Extracto
Antecedentes
El ADN mitocondrial (ADNmt) de mutaciones se presentan en diferentes tumores. Sin embargo, no hay información sobre el desarrollo temporal del ADNmt mutaciones /alteración de contenido y su alcance en la mucosa normal y anormal continuamente expuestos al humo del tabaco en pacientes con cáncer de pulmón.
Metodología
Hemos examinado el patrón de ADNmt alteración (mutación del ADNmt y el índice de contenido) en biopsias de la mucosa de las vías respiratorias, 25 correspondientes tumores y ganglios linfáticos normales obtiene a partir de tres pacientes con cánceres primarios de pulmón. Además, se analizó el patrón de mutación del ADNmt en tumores y ganglios linfáticos normales obtenidos de otros ocho pacientes con cánceres primarios de pulmón correspondiente. todo el genoma mitocondrial 16,5 kb se secuenció en Affymetrix MitoChip plataforma de secuenciación v2.0 en todas las muestras. Para examinar índice de contenido de ADNmt, se realizó un análisis en tiempo real PCR.
Principales conclusiones
Las biopsias de la mucosa de las vías respiratorias obtenidas de tres pacientes con cáncer de pulmón eran histológicamente negativos, pero exhiben múltiples mutaciones de ADNmt clonales detectables en el tumores correspondientes. Uno de los pacientes fue operado dos veces para la extirpación de un tumor de la parte superior derecha y el lóbulo inferior izquierdo, respectivamente, en un lapso de dos años. Ambos de estos tumores presentan mutaciones en el ADNmt veinte idénticas. contenido de ADNmt se incrementó significativamente (P & lt; 0,001) en el cáncer de pulmón y todas las biopsias de la mucosa histológicamente negativos, excepto uno, en comparación con el nodo de control linfático
Conclusiones /Importancia:.
Nuestros resultados documentan la medida de parches clonales masivas que se desarrollan en los fumadores de por vida y, finalmente, dan lugar a cánceres clínicamente significativos. Estas observaciones arrojan luz sobre la extensión de la enfermedad en las vías respiratorias de los fumadores trazables a través de la mutación del ADNmt. ADNmt mutación podría ser una herramienta fiable para la evaluación molecular del epitelio respiratorio expuesto al humo continuo, así como la detección de enfermedades y la vigilancia. Análisis funcional de las mutaciones patógenas de ADN mitocondrial puede ser útil para comprender su papel en la tumorigénesis de pulmón
Visto:. Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Rini DA, Brandes J, Sidransky D (2009) Siguiendo Huellas mitocondriales a través un largo camino de la mucosa al cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10.1371 /journal.pone.0006533
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de mayo de 2009; Aceptado: July 6, 2009; Publicado: 6 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Dasgupta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por EDRN UO1CA084986 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ADN mitocondrial humano (ADNmt) es un 16,5 kb de doble cadena cerradas molécula circular que codifica para los 12S y 16S rRNAs, 22 tRNAs y 13 proteínas esenciales para el complejo respiratorio mitocondrial [1] - [2]. La mayoría de las células humanas contienen cientos de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) y casi todas estas copias de ADNmt son idénticos es decir homoplasmic al nacer [1] - [2]. tasa de mutación en el ADNmt es aproximadamente 10 veces mayor que el ADN genómico nuclear (ADNn) [1]. Hasta la fecha, las mutaciones de ADNmt clonales se han reportado en diferentes tumores [3]. Hay poca información sobre el desarrollo temporal de estas mutaciones y su extensión en la mucosa normal y anormal expuestos al humo del tabaco.
El cáncer de pulmón mata a más de 1 millón de personas en todo el mundo con el tabaquismo es el factor de riesgo más importante [4] . En los Estados Unidos, había más de 215.020 casos de cáncer de pulmón y una muerte estimada de 161.840 en 2008 [4]. A pesar de la mejora significativa en las modalidades terapéuticas, incluyendo la cirugía, la quimioterapia basada en platino y solo o en combinación de radioterapia, la tasa de supervivencia global a los 5 años es sólo del 15% [4]. El ochenta y cinco por ciento de los cánceres de pulmón se producen en los fumadores de tabaco [4]. Por otra parte, los pacientes afectados siguen siendo un riesgo significativo para el desarrollo de un segundo tumor primario durante toda su vida. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados para la detección temprana de la enfermedad, el seguimiento y la evaluación continua de las vías respiratorias de los pacientes con cáncer de pulmón primario son de suma importancia.
En el presente estudio, se analizó el patrón de ADNmt alteración (mutación y el contenido de ADN) en la mucosa de las vías respiratorias biopsias obtenidas de seguimiento de los pacientes con cánceres primarios de pulmón. tumores correspondientes y los ganglios linfáticos normales También se examinaron a partir de estos pacientes. Todas las biopsias parecían sospechosas y anormal bajo la broncoscopia de autofluorescencia, sin embargo, eran histológicamente negativos. Pero el mapa de las alteraciones del ADN mitocondrial en estas biopsias fue sorprendente y proporciona una visión única de la extensión de la disfunción mitocondrial y el aumento de riesgo de malignidad en pacientes que siguen fumando.
Resultados
Patrón de ADNmt mutación en el pacientes
Figura 1 muestra el patrón de mutaciones de ADNmt en paciente 1. Este paciente fue operado dos veces en un lapso de dos años, tanto en los pulmones. El primer tumor (T1) se extirpó quirúrgicamente en 2002 desde el lóbulo superior derecho, seguido de la eliminación del segundo tumor (T2) en 2004 a partir del lóbulo inferior izquierdo. Cinco de las mucosas de las vías respiratorias biopsias se tomaron de la carina principal (M1), parte inferior derecha (M2 y M3) y el lóbulo superior izquierdo (M4 y M5) alrededor de los sitios de tumor primario en ambos los pulmones tal como se representa. Se tomaron las biopsias de la mucosa durante el seguimiento de este paciente después de la extirpación quirúrgica del segundo tumor del lóbulo inferior izquierdo. Todos los cinco biopsias de la mucosa fueron histopatológicamente sin evidencia de displasia, y sin embargo, exhiben un rango de 3-11 mutaciones de ADNmt (Fig. 1). Se detectaron un total de 16 mutaciones en el ADNmt en la mucosa de este paciente. La primera biopsia de la carina principal exhibió 3 mutaciones de ADNmt (M1, Fig. 1A). La segunda biopsia exhibió 5 mutaciones, incluyendo 2 mutaciones se solapan con M1 (
A2249C
,
A8341C
, mismo color, Fig. 1A-B). La tercera biopsia exhibió 7 mutaciones del ADN mitocondrial, incluyendo 3 mutaciones se solapan con M2 (
A3742C
,
G8836C
y
T15982G
, mismo color, fig. 1B-C). La cuarta biopsia albergaba 7 mutaciones del ADN mitocondrial, incluyendo mutaciones se solapan con M3 (
A3742C
,
T3756C
,
G6035C
,
G8836C
y
T15402A
, mismo color, fig. 1A-D), M2 (
A3742C
,
A8341C
y
G8836C
, mismo color, Figs. 2B y D) y M1 (
A8341C
, mismo color, Fig. 1A-D). La biopsia tomada adyacente al tumor en el lóbulo inferior izquierdo exhibió 11 mutaciones de ADNmt incluyendo mutaciones superposición con M1 (
A2249C
,
T2516C
y
A8341C
), M2 (
A2249C
,
A8341C
,
G8836C
y
T15982C
), M3 (
C4014A
,
Opiniones y G8836C
T15982G
) y M4 (
G8836C
) biopsias (fig. 1A-e, de color emparejado) A8341C y
. Tanto los tumores invasivos (T1 y T2) exhibieron 20 mutaciones de ADNmt idénticos incluyendo todas las 16 mutaciones detectadas en el 5 mucosa normal circundante (Fig. 1E-F) (odds ratio de 6,9 × 10
10:01). Trece de estos 20 (65%) mutaciones estaban en regiones (COI, COII, atp6, ND1, ND4 y cytB) y 7 (35%) de codificación producido en las regiones no codificantes (12SrRNA, 16srRNA, ARNt-lisina, D-loop ) (Fig. 1, M, rectángulo inferior). Los 4 mutaciones adicionales detectados en los tumores se representan en la Fig. 1E (rectángulo de fondo, negro, subrayado). Dos (
G8836C
y
A8341C
) a tres mutaciones del ADN mitocondrial (
A2249C
,
A3742C
y
T15982G
) estaban presentes en 4/5 y 3/5 mucosa, respectivamente, y en los dos tumores (Fig. 1). fotomicrografías histológicas representativas de la mucosa y el tumor se muestran en las Figs. 1A y 1F. Los diferentes códigos de colores corresponden a un patrón de ADNmt mutado específico que muestra la propagación clonal de la mutación del ADNmt en toda la mucosa y, finalmente, dan lugar a los tumores relacionados genéticamente (Cercado).
El paciente fue operado dos veces en 2002 y 2004 con extirpación de tumores de la parte superior derecha (T1) y el lóbulo inferior izquierdo (T2), respectivamente. Se obtuvieron cinco biopsias de la mucosa de las vías respiratorias broncoscópicamente anormales siguiente segunda cirugía (T2) de este paciente de carina principal (M1), lóbulo superior derecho (M2 y M3) y el lóbulo inferior izquierdo (M3 y M4) que rodea tanto los tumores como se representa (Panel A -MI). Las biopsias de la mucosa mostraron una gama de 3-11 mutaciones de ADNmt como se representa en color diferente (Panel A-E). Las mutaciones idénticas se muestran en el mismo color en diferentes biopsias y el tumor. Un código de color diferente también se utilizó para cada mucosa para indicar la progresión clonal de las lesiones en ambos los pulmones con mutaciones de ADNmt acumulados. Representante microfotografía histológico de la mucosa y el tumor se ha mostrado en el panel A y F. Tanto los tumores T1 y T2 exhibido veinte mutaciones de ADNmt idénticos (E-F, rectángulo inferior), incluyendo todas las 16 mutaciones que presentan los cinco biopsias de la mucosa (Matched color). Las 4 mutaciones de ADNmt adicionales detectados en los tumores están representados subrayado en color negro en el rectángulo inferior (Panel E-F). Dos mutaciones del ADN mitocondrial (
G8836C
y
A8341C
) estaban presentes en 4/5 y 3 otras mutaciones (
A2249C
,
A3742C
y
T15982G
) estaban presentes en 3/5 biopsias de la mucosa. Los tumores son cercados para indicar su desarrollo a partir de los parches mucosos clonales. T1: El tumor del lóbulo superior derecho; T2: El tumor del lóbulo inferior izquierdo; M:. Mucosa
El paciente fue operado de 2005 por la extirpación quirúrgica del tumor del lóbulo superior derecho. Cinco biopsias de la mucosa de las vías respiratorias broncoscópicamente anormales se obtuvieron de carina principal (M1), el lóbulo inferior derecho (M2 y M3) y el lóbulo superior derecho (M3 y M4) que rodea los tumores como se representa (Panel A-E). Las biopsias de la mucosa mostraron una gama de 2-5 mutaciones de ADNmt como se representa en color diferente (Panel A-E). Las mutaciones idénticas se muestran en la mismo color en diferentes biopsias y el tumor. Un código de color diferente también se utilizó para cada mucosa para indicar la progresión clonal de las lesiones con las mutaciones de ADNmt acumulados. microfotografía representativa histológico del tumor y la mucosa normal se muestran en el panel A y D. Las mutaciones en el ADNmt 9 exhibido tumorales (representados en el rectángulo inferior), incluyendo todos los 8 mutaciones exhibidas por los cinco biopsias de la mucosa (mismo color). Una mutación del mtDNA adicional (
T7001C
) detectado en el tumor está subrayado en negro en el rectángulo inferior. Tumor fue cercado para indicar su desarrollo a partir de los parches mucosos clonales. M:. Mucosa
En el paciente 2, cinco biopsias de la mucosa se obtuvieron de la carina principal (M1), lóbulo inferior derecho (M2 y M3) y el lóbulo superior derecho (M3 y M4) que rodea a la primaria tumor en el pulmón derecho, como se muestra en la Figura 2. Todas las lesiones fueron 5 histopatológicamente normal, como se ve en el paciente 1, pero mostró una gama de 2-8 mutaciones de ADNmt. La primera lesión exhibió 2 mutaciones en tanto que la segunda exhibe 3 con una mutación idéntica compartido con M1 (
A10995C
, Fig. 2A-B, el color emparejado). La tercera lesión (M3) exhibió 3 mutaciones de ADNmt con una mutación de solapamiento con M2 (
A14917C
) y M1 (
G8836C
) (Fig. 2A-C, color emparejado). En la lesión sucesivamente (M4), se detectaron 3 mutaciones con una mutación superposición (
G8836C
) con M3 y M1 (Fig. 2A-D, color emparejado). La lesión de la mucosa quinta (M5) exhibió 5 mutaciones que incluyen mutaciones de M4 superposición (
A3984C
y
G8836C
), M3 (
A6831C
,
G8836C
y
A14917C
), M2 (A14917C) y M1 (
G8836C
) (Fig. 2A-e, de color emparejado). El tumor primario resecado del lóbulo superior derecho de este paciente exhibió 9 mutaciones de ADNmt incluyendo todos los 8 mutaciones detectadas en las 5 muestras de mucosa de apariencia normal de alrededor. Todas estas mutaciones (9/9) estaban en las regiones codificantes mitocondriales (ND1, COI, atp6, ND4, ND5 y cytB) del ADN mitocondrial (Fig. 2E, rectángulo inferior). La mutación adicional (
T7001C
) detectada en el tumor se muestra en la Figura 2E (rectángulo Abajo a la derecha, negro, subrayado). Una mutación del ADNmt (
G8836C
) estaba presente en 4/5 y otra mutación (A14917C) estaba presente en 3/5 muestras de tejido de la mucosa (Fig. 2). Ambas de estas mutaciones también se detectaron en el tumor correspondiente (Fig. 2E). fotomicrografías histológicas representativas de la mucosa y el tumor se muestran en la Fig. 2A y E). Los diferentes códigos de colores corresponden a un patrón de ADNmt mutado específico que muestra la propagación clonal de la mutación del ADNmt en toda la mucosa y el aumento del tiempo dado al tumor relacionado genéticamente (cercada). Cuatro mutaciones del ADN mitocondrial (
G8836C
,
T3756C
,
A3984C
y
A7251C
) fueron idénticas entre los pacientes 1 y 2 (Fig. 1-2) .
el paciente 3 era un no fumador con un carcinoma broncoalveolar y exhibió sólo 2 mutaciones de ADNmt en el tumor (Tabla 1). No mutación se detectó en la mucosa normal. Un margen con metaplasia de esta paciente también no mostró ninguna mutación de ADNmt (Tabla 1). Estos resultados sugieren una diferencia fundamental en la cancerización de campo y el alcance de los parches clonales entre un tumor no fumador. Hemos secuenciado otros 8 pacientes para la mutación del ADNmt y encontramos una gama de 1-9 mutaciones en los tumores primarios en comparación con el control, la mayoría de las cuales eran de las regiones codificantes de la ADNmt (Tabla 2). Aparte de mutaciones somáticas del ADNmt, también detectaron pocos línea germinal secuencia de ADNmt variantes en los tumores y biopsias de la mucosa de todos los pacientes (Tabla 3) correspondiente.
Alteración del contenido de ADNmt en el pulmón los pacientes de cáncer
Se realizó cuantitativa en tiempo real PCR para determinar el contenido de ADNmt en la mucosa de los pacientes, los tumores correspondientes, y los ganglios linfáticos no neoplásicas. Con sólo una única excepción en una biopsia (paciente 1, M1) contenido de ADNmt fue significativamente mayor (P & lt; 0,001) en el cáncer de pulmón y todas las biopsias de la mucosa histológicamente normal en comparación con el nodo de control de la linfa (Fig. 3). Esto fue cierto incluso en la mucosa y el margen de metaplasia identificado en el paciente 3, el no fumador (Fig. 4). contenido de ADNmt se aumentó sin una mutación del ADNmt correspondiente (Fig. 4). Por lo tanto, el aumento de contenido de ADNmt es una característica de extensos campos de la mucosa de pacientes con cáncer de pulmón para fumadores y no fumadores.
contenido de ADN mitocondrial se midió mediante multiplex PCR en tiempo real utilizando β-actina y las mitocondrias codificada en el núcleo codificada gen COI . Una proporción de COI /β-actina corresponde a la diferencia veces en comparación con el control. contenido de ADNmt aumentó significativamente (P & lt; 0,001) en las biopsias de la mucosa y los tumores correspondientes en comparación con el control normal tanto en los pacientes como se indica. N: ganglio linfático normal; M: la mucosa; T: El tumor. * P valor. & Lt; 0,05 en comparación con los ganglios linfáticos normales
contenido de ADNmt aumentó significativamente (P & lt; 0,05) en la mucosa (M), adyacente normal (NT) y en el margen metaplásico (MT) en comparación con los ganglios linfáticos normal utilizado como control.
Discusión
mutaciones
ADN mitocondrial son frecuentes en diversos tipos de tumores [3], y se detectan en las lesiones preneoplásicas indicando de este modo que se produzcan en etapas tempranas de la progresión tumoral de múltiples etapas [5]. La detección de la mutación del ADNmt es más fácil y más fiable en comparación con el ADN nuclear debido a su alto número de copias en las células del cáncer [6] - [7]. Por lo tanto, examinar mutaciones de ADNmt en un pequeño número de células en diferentes etapas de la progresión tumoral es posible. Para utilizar ADNmt mutación como una herramienta imparcial para la detección de las poblaciones de células clonales, la secuenciación de todo el genoma mitocondrial es necesario y debe hacerse junto con un control no neoplásica adecuada debido a la naturaleza altamente polimórfica de la ADNmt [7]. En el presente estudio, la amplificación de cantidad considerable de ADNmt de muy pequeñas biopsias de la mucosa, tumor y los tejidos normales correspondientes nos permitió escanear todo el genoma mitocondrial. Esto se lleva a cabo fácilmente en el alto rendimiento plataforma de secuenciación MitoChip v2.0 Affymetrix previamente demostrado ser una herramienta fiable para la detección de la mutación del ADNmt [5], [8]. Esta versión reciente de MitoChip (en comparación con MitoChip v1.0) no sólo tiene una alta sensibilidad para la detección de mutaciones que abarca la totalidad del genoma mitocondrial pero también capaz de determinar la mutación del ADNmt heteroplasmic [8] - [9]. La mutación observada también puede ser verificada por secuenciación convencional. Sin embargo, MitoChip v2.0 no puede detectar pequeña inserción /deleción ya que está diseñado principalmente para detectar la mutación de ADNmt. Las mutaciones detectadas en el presente estudio fueron la línea germinal o somática en la naturaleza y confirmados como no se debe a ninguna variación haplotypic [5], [8] - [9]. Por lo tanto, todas las mutaciones de novo de detectados y reportados en este estudio están asociados con el fenotipo tumoral.
En el caso 1, se tomaron biopsias pequeñas seguimiento de las áreas de la mucosa de las vías respiratorias que parecían anormales al autofluorescencia-broncoscopia. A pesar de todas las biopsias fueron histológicamente negativos y sin cambios displásicos, que exhiben múltiples mutaciones de ADNmt algunos de los cuales fueron compartidos a través de grandes pistas del epitelio de las vías respiratorias. Estos resultados demuestran la propagación clonal de múltiples mutaciones de ADNmt a lo largo de la mucosa respiratoria. propagación clonal de mutación p53 y alteraciones de microsatélites (LOH) y MA en focos múltiples en el epitelio bronquial apariencia normal se ha informado anteriormente [10] - [12]. En el presente estudio, dramática expansión de clones mutantes del epitelio bronquial era detectable a través de mutaciones del ADNmt con gran precisión y de una manera imparcial mediante la secuenciación de todo el genoma mitocondrial en todas las muestras
.
Es probable que las biopsias contenían parches heterogéneos de células con alteraciones clonales adquiridos por la deriva genética mitocondrial azar [7]. Al igual que en el paciente 1, la mayoría de los clones compartían una serie de mutaciones de ADNmt idénticas, además de mutaciones adicionales necesarias para la expansión clonal (Fig. 5). Los clones más aptos que albergan más ventajosas mutaciones del ADNmt /ADNn progresado a través de la mucosa y, finalmente, dio lugar a dos tumores primarios aparentemente independientes que son, sin embargo, seguramente unidos por mutaciones en el ADNmt idénticos [7], [13]. La detección de todas las mutaciones del ADN mitocondrial de la mucosa, tanto en los tumores resecados en un lapso de 2 años apoya firmemente su origen clonal. Además, también hemos demostrado que los dos tumores separados de los pulmones opuestos exhiben múltiples mutaciones de ADNmt idéntico; las probabilidades de que esto ocurra por azar son infinitamente baja. La primera tumor probablemente se desarrolló a partir de uno de los clones más dominantes dispersos en el pulmón derecho después de la adquisición de las alteraciones ADNmt /ADNn necesarias suficientes para promover la tumorigénesis. El segundo tumor probable desarrolló de la misma manera en el pulmón izquierdo pero adquirió ADNn accesos mutacionales varios meses más tarde, o de lo contrario, podría ser una metástasis pulmonar. Los datos de la paciente 2 también apoyan la extensa propagación clonal de mutaciones en el ADNmt y el desarrollo posterior del tumor después de adquirir suficiente ADN mitocondrial y /o cambios ADNn. Una alta resolución del genoma amplio análisis de estas biopsias y tumores correspondientes reveló alteración clonal de una serie de genes clave nDNA codificados en estos pacientes (observación no publicada) más el apoyo a esta noción. Sin embargo, debido a la falta de disponibilidad, no pudimos examinar la línea del espectro de alteraciones del ADNmt en un número relativamente grande de pacientes.
Posible evolución clonal de los tumores de pulmón se ha representado. Cada biopsia de la mucosa (en el círculo, M1-M5) compartió algunas mutaciones de ADNmt idénticos (mismo color) junto con mutaciones adicionales en el campo de la mucosa heterogénea. Los clones más aptos surgieron en los tumores primarios (T1-T2) con las mutaciones de ADNmt más selectivos (Total de 20 mutaciones de ADNmt, 16 fueron compartidos entre M1-M5 como en la Figura 1).
La presencia de de la línea germinal frecuente ADNmt variantes de la secuencia se sugirió como un indicador de un fondo genético de alta susceptibilidad que pueda facilitar la mutación somática concomitante en el ADNmt y nDNA [14]. La detección de la secuencia de la línea germinal clonal variantes y mutaciones somáticas del ADNmt simultáneos en los tumores y en la mucosa de los pacientes con cáncer de pulmón apoyan firmemente esta idea.
mutaciones patogénicas de ADNmt pueden indicar por su contribución funcional en la progresión de los tumores. Entre las mutaciones de ADNmt observados en estos pacientes, el G8836C (ATP6) mutación de codificación se informó recientemente en pacientes con neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL) -al igual que los tumores del síndrome y de la tiroides [15] - [16]. La conservación entre especies de este nucleótido es alta y esta mutación se ha predicho que se patógenos [15]. En particular, se detectó esta mutación del ADNmt en 8/10 biopsias de la mucosa y los 3 tumores examinados tanto de los pacientes que soportan una contribución funcional en la tumorigénesis. Sin embargo, un análisis más detallado funcional es necesaria para sacar una conclusión más definitiva. ADNmt mutación en la posición de nucleótidos idéntica entre los diferentes pacientes de cáncer de riñón y pulmón se informó anteriormente [16]. A la luz de una mutación patogénica contribuyendo /ADNmt, una mutación específica de ADNmt parece haber sido seleccionados en diferentes tipos de tumores. Hicimos la observación similar en el presente estudio y, por tanto, la aparición de la G8836C patógenos y otras mutaciones de ADNmt idéntico que se da entre los pacientes con cáncer de pulmón es poco probable que sea debido a la contaminación de la muestra. Cabe destacar que el G8836C patógena mutación del mtDNA detectó en NOHL y cáncer de tiroides [15] - [16] y con frecuencia en nuestro estudio indica un papel funcional en la progresión del cáncer de pulmón
La mayoría de estas mutaciones se encontraron en la codificación. regiones del ADNmt que potencialmente podría conducir a una interrupción del complejo respiratorio y resultar en un aumento de especies reactivas del oxígeno (ROS). Estudios recientes han demostrado que las mutaciones de ADNmt conducen a un aumento de ROS y promover el crecimiento de células tumorales, la proliferación y la metástasis [17] - [20]. Un estudio ha mostrado un aumento en el número de copias de ADNmt en fibroblastos de pulmón como un evento temprano en la respuesta al estrés oxidativo [21]. Recientemente, un aumento en el contenido de ADNmt se identificó con el envejecimiento y el tabaquismo asociado de pulmón de los tejidos y la cabeza primaria y cuello carcinomas de células escamosas [22] - [23]. biopsias de la mucosa histológicamente negativos, así los tumores de los pacientes exhibieron ambos niveles significativamente elevados de contenido de ADNmt. Por lo tanto, parece que con la evolución de la mutación del ADNmt homoplasmic y propagación clonal, el contenido de ADNmt también aumenta. Es de destacar que algunas mutaciones (incluyendo
G8836C
) eran idénticos en ambos los pacientes que eran fumadores regulares, lo que sugiere los efectos de los objetivos comunes de los carcinógenos del tabaco en el ADNmt. La alta frecuencia de mutaciones en el ADNmt entre los fumadores también sugiere un papel clave para los primeros cambios genéticos mitocondriales en la progresión de los tumores.
En el presente estudio, la progresión clonal de mucosa respiratoria histológicamente normales que aparecen en el tumor era detectable a través de ADNmt mutaciones. Este es el estudio más definitivo para demostrar que los 2 tumores en los lugares opuestos en un paciente (paciente 1) son clonal relacionada. Sin embargo, no hemos podido examinar con mayor seguimiento de los pacientes debido a la falta de especímenes biológicos. La documentación de estas extensas poblaciones clonales con mutaciones de ADNmt arroja luz sobre los retos de los enfoques de detección temprana. Por otra parte, la orientación de estas mutaciones en el ADNmt puede ser útil en la detección molecular basado en el esputo y el ADN de la sangre en los enfoques de quimioprevención y nuevas terapias biológicas. Un análisis más detallado funcional de las mutaciones del ADN mitocondrial comunes nos permitirá entender mejor su papel específico en la progresión del cáncer y quimio-resistencia.
Materiales y Métodos
historia y de pulmón muestras de los pacientes
tres pacientes con cáncer de pulmón de seguimiento se examinaron para la mutación del ADNmt con el consentimiento informado firmado en un Johns Hopkins protocolo aprobado por el IRB. Paciente 1 era una mujer de 75 años que se sometió a una lobectomía superior derecha en 2002 para una etapa IIB carcinoma de células escamosas pobremente diferenciado (T3N0MX). En 2004, se sometió a una lobectomía inferior izquierda para una segunda etapa IIB (T2N0MX) El carcinoma de células escamosas. El paciente 2 era un hombre de 58 años, quien en 2005 sufrió una lobectomía superior derecha para un estadio IA (T1N0MX) carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado. Ambos pacientes eran fumadores regulares durante más de 10 años. El paciente 3 era un paciente femenino de 48 años de edad que sufrió una lobectomía superior derecha de una etapa de carcinoma de IA (T1N0MX) bronquioloalveolar. Este paciente era un no fumador. Durante el seguimiento, la mucosa de las vías respiratorias biopsias fueron tomadas de las áreas sospechosas de leve a moderada de displasia severa o carcinoma in situ (CIS) sobre la base de autofluorescencia-broncoscopia (R.Y. y J. B.). Todas las muestras de biopsia se tomaron al mismo tiempo. Las biopsias fueron evaluados histológicamente por un patólogo pulmonar (W.H.W). Los tumores de pulmón resecado quirúrgicamente también se obtuvieron de cada paciente. Como control, ganglio linfático normal correspondiente libres de tumor se utilizó en cada caso. Además, también se correspondía con secuenciaron los tejidos normales y tumorales de otros 8 pacientes con cáncer de pulmón (Tabla 4).
toda la amplificación del genoma mitocondrial y secuenciación
se extrajo
El ADN genómico de acuerdo con nuestra protocolo estándar a partir de los tejidos tumorales microdissected y otros especímenes [5]. Amplificamos ADN genómico mitocondrial entero de 10 ng de molde de ADN genómico utilizando REPLI-g kit de amplificación de ADN mitocondrial de acuerdo con el protocolo del fabricante tal como se describe anteriormente [8]. El ADN amplificado se purificó usando ADN MINIAMP limpieza kit (Qiagen, Valencia). Se examinó la pureza del ADNmt amplificado y la contaminación de ADN nuclear por análisis de PCR usando el cebador específico para las mitocondrias codificados COXI /COXII y β-actina codificado nuclear. Cuatro a quinientos nanogramos de ADN mitocondrial purificada se usó para la secuenciación en la plataforma Affymetrix MitochipV2.0 [5], [8].
MitoChip v2.0 serie de análisis de secuenciación
Se realizó la fragmentación, etiquetado y chip hibridación del ADNmt según el protocolo Affymetrix con controles apropiados como se describe anteriormente [5], [8]. El análisis de datos se realizó utilizando el software de Affymetrix GSEQ y se utilizó la Secuencia de Referencia de Cambridge Revisada (RCRS) como secuencia de referencia [24]. El software MitoAnalyzer también se utilizó para verificar las mutaciones de ADNmt en diferentes posiciones de nucleótidos como se describe anteriormente [5], [8] mutaciones .Somatic se identificaron como los cambios de pares de bases en el ADNmt en comparación con la secuencia de ADNmt normal que se encuentra en los ganglios linfáticos libres de tumor. mutaciones de la línea germinal se identificaron como los cambios de pares de bases presentes en los linfocitos normales, así como los tejidos tumorales y /o muestras de margen en comparación con el RCRS [14]. Una variante de la secuencia de la línea germinal fue designado nuevo cuando ausente en la base de datos mitocondrial humano y otros estudios pertinentes en las mismas haplogrupos [14], [25]. Variantes de secuencias se informó anteriormente en diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer se designan como patógenos [14], [25].
Cuantitativo PCR en tiempo real
Para examinar el contenido de ADNmt, se utilizó el sistema de detección de secuencia 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) para amplificar el ADN nuclear (ADNn) codificada β-actina y la ADNmt codificada citocromo c oxidasa I (COI), utilizando la plantilla de ADN genómico como se describe [26].
anterior análisis estadístico
de Student
t-test
se realizó para determinar la significación estadística. valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo. Todos los valores de p fueron generados a dos caras.
Odds ratio
Las probabilidades de 20 mutaciones de ADNmt idénticos aleatorios que ocurren por azar en dos tumores independientes localizadas en los pulmones opuestos de un mismo paciente se calcularon como [ ,,,0],(el tamaño del genoma) × (mutaciones)] x [(tamaño del genoma) × (mutaciones)], es decir [16,499:1 × 20] x [16,499:1 × 20] = 6,9 × 10
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