o cáncer de endometrio nonendometrioid tienden a mostrar características más agresivas y tienen un pronóstico mucho menos favorable [2]. Aunque las alteraciones morfológicas reflejan importantes conocimientos sobre el cáncer de endometrio, hay una necesidad urgente de biomarcadores pronósticos moleculares altamente sensibles y específicos para predecir mejor el resultado de cáncer de endometrio, especialmente en más de 25% de los tumores de endometrio endometrioides con alto riesgo de desarrollar más enfermedades agresivas.
Recientemente, los estudios moleculares han identificado la inestabilidad de microsatélites y las mutaciones en PTEN, K-ras, beta-catenina, p53, HER-2 /neu, p16 y los genes e-cadherina en los casos de cáncer de endometrio [ ,,,0],3]. En particular, la incidencia de mutaciones de PTEN se ha informado de que el más alto entre otras alteraciones genéticas, existente en 34-55% de los cánceres de endometrio [4] - [6]. PTEN es un supresor de tumor importante en el cáncer de endometrio, y la identificación de estos reordenamientos moleculares puede ayudar en la mejor comprensión de la biología del cáncer endometrial y también puede conducir al descubrimiento de nuevas dianas moleculares para la detección, el pronóstico, y la terapia. A pesar de estas alteraciones genéticas han sido descritos como importantes, no son universalmente presente en todos los casos que sugieren que los mecanismos epigenéticos (como microRNAs) también pueden estar implicados.
Los microARN (miRNA) son no codificantes pequeñas moléculas de ARN, de 19-25 nucleótidos que regulan la expresión de genes post-transcripcionalmente a través de la unión a la región 3 'no traducida (3'-UTR) del ARNm diana, causando la escisión del ARNm, la represión de traducción, o mRNA decadencia [3], [7] miRNAs han ha encontrado que regulan muchos procesos celulares críticos incluyendo la apoptosis [8] - [11], la diferenciación [12] - la proliferación celular [14] y [8], [13], [15], [16]. La expresión aberrante de miRNAs se observa en la mayoría de tipos de tumores, lo que indica un papel en la carcinogénesis y un potencial como biomarcadores de pronóstico /diagnóstico en el cáncer [17], [18]. Razonamos que los miRNAs se puede utilizar como una mejor clase de biomarcadores debido a sus amplias funciones reguladoras. Además, la estabilidad superior de miRNAs en los tejidos (FFPE) fijado en formol e incluidos en parafina y diversos fluidos corporales (por ejemplo, plasma, suero) facilita aún más la utilidad clínica de miRNAs.
Una serie de estudios recientes han informaron los perfiles de expresión de miRNAs en el cáncer de endometrio [19] - [26]. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar el valor pronóstico de miRNAs utilizando muestras de archivo FFPE de pacientes con cáncer de endometrio. Hemos cuantificado sistemáticamente las expresiones del candidato miRNAs implicados en procesos celulares críticos, tales como el control del ciclo celular, la quimio-resistencia, la muerte celular y la transición EMT (miR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181b, miR-192, miR-215 , miR-200c, y miR-205) utilizando el análisis cuantitativo en tiempo real PCR (QRT-PCR). Estos miRNAs fueron elegidos en base a sus genes críticos de destino que se rompe durante la carcinogénesis endometrial (por ejemplo, p53, K-ras, PTEN) [27] - [32]. Nuestros resultados muestran que los niveles de expresión de miR-200c y miR-205 fueron significativamente sobreexpresado en el cáncer de endometrio. Sin embargo, sólo la expresión de miR-205 se asoció significativamente con la supervivencia del paciente. Estudios previos han identificado PTEN como uno de los objetivos directos de miR-205 [33], [34]. Teniendo en cuenta la importancia de PTEN en la biología del cáncer endometrial, la hipótesis de que la inhibición mediada por mecanismo de PTEN miR-205 podría tener un
in vivo
relevancia fisiológica en el cáncer de endometrio. De hecho, nuestros resultados han demostrado que los niveles de expresión de miR-205 fueron significativamente inversamente correlacionados con los niveles de expresión de PTEN. Como resultado, nuestros hallazgos sugieren que el miR-205 puede tener un potencial único como un biomarcador para el pronóstico del cáncer de endometrio.
Resultados
La expresión de miRNAs en el cáncer de endometrio humano y la evaluación de su valores pronósticos
los parámetros clínico de 48 pacientes con cáncer de endometrio utilizados en este estudio se describe en la Tabla 1. la mitad de los pacientes tenían carcinoma endometrioide, y el resto de pacientes fueron diagnosticados con la histología nonendometrioid (13 carcinoma seroso, 5 carcinoma de células claras, 5 mixto maligno tumor de Müller (MMMT), y un carcinoma indiferenciado). De estos pacientes, 26 casos en estadio I (54%), cuatro casos en estadio II (8%), 6 casos en estadio III (13%), y 12 casos en estadio IV (25%) de la enfermedad. Para investigar la importancia clínica de los seleccionados miRNAs en estos pacientes de cáncer de endometrio, cuantificamos sus niveles de expresión de 48 tumores de archivos emparejado y muestras normales de tejido FFPE utilizando análisis en tiempo real QRT-PCR. De los miRNAs ensayadas, no hubo diferencia significativa en los niveles de expresión de miR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181b, miR-192 y miR-215 entre los tejidos tumorales y las correspondientes muestras normales (P = 0,742 ; P = 0,91; P = 0,641; P = 0,313; P = 0,106; P = 0,336, respectivamente) (Figura 1 A-F). Por el contrario, la expresión tanto de miR-200c (P & lt; 0,0001; Figura 1G) y miR-205 (P & lt; 0,0001; Figura 1H) fueron significativamente hasta reguladas en muestras de cáncer de endometrio en comparación con los tejidos normales adyacentes. A fin de analizar la importancia de miR-200c y miR-205 en términos de pronóstico clínico, se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, utilizando la supervivencia global del paciente (Figura 2). Nuestros resultados indican que los niveles de expresión de miR-205 se asociaron significativamente con la supervivencia del paciente. Los pacientes con niveles bajos (cut-off de 15 veces de miR-205) tendían a tener una mejor supervivencia que los pacientes con altos niveles de miR-205 (relación hazar, 0,377; prueba Logrank, P = 0,028) (Figura 2B). Esto apoya la idea de que los elevados niveles de miR-205 en los tejidos tumorales podría dar lugar a peores tasas de supervivencia en pacientes con cáncer de endometrio. Sin embargo, los niveles de expresión de miR-200c no se asociaron con la supervivencia de los pacientes (p = 0,576; Figura 2A).
Cuantificación relativa de miRNAs se expresan como normalizado con un gen de control interno RNU6B. (A) la expresión de miR-26a (P = 0,742). (B) let-7 g expresión (p = 0,91). (C) la expresión de miR-21 (P = 0,641). (D) miR-181b expresión (P = 0,313). expresión (E) de miR-192 (P = 0,106). expresión (F) de miR-215 (P = 0,336). (G) la expresión de miR-200c (P & lt; 0,0001). (H) la expresión de miR-205 (P & lt; 0,0001). La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student pareada.
. Kaplan-Meier de supervivencia global se representaron gráficamente basado en la expresión de los genes miARN. (A) miR expresión 200c (P = 0,576, prueba Logrank). (B) la expresión de miR-205
Correlación de la expresión de miR-205 y PTEN en pacientes con cáncer de endometrio
Se ha informado (p = 0,028, prueba Logrank). que miR-205 se dirige a un gen supresor de tumores PTEN crítico [33], [34], que está mutado o eliminado en el cáncer de endometrio con frecuencia [4] - [6]. Sin embargo, las alteraciones genéticas no pueden dar cuenta de todas las pérdidas de proteína PTEN observado en los carcinomas de endometrio, lo que sugiere fuertemente la participación de un post-transcripcional regulación de la expresión de PTEN [35], [36]. Dado que los niveles de expresión de miR-205 fueron elevados en los tejidos tumorales, que razonó que el aumento de la inhibición de PTEN por el miR-205 podría ser un mecanismo fisiológicamente relevante durante la carcinogénesis endometrial. Con el fin de investigar un
in vivo
relación entre el miR-205 y expresión de la proteína PTEN, se construyeron microarrays de tejidos (TMA) a partir de muestras de tejido FFPE archivos y realizó inmunohistoquímica con anticuerpos PTEN en 6H2.1 seccionada TMA. Nuestros resultados indican que la expresión de proteína PTEN se redujo en el cáncer de endometrio en comparación con endometrio normal. La Figura 3A muestra que la expresión de PTEN mediana fue significativamente menor en los tejidos tumorales (mediana de puntuación de 85) en comparación con los tejidos normales (puntuación mediana 132) (P = 0,0058). Figura 3 (B-E) muestra ejemplos de tinción de PTEN en el endometrio normal (3B), carcinoma endometrioide (3C), carcinoma seroso (3D), y carcinoma de células claras (3E).
(A) Diagrama de dispersión de inmunotinción anota para PTEN en el endometrio normal y cáncer de endometrio calculada mediante la cuantificación de la intensidad de la tinción utilizando el software ImageJ. Las barras representan la media para cada categoría (mediana normal = 85, la mediana del tumor = 132). expresión de la proteína (B-E) PTEN se detecta en el endometrio normal (B), carcinoma endometrioide (C), carcinoma seroso (D), y carcinoma de células claras (E) como se detecta por inmunohistoquímica.
para confirmar aún más la relación inversa entre el miR-205 y la expresión de PTEN, se realizó un análisis de correlación de Spearman no paramétrico mediante el uso de los casos que tienen tanto los datos de cuantificación de proteínas de miR-205 y PTEN. Nuestros resultados indican la presencia de una correlación inversa en 69% de los casos (coeficiente de correlación de Spearman = -0,502, P = 0,034) (Figura 4A). Figura 4B y Figura 4C muestran ejemplos de tinción de PTEN acompañado de miR-205 niveles de expresión en casos individuales. Figura 4B demuestra un carcinoma indiferenciado con la tinción de PTEN alta y sólo una ligera sobre regulación en la expresión de miR-205 entre el tumor y el tejido normal adyacente (~1.25 veces). La figura 4C muestra un carcinoma de células claras con muy baja tinción de PTEN y ~ 350 veces sobre regulación de la expresión de miR-205 entre el tumor y el tejido normal adyacente.
Se analizó
(A) Correlación de miR-205 y la expresión de PTEN por dos colas de Spearman prueba de correlación no paramétrico (P = 0,034, coeficiente de correlación de Spearman = -0,502). expresión de la proteína PTEN acompañada por la expresión de miR-205 (por triplicado) se ilustra en casos individuales; carcinoma indiferenciado (B), y el carcinoma de células claras (C).
Por último, para apoyar nuestra hipótesis de que la disminución de expresión de la proteína PTEN está mediada por un control post-transcripcional, se cuantificaron los niveles de ARNm de PTEN utilizando reales -Tiempo QRT-PCR. Nuestros resultados indican que PTEN mRNA niveles de expresión en muestras de cáncer de endometrio no mostraron diferencias en comparación con los tejidos normales adyacentes (Figura 5). Estos resultados sugieren que la falta de correlación de PTEN mRNA con la pérdida de la proteína PTEN en el cáncer de endometrio era probablemente debido a un mecanismo post-transcriptionally regulado.
cuantificación relativa de PTEN mRNA se expresó como normalizado con un control interno β-actina de genes (p = 0,31). La significación estadística se calcula mediante una prueba t de Student para datos apareados.
Discusión
En este estudio, hemos identificado significativamente sobreexpresado miR-200c y miR-205 en el cáncer de endometrio en comparación con tejido endometrial normal (Figura 1). Este hallazgo es consistente con muchos otros estudios que informan niveles elevados de estos dos miRNAs en diferentes tipos de cáncer de endometrio [19] - [24], [26]. Por lo tanto, se sugiere que la firma sobre-expresión de estos miRNAs en el cáncer de endometrio no es específico para el tipo histológico. Chung
et al.
Informó de que la expresión aberrante de miR-205 se correlacionó con la fase avanzada de cáncer de endometrio [22]. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que la expresión de miR-205 no estaba relacionada con la enfermedad en estadio tumoral o tipo (Figura S1). Descubrimos que la expresión de miR-205 se asoció significativamente con la supervivencia global del paciente de tal manera que los pacientes con mayores niveles de miR-205 tienden a tener un fenotipo peor supervivencia (Figura 2). Nuestros resultados apoyan la noción de que el miR-205 puede tener potencial como biomarcador para el pronóstico negativo de cáncer de endometrio y aproximaciones terapéuticas dirigidas a los niveles elevados de miR-205 debe ser explorado como un enfoque novedoso para mejorar los resultados clínicos.
también se ha informado de la familia miR-200 y miR-205 que están alteradas en otros tipos de cáncer. La familia de miR-200 se ha informado de que hasta reguladas en el cáncer de ovario y colangiocarcinoma [37] - [39], pero las reguladas en el carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y el carcinoma de células renales [40] - [42]. Por el contrario, el miR-205 se ha informado de que hasta reguladas en los ovarios, la vejiga y los carcinomas de mama [37], [43], [44], pero las reguladas en la próstata y los cánceres de esófago [45], [46] . Estos diferentes patrones de expresión en algunos tipos de cáncer pueden reflejar la presencia de mecanismos específicos del tipo de tumor que están mediadas por miRNAs reguladoras. La función más bien conocido de la familia miR-200 y miR-205 es su capacidad para regular la expresión de E-cadherina represores transcripcionales ZEB1 (también conocidos como δEF1) y SIP1 (también conocido como ZEB2), factores importantes para mesenquimal epitelial transición (EMT) y metástasis tumoral [32]. Sin embargo, el miR-200 y la función de la familia miR-205 como supresores de tumores mediante la inhibición de la EMT. Dado que la expresión de estos miRNAs se incrementa en las muestras tumorales, razonó que otras proteínas se dirigen estos miRNAs podrían estar implicados en el cáncer de endometrio. Uno de los objetivos notificados de miR-205 es un gen supresor de tumor crítica, PTEN [33], [34].
expresión PTEN se ha informado de que se reduce en el carcinoma endometrial [4], por lo que tiene una papel fundamental en la biología del cáncer de endometrio [35], [36], [47], [48]. Sin embargo, las mutaciones /deleciones de PTEN no son la única razón para la expresión de PTEN reducida. Por el contrario, los mecanismos epigenéticos, como la metilación del promotor, aumento de la degradación de la proteína PTEN o regulación a través de miRNAs también son importantes [49]. Con esto en mente, se analizaron los niveles de expresión de PTEN ARNm y proteínas en pacientes con cáncer de endometrio. Hemos demostrado que, a pesar de que no hubo cambios en la expresión de PTEN mRNA, la expresión de la proteína PTEN se redujo en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes. Esto apoya la hipótesis de que una regulación post-transcripcional de PTEN, posiblemente mediada por miRNAs, es válida. Junto con los informes de que PTEN es el objetivo directo de miR-205, nuestros resultados apoyan el papel potencial de miR-205 en la regulación de PTEN en el cáncer de endometrio.
En general, una disminución en la expresión de PTEN se relaciona con endometriod carcinoma y puede ser un biomarcador útil para distinguir carcinoma endometrioide de carcinoma seroso [4]. Sin embargo, otros estudios han informado de ninguna diferencia significativa en la expresión de PTEN, PTEN lo que sugiere que no siempre puede ser útil para distinguir estos subtipos de tumores [50], [51]. Por lo tanto, la utilidad clínica de PTEN como un biomarcador que queda por determinar. Estamos razón de que el miR-205 puede ser un biomarcador superior que PTEN debido a su amplio impacto en múltiples objetivos y las vías.
En resumen, nuestros resultados indican que la expresión de miR-205 y PTEN se correlacionan inversamente en cáncer de endometrio los pacientes con cáncer, lo que implica la importancia fisiológica del mecanismo de la inhibición mediada por PTEN miR-205 en la biología del cáncer de endometrio. Más importante, la expresión de miR-205 se asocia con la supervivencia de los pacientes de cáncer de endometrio. Por lo tanto, la razón de que miR-205 puede regular PTEN y otra expresión de la proteína en la patogénesis de cáncer de endometrio. Futuros estudios son claramente necesarios para validar totalmente la utilidad clínica de miR-205 como biomarcador pronóstico con grandes cohortes de pacientes con cáncer de endometrio multicéntricos.
Materiales y Métodos
Ética
muestra clínica cohorte utilizada para este estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Institución de la Universidad de Stony Brook Medical Center. consentimiento informado por escrito se recibió de todos los participantes involucrados en el estudio.
se obtuvo Pacientes y muestras
La aprobación de la Junta de Revisión de la Institución, tanto para la colección de tejidos y el uso de archivos fijado en formol parafina (FFPE) los bloques de tejido embebidos. Para la extracción de ARN, las muestras de tumor y los tejidos normales adyacentes fueron obtenidos de 48 pacientes con cáncer de endometrio que se sometieron a histerectomía en el Hospital de la Universidad de Stony Brook, Stony Brook, Nueva York. Las características de estos pacientes se muestran en la Tabla 1. Para la inmunohistoquímica, los tejidos tumorales se obtuvieron de 47 pacientes de cáncer de endometrio y los tejidos del endometrio no patológicas como controles normales se obtuvieron de cinco pacientes con cáncer no endometriales. Los bloques de parafina que contienen las muestras fijadas con formalina de los tejidos (FFPE) fueron adquiridos de las colecciones de archivos del Departamento de Patología y utilizados para los análisis posteriores. Los especímenes fueron seleccionados 1995-2010 con hasta 15 años de seguimiento de la información clínica.
microarrays de tejidos (TMA) guía
microarrays de tejidos se preparan a partir de FFPE bloques de muestras de histerectomía. Hematoxilina y eosina secciones teñidas de todos los casos fueron revisados cuidadosamente. Para cada caso, se designaron áreas de cáncer de endometrio y de endometrio normal. Uso de la Advanced Tissue Arrayer (Modelo: ATA-100, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), con una aguja de 1,5 mm de diámetro, tres núcleos fueron extraídos de la zona de tumor y tres núcleos fueron retirados de endometrio benigno para cada caso. Los núcleos fueron incrustados en un bloque de parafina de microarrays de tejidos en posiciones predeterminadas, con hasta 60 núcleos en cada uno de los microarrays de tejidos y dos núcleos adicionales colocados para designar la orientación del bloque.
La inmunohistoquímica (IHC) Análisis de la expresión de PTEN
TMA se seccionaron a 5 micras y las secciones se inmovilizaron calor en portaobjetos de vidrio a 60 ° C durante la noche. Después de desparafinación, recuperación de antígeno se realizó en un tampón de citrato [20 mmol /L (pH = 6)] a 120 ° C durante 10 minutos seguido de peróxido de hidrógeno al 3% durante cinco minutos. La tinción se aplica a los tejidos FFPE mediante el uso de un método de avidina-biotina (ABC) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las secciones se incubaron durante una hora con un anticuerpo monoclonal de ratón PTEN, PTEN 6H2.1 (Cascade Biosciences, Winchester, MA) a una dilución de 1:300. Monoclonal de ratón IgG (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) se utilizó como un control de isotipo negativo. tinción de PTEN se visualizó usando 3, 3'-diaminobencidina (Dako, Carpinteria, CA), y las secciones se contratiñeron con hematoxilina diluida, deshidratado, y coverslipped para la microscopía de campo brillante. La tinción para IHC se cuantificó la intensidad promedio de tres núcleos de cada caso (el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/)).
Aislamiento de ARN
Uso tejidos FFPE de archivo, áreas separadas de tumor y endometrio normal se identificaron utilizando la hematoxilina y eosina secciones correspondientes y los núcleos se tiñeron de medición de 1,5 mm de diámetro y 2 mm de longitud (aproximadamente 0.005 g) se extrajeron. Posteriormente, las muestras se desparafinaron, hidratados, se digirió con proteinasa K, y en última instancia, los ARN totales se aislaron usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.).
tiempo real QRT-PCR Análisis de Expresión de los genes miARN
el miR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181b, miR-192, miR-215, miR-200c, y miR-205 primers específicos y el gen de control RNU6B interna fueron adquiridos de Ambion ( Applied Biosystems, CA, EE.UU.). la síntesis de ADNc se realizó por la alta capacidad de síntesis de cDNA Kit (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con cebadores específicos de genes miARN. En tiempo real RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se llevó a cabo en un sistema de 7500 en tiempo real de Applied Biosystems (ABI 7500HT instrumento) con cebadores específicos de genes miARN por el ensayo TaqMan Expresión Génica.
tiempo real QRT-PCR análisis de PTEN ARNm
con el fin de detectar el ARNm de los tejidos FFPE, la síntesis de ADNc se realizó por la alta capacidad de síntesis de cDNA Kit (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con cebadores aleatorios. Para el análisis de QRT-PCR, diseñado a medida cebadores y sondas de PCR en tiempo real para PTEN y se utilizaron los genes de control interno β-actina (Applied Biosystems CA, EE.UU.). Los cebadores se diseñaron para obtener amplicones como pequeñas como sea posible debido a la preocupación por la degradación de mRNA en tejidos FFPE [52]. Las secuencias de estos cebadores /sondas se enumeran en la Tabla 2. QRT-PCR se llevó a cabo en un instrumento ABI 7500HT con cebadores específicos de ARNm mediante el ensayo de TaqMan Expresión génica en las siguientes condiciones: 50 ° C, 2 min de la transcripción inversa; 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 15 s; 60 ° C, 1 min para 40 ciclos (n = 3). La expresión de PTEN mRNA se normalizaron de acuerdo con el control interno β-actina, y los valores relativos de expresión se trazan.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 . los valores de la expresión de genes de miRNAs? Ct de cada muestra se calcularon mediante la normalización de acuerdo con la expresión RNU6B control interno, y los valores de cuantificación relativa se representaron. Las diferencias entre tumor y los tejidos normales se analizaron mediante la prueba t de Student pareada. Kaplan-Meier de supervivencia se generaron para evaluar los niveles de expresión de miR-200c y miR-205 con la tasa de supervivencia. se utilizó la prueba t de Student para datos independientes para analizar la diferencia en la tinción de PTEN entre el tumor y los tejidos normales. La significación estadística se estableció a P & lt; 0,05 en cada prueba
Apoyo a la Información
Figura S1..
Relación entre la expresión de miR-205 y las diferentes etapas de cáncer de endometrio. la expresión de miR-205 se expresó como normalizado con un gen de control interno RNU6B. (A) Ida prueba de ANOVA se utilizó para analizar la asociación de la expresión de miR-205 en estadio I, estadio II, estadio III y estadio IV de cáncer de endometrio. Se utilizó la prueba t (B) de Student para datos independientes para analizar la asociación de la expresión de miR-205 en la etapa I & amp; II
vs
estadio III & amp; IV
doi:. 10.1371 /journal.pone.0035158.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Haiyan Zhai, Stephanie Burke, Saira Mehmood, y Penélope Georgakopoulos de asistencia técnica y comentarios útiles. Agradecemos al Dr. Xu Xiao (Bioestadística Core para la Investigación de Enfermedades Digestivas del tejido Fondo para Adquisición de la Universidad de Stony Brook) por su ayuda en el análisis estadístico. Agradecemos la revisión crítica de la Sra. Sonia Lorena y sugerencias de nuestros colaboradores.