Extracto
Los niveles de expresión y regulatorio papeles de miR-497 en el cáncer de páncreas no están claros. El valor clínico de plasma similar a la insulina factor de crecimiento 1 receptor (IGF-1R) en los cánceres de páncreas no se ha investigado. En el presente estudio, hemos demostrado que el miR-497 se downregulated significativamente en los tejidos de cáncer de páncreas. La regulación positiva de miR-497 en AsPC-1 líneas celulares de cáncer pancreático BxPC-3 y inhibió la proliferación, aumento de la apoptosis, las células a la gemcitabina re-sensibilizado y suprimió el IGF-1R y la expresión de p-AKT través de la regulación negativa directa de expresión de la proteína IGF-1R. No se observaron efectos opuestos después de la regulación a la baja de miR-497. Los niveles plasmáticos de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas aumentaron significativamente, en comparación con la de los pacientes con pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos y tumores neuroendocrinos pancreáticos (
P = 0,006
,
P = 0,018 Opiniones y
P = 0,004
, respectivamente), y se muestran los valores posibles para distinguir las lesiones pancreáticas. Sin embargo, los niveles en pacientes con cáncer pancreático eran comparables a la de voluntarios sanos (
P = 0,095
). La etapa localizaciones tumorales y TNM se asociaron con niveles plasmáticos de IGF-1R (
P = 0,013 Opiniones y
P = 0,01
, respectivamente). No hubo diferencia significativa de la supervivencia global entre los grupos de expresión altos y bajos de IGF-1R. En conclusión, hemos demostrado que el miR-497 atenuó la malignidad de las células de cáncer de páncreas y promueve la sensibilidad de las células a la gemcitabina por directamente regulación a la baja de la expresión de IGF-1R. Plasma de IGF-1R visualiza un valor potencial para distinguir las lesiones pancreáticas y podría ser un nuevo biomarcador para guiar el estadio TNM del cáncer de páncreas
Visto:. Xu JW, Wang TX, Usted L, Zheng LF, Shu H, Zhang TP, et al. Factor (2014) de crecimiento tipo insulina 1 receptor (IGF-1R) como un objetivo de miR-497 y plasma de IGF-1R niveles asociados con el estadio TNM del cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10.1371 /journal.pone.0092847
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2013; Aceptado: 27 Febrero 2014; Publicado: 25 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81272484, 81141027), Fundación de Ciencias Naturales Pekín (Nº 7132179), Fundación de Ciencias Naturales Municipal de Beijing (7.100.003) y el Fondo Especial de Investigación para la Industria de Bienestar público de Salud ( 201 202 007). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es una enfermedad agresiva y devastadora. PDAC tiene un pronóstico extremadamente precario con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 5% [1]. Aunque los mecanismos de la carcinogénesis pancreática, los nuevos marcadores para la detección precoz y las nuevas estrategias terapéuticas han sido ampliamente investigado [2], [3], [4], la supervivencia global no se ha mejorado en los últimos 80 años [5] . Los mecanismos moleculares de la progresión de la PDAC, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la resistencia a los medicamentos, no están claros.
MiRNAs son cortos no codificante ARN, que pueden inhibir la traducción de ARN mensajero (ARNm) en la proteína de unión a la región 3 'no traducida (3' UTR). MiRNAs pueden actuar como oncogenes o supresores tumorales en la regulación de la carcinogénesis, la capacidad metastásica y la resistencia a los medicamentos [6]. Regulación a la baja de miR-497 se ha observado en mama, colorrectal y de cuello uterino [7], [8], [9]. Sin embargo, no hay ningún informe acerca de miR-497 niveles de expresión en el cáncer de páncreas en la actualidad. Similar a la insulina factor de crecimiento 1 del receptor (IGF-1R) fue identificado como un objetivo de miR-497. Regulación a la baja de miR-497 contribuye a la malignidad del cáncer colorrectal y cáncer de cuello uterino mediante la regulación positiva de IGF-1R [8], [9]. Sin embargo, las funciones de regulación y mecanismos de miR-497 en el cáncer de páncreas aún no están claros.
IGF-1R es un receptor tirosina quinasa, que consiste en la regulación de la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la transformación maligna de las células cancerosas [10]. La regulación positiva de IGF-1R en los tejidos humanos PDAC ha informado [11] y se asocia con un mayor grado tumoral y la supervivencia de los pobres [12]. Sin embargo, los niveles plasmáticos de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas no se detectaron en los estudios anteriores. Los valores clínicos de plasma de IGF-1R en el cáncer de páncreas son desconocidos.
En el presente estudio, encontramos que el miR-497 se downregulated significativamente en los tejidos de cáncer de páncreas. La regulación positiva de miR-497 inhibió la proliferación, aumento de la apoptosis y promueve la sensibilidad a la gemcitabina través de la regulación negativa de la expresión directa de IGF-1R en las células cancerosas PDAC
in vitro
. También puso de manifiesto que los niveles de plasma de IGF-1R en pacientes con cáncer pancreático fueron comparables a la de los voluntarios sanos, pero más alta que en los pacientes con pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos y tumores neuroendocrinos pancreáticos, y se muestran los valores para distinguir las lesiones pancreáticas. La etapa localizaciones tumorales y TNM se asociaron con niveles plasmáticos de IGF-1R. No hubo una diferencia significativa de la supervivencia global entre los grupos de alta y baja expresión de IGF-1R.
Métodos
Declaración de Ética
Los estudios se llevaron a cabo de conformidad con la aprobación ética de la Juntas de Revisión institucional del hospital Médico Unión de Pekín universidad. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos.
La detección de la expresión de miR-497 mediante hibridación in situ (ISH): perfil
10, cáncer de páncreas especímenes incluidos en parafina fijado en formol e igualado a tumores tejidos adyacentes se obtuvieron y se convierte en microarrays de tejidos. Los niveles de expresión de miR-497 en los tejidos fueron detectados utilizando sonda de detección miRCURY LNA para miR-497 (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca, el número del producto: 38256-15). ISH se realizó de la siguiente descripción. Brevemente, los portaobjetos se incubaron a 37 ° C durante 30 min, desparafinaron en xileno, y rehidratada con lavados de alcohol graduadas. A continuación, los portaobjetos se colocan en 4% de paraformaldehído durante 20 min en una campana de extracción, y después se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces. Los portaobjetos se trataron a continuación con 15 g /ml de proteinasa K durante 15 min a temperatura ambiente. A partir de entonces, se lava los portaobjetos con PBS y los fija en 4% de paraformaldehído durante 15 min después de eso. Después de enjuagar, los portaobjetos se pre-hibridaron con tampón de hibridación durante 1 hora a la habitación 50 ° C y luego se hibridaron durante la noche a 4 ° C en el tampón de hibridación que contiene la sonda. lavados astringentes se realizaron a 50 ° C durante 20 min, y a continuación, los portaobjetos se incubaron en una solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron en solución de bloqueo con el fragmento Fab anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina durante la noche a 4 ° C. La reacción de detección colorimétrica se realizó usando el kit de NBT /BCIP (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados de ISH se registraron como el porcentaje de células positivas.
Cultivo de células y reactivos
BxPC-3 y AsPC-1 líneas celulares PDAC fueron amablemente proporcionados por el profesor Helmut Freiss (Universidad de Heidelberg, Alemania ), que obtiene de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. células PDAC se cultivaron en un incubador humidificado con 5% de CO2 a 37 ° C en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de plasma fetal bovino (FBS, Hyclone). Los anticuerpos primarios fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología, incluyendo IGF-I receptor β (D23H3) XP Conejo MAB (# 9750), β-actina (13E5) Conejo MAB (# 4970), fosfo-Akt (Ser473) (D9E) XPRabbit mAB (# 4060), Akt (pan) (11E7) conejo mAB (# 4685), caspasa-3 de anticuerpos (# 9662) y PARP anticuerpos (# 9542).
Mirna transfección
miR-497 imita (5'-CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 ', 5'-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3'), el control imita (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'), inhibidor de miR-497 (5 ' ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 ') y el inhibidor de control (5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3') fueron sintetizados por Genepharma (Shanghai, china). MiRNAs en 50 a 100 nM fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
celular extracción de RNA y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
Las células fueron transfectadas en placas de 6 pocillos. Después de 48 horas de la transfección, el ARN total fue extraído por medio de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para IGF-1R ensayo cuantitativo, el ARN total se transcribió de forma inversa usando el kit de transcripción inversa (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando el SYBR Green Master Mix (Takara, Japón). GAPDH se sirvió como control endógeno
IGF-1R Cebador directo:. TCTGGCTTGATTGGTCTGGC 5'-3 '
Cebador inverso
: 5'-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3'
GAPDH cebador directo: 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ', España
cebador inverso: 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'
En el miR-497 ensayo cuantitativo, se usó un ensayo TaqMan miARN de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). U6 se utilizó como control endógeno. Plegables cambios se calcularon utilizando el 2
-ΔΔCT método.
Análisis de proliferación
in vitro
proliferación se analizó utilizando un kit de recuento de células (CCK-8). BxPC-3 células y células AsPC-1 fueron transfectadas en placas de 6 pocillos (5 x 10
5cells /pocillo). Después de 24 horas, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos (1000 células /pocillo). 10 l /pocillo CCK-8 reactivo se añadió a 0, 24, 48, 72 horas, respectivamente, y se incubaron durante 2,5 horas a 37 ° C. La densidad óptica (DO) se midió a 450 nm y 630 nm mediante un lector de microplacas (Wellscan MK3, Thermo /Labsystems, Finlandia).
Análisis Quimiosensibilidad
células
BxPC-3 y AsPC-1 fueron transfectadas durante 24 horas, en placas de 96 pocillos (4000 células /pocillo), y se trató con gemcitabina diluido en serie (Eli Lilly and Company) por triplicado. Después de 48 horas de incubación, se añadió 10 l /pocillo de reactivo CCK-8 y se incubó durante 2,5 horas a 37 ° C. La densidad óptica (OD) se midió a 450 nm y 630 nm usando un lector de microplacas.
Western blotting
Después de 48 horas de la transfección en placas de 6 pocillos, las células fueron digeridos con solución de tripsina y se lisaron con tampón RIPA (Applygen, Pekín). Las proteínas totales se separaron por electroforesis con dodecilsulfato sódico en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a un difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Billerica, MA). Después del bloqueo con leche en polvo no grasa 5% a temperatura ambiente durante 1 hora, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios. A continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa (Applygen, Pekín) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las bandas de proteínas se visualizaron con echochemiluminescence (ECL) sistema de detección, y los niveles de expresión de estas proteínas se evaluaron utilizando Image-Pro Plus 6.0 del software (Media Cybernetics, EE.UU.).
ensayo indicador de luciferasa Dual-
Los vectores PMIR-RB-Informe-IGF-1R-3'-UTR que contienen tipo salvaje o secuencia diana mutado se construyeron mediante RiboBio Co., Ltd. (Guangzhou, china). BxPC-3 células se sembraron en placas de 12 pocillos (1 x 10
5 células /pocillo) y co-transfectadas con el miR-497 imita y vectores que expresan secuencia diana mutado, o co-transfectadas con mímica y vectores que expresan objetivo de tipo salvaje secuencia usando lipofectamina 2000. Después de la transfección durante 48 horas, se midió la actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
pacientes y plasma IGF-1R expresión
Las muestras de plasma se obtuvieron de 42 pacientes con cáncer de páncreas. Plasma muestras de pacientes con otros tumores pancreáticos (29 pacientes, incluyendo cistoadenoma seroso (7 casos), cistoadenoma mucinoso (8 casos), tumor sólido pseudopapilar (10 casos) y la neoplasia mucinosa papilar intraductal (4 casos)), la pancreatitis crónica ( CP, 19 pacientes), tumor neuroendocrino pancreático (PNET, 19 pacientes) y en voluntarios sanos (30 casos) se recogieron como controles. El cáncer de páncreas, PNET y otros tumores pancreáticos fueron diagnosticados mediante el examen patológico. CP fue diagnosticada de acuerdo con los criterios de diagnóstico clínico. Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 3000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 minutos. El plasma se recogió y se almacenó a -80 ° C antes de su uso. Los niveles plasmáticos de IGF-1R se detectaron utilizando IGF-1R Kit ELISA (número de catálogo: CSB-E13766h, CUSABIO, China). Siguiendo el protocolo de los fabricantes
El análisis estadístico
SPSS v.13.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL) fue utilizado para los análisis estadísticos. Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y se compararon mediante análisis de varianza (ANOVA), estudiante de
t
prueba o la U de Mann-Whitney
T
prueba. Los datos categóricos se presentan como porcentaje y se compararon mediante un Pearson χ
2 o la prueba exacta de Fisher cuando los recuentos de células fueron & lt; 5. El método de Kaplan-Meier se utilizó para el análisis de supervivencia utilizando la prueba de log-rank. La significación estadística se definió como
P & lt; 0.05
.
Resultados
miR-497 se downregulated en los tejidos de cáncer de páncreas
se detectaron niveles de miR-497 en 10 muestras de cáncer de páncreas y tejidos de tumores adyacentes emparejados mediante ISH. El porcentaje medio de células positivas en los tejidos de cáncer de páncreas fue 30.0% ± 35.4%, lo que fue significativamente menor que en los tejidos de tumor adyacente (93.5.0% ± 2,4%) (
P = 0,000
). ( Figura 1)
miR-497 niveles en tejidos pancreáticos se detectaron mediante ISH (200 ×). (A) Control negativo. (B) ISH de miR-497 en el tejido de cáncer de páncreas. (C) ISH de miR-497 en el tejido tumoral adyacente. (D) El porcentaje medio de células positivas en los tejidos de cáncer de páncreas fue 30.0% ± 35.4%, lo que fue significativamente menor que en los tejidos de tumor adyacente (93.5.0% ± 2,4%). Los datos se muestran como media ± desviación estándar.
miR-497 inhibió la proliferación
Después de 48 horas de la transfección con el miR-497 imita o inhibidor, los niveles de miR-497 se upregulated significativamente o downregulated (Figura S1 A, B). Por otra parte, el miR-497 regulación al alza la proliferación de las células, inhibió la PDAC (Figura 2 A, B). Por el contrario, miR-497 downregulation promovió la proliferación (Figura 2 C, D).
La proliferación se analizó por CCK-8 ensayo. (A, B) Transfección con miR-497 imita suprimida células PDAC proliferación en AsPC-1 y células BxPC-3, respectivamente. (C, D) La transfección con el inhibidor de miR-497 promueve la proliferación de células PDAC. (*
P Hotel & lt;
0,05
) guía empresas
miR-497 promovido la sensibilidad a la gemcitabina
Después del tratamiento con gemcitabina durante 48 horas, la. las tasas de inhibición de las células transfectadas con PDAC miR-497 imita fueron significativamente mayores que las células transfectadas con el control imita (Figura 3 A, B). Las células transfectadas con miR-497 inhibidor eran más resistentes al tratamiento gemcitabina que las células transfectadas con el control inhibidor. (Figura 3 A, C).
células (A) AsPC-1 fueron transfectadas durante 24 horas, y luego tratados con 100 nM de gemcitabina durante 48 horas. La regulación positiva de miR-497 mediante transfección de células imita re-sensibiliza a la gemcitabina. Regulación a la baja de miR-497 por transfección de inhibidor de la disminución de la sensibilidad de las células a la gemcitabina. Se transfectaron (B) BxPC-3 células durante 24 horas, y se trataron con gemcitabina diluido en serie (1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM). Las células transfectadas con miR-497 imita eran más sensibles a la gemcitabina. (C) Las células transfectadas con inhibidor de miR-497 eran más resistentes a la gemcitabina. (*
P Hotel & lt;
0,05
).
miR-497 aumentó la expresión de la caspasa-3 y PARP escindido activado por gemcitabina
La caspasa-3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) son esenciales para la apoptosis. Las células transfectadas se trataron con gemcitabina durante 48 horas, y después se detectaron los niveles de PARP escindida de caspasa-3 y por el Western Blot. Se encontró que la regulación al alza de miR-497 aumentó los niveles de caspasa-3 y PARP escindido escindido (Figura 4 A, B, Figura S2). Por el contrario, regulación a la baja de miR-497 disminuyó los niveles de caspasa-3 y PARP escindida escindido. (Figura 4 A, B, Figura S2).
Las células fueron transfectadas en placas de 6 pocillos. A las 24 horas después de la transfección, las células AsPC-1 y BxPC-3 fueron tratados con 10 M y 10 nM gemcitabina, respectivamente. Después de 48 horas adicionales, se recogieron las células y se extrajo la proteína total. (A) La regulación positiva de miR-497 mediante transfección de imita en AsPC-1 en las células incremento en la expresión de la caspasa-3 escinde y PARP, mientras que la inhibición de miR-497 mediante transfección de inhibidor de la disminución de la expresión de la caspasa-3 escinde y PARP, sin ningún efecto sobre los niveles de total de la caspasa-3 y PARP. No se observaron (B) Los mismos resultados en BxPC-3 células.
miR-497 suprime la expresión de la proteína IGF-1R mediante la unión a la 3'-UTR
De acuerdo con la predicción de bases de datos de libre acceso (TargetScan, metas, miRBase PicTarget, microRNA.org), IGF-1R fue considerado como un candidato objetivo de miR-497. Para confirmar esta predicción, se realizó un ensayo indicador de luciferasa. Hemos encontrado actividad de la luciferasa se redujo significativamente después de la co-transfección de miR-497 imita y vectores que expresan secuencia diana de tipo salvaje en BxPC-3 células, en comparación con la de las células co-transfectadas con imita y vectores que expresan secuencia diana mutado (
P & lt ; 0,05
) (Figura 5A). Estos hallazgos indican que el IGF-1R era un objetivo directo de miR-497.
(A) actividad de luciferasa relativa se redujo significativamente después de la co-transfección de miR-497 imita y vectores que expresan secuencia diana de tipo salvaje en BxPC- 3 células, en comparación con la de las células co-transfectadas con vectores que expresan imita y secuencia diana mutado. (*
P Hotel & lt;
0,05
). (B) Los niveles de ARNm de IGF-1R se detectaron mediante qRT-PCR. GAPDH se sirve como un control interno. La transfección con imita en BxPC-3 células no suprimió la expresión de IGF-1R mRNA. se detectaron (C) Los niveles de expresión de IGF-1R, p-AKT y AKT. β-actina se utilizó como control interno. Upregulation de miR-497 por transfección de imita en ASPC-1cells inhibió significativamente los niveles de IGF-1R y p-AKT, mientras que la regulación por disminución de miR-497 por transfección de inhibidor de aumento de los niveles de IGF-1R y p-AKT, sin ningún efecto sobre los niveles de AKT total. (D) Los mismos resultados se muestran en BxPC-3 células.
Para confirmar aún más, se realizó el Western Blot. Se encontró que la regulación positiva de miR-497 suprimió la expresión de la proteína IGF-1R sin ningún cambio en la expresión de ARNm de IGF-1R (Figura 5 B, C, D, Figura S3). En contraste, la regulación negativa de miR-497 aumentó la expresión de proteína IGF-1R (Figura 5 C, D, Figura S3). Además, se investigó el nivel de p-AKT mediada por IGF-1R. Hemos observado que el nivel de p-AKT disminuyó significativamente después de la regulación positiva de miR-497. Por el contrario, la inhibición de miR-497 aumentó el nivel de p-AKT (
P & lt; 0,05)
. (Figura 5 C, D, Figura S3): perfil
Los niveles plasmáticos de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas
Los niveles plasmáticos de IGF-1R fueron detectados por ELISA. Los niveles plasmáticos de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas, pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos, PNET y voluntarios sanos fueron 0,823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0.562 ± 0,3 ng /ml, 0,460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml, respectivamente. Los niveles en pacientes con cáncer de páncreas aumentaron significativamente, en comparación con la de los pacientes con pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos y PNET (
P = 0,006
,
P = 0,018
, y
P = 0.004
, respectivamente.). No hubo diferencia significativa de los niveles de IGF-1R en plasma entre los pacientes con cáncer de páncreas y voluntarios sanos (
P = 0,095
). (Figura 6).
Los niveles plasmáticos de IGF-1R fueron detectados por ELISA. Los niveles de plasma de IGF-1R en pacientes con cáncer pancreático eran comparables a la de voluntarios sanos, pero más alta que en pacientes con pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos y PNET. Otros tumores pancreáticos incluyen cistoadenoma seroso, cistoadenoma mucinoso, tumor sólido pseudopapilar e intra-ductal neoplasia mucinosa papilar. PNET, tumores neuroendocrinos pancreáticos.
El valor diagnóstico de plasma de IGF-1R
Se evaluó el valor diagnóstico de plasma de IGF-1R mediante curva ROC. Hemos demostrado que el plasma de IGF-1R muestra un valor para distinguir el cáncer de páncreas de pancreatitis crónica y PNET (AUC = 0,713; IC del 95%: 0,564-0,862,
P = 0,008
; AUC = 0,711; IC del 95%: 0,581 a 0,840,
P = 0,009
, respectivamente). Cuando el valor de corte definida en 0.257 ng /ml, la sensibilidad y especificidad para distinguir el cáncer de páncreas con pancreatitis crónica fueron 95,2% y 47,3%. Cuando el valor de corte definido a 0,699 ng /ml, la sensibilidad y especificidad para distinguir el cáncer de páncreas desde PNET fueron 47,6% y 89,5%. Plasma de IGF-1R también podría ser utilizado para diferenciar el cáncer de páncreas de otros tumores pancreáticos (AUC = 0,634, IC del 95%: 0.504-0.763,
P = 0,057
). Cuando el valor de corte definido a 0.925 ng /ml, la sensibilidad y especificidad para diferenciar el cáncer de páncreas tumores benignos de páncreas fueron de 33.3% y 89.7%.
La correlación entre los niveles plasmáticos de IGF-1R y los parámetros clínico-patológicos y supervivencia el análisis
los pacientes se dividieron en grupos de alto y bajo de expresión utilizando la 75
percentil de los niveles plasmáticos de IGF-1R. localizaciones tumorales y el estadio TNM se asociaron con niveles plasmáticos de IGF-1R (
P = 0,013
,
P = 0,01
, respectivamente. Tabla 1). El tiempo medio de supervivencia fue de 18 meses, y la posición 1, 3 años las tasas de supervivencia fueron del 64% y 23,1%, respectivamente. La mediana del tiempo de supervivencia en los grupos de alto y bajo de expresión eran 11 y 18 meses, respectivamente. No se observó ninguna diferencia significativa de la supervivencia global entre los grupos de alta y baja expresión (
P = 0,366
).
Discusión
La disminución de la expresión de miR-497 ha sido demostrado en la mama, colorrectal y de cuello uterino [7], [8], [9]. Sin embargo, no hay ningún informe acerca de miR-497 niveles de expresión en tejidos de cáncer de páncreas. La regulación positiva de miR-497 puede suprimir la proliferación de células de cáncer, la promoción de la apoptosis, disminución de las capacidades de migración y la invasión y aumentar la quimiosensibilidad [16], [17], [9]. Sin embargo, las funciones y mecanismos de miR-497 en el cáncer de páncreas sigue siendo desconocido. En el presente estudio, mostramos el miR-497 se downregulated significativamente en los tejidos de cáncer de páncreas. La regulación positiva de las células inhibidas miR-497 proliferación, aumento de la apoptosis y promueve la sensibilidad a la gemcitabina por la regulación negativa de la expresión de proteínas directamente IGF-1R.
Nuestro estudio identificó el papel de miR-497 en la regulación de la malignidad del cáncer de páncreas. Los resultados apoyaron miR-497 inhibe las células cancerosas que la proliferación, así como la muerte y el aumento de la quimiosensibilidad, según lo informado por la literatura [9], [16], [17].
A continuación, se investigaron los mecanismos de miR-497 en la regulación de la progresión del cáncer de páncreas. Encontramos IGF-1R era un objetivo directo de miR-497 mediante un ensayo indicador de luciferasa, que también se informó en los cánceres colorrectales y cáncer de cuello uterino [8], [9]. También se realizó el Western Blot para la confirmación adicional. Hemos demostrado que la regulación al alza de miR-497 disminuyó los niveles de proteína IGF-1R sin ningún cambio en la expresión del ARNm. Regulación a la baja de miR-497 aumentó los niveles de proteína IGF-1R. Además, se determinó la expresión de IGF-1R mediada aguas abajo molecular. Nos pareció que el nivel de p-AKT disminuyó significativamente después de la regulación positiva de miR-497. La inhibición de miR-497 aumentó la expresión de p-AKT. Por lo tanto, se especuló que el miR-497 atenúa la malignidad del cáncer de páncreas en parte por la supresión de IGF-1R /AKT.
IGF-1R /AKT se ha identificado involucrar en la regulación de múltiples procesos biológicos de los cánceres [18], [19]. AKT puede activar BAD por la fosforilación de Ser136 [20] o activar NF-kB a través de la regulación de I? B quinasa (IKK) [21], por tanto, produce efectos anti-apoptóticos. vía AKT también implica en la quimiorresistencia. inhibición AKT2 abroga la activación inducida por gemcitabina de AKT2 y NF-kappa B, y mejora la gemcitabina inducida PUMA (modulador de p53-upregulated de apoptosis) upregulation, resultando en quimiosensibilización de los cánceres pancreáticos a gemcitabina [22]. De acuerdo con estos estudios, nuestros datos indican que la inhibición de IGF-1R vía /AKT podría explicar en parte los efectos de miR-497 en las células de cáncer de páncreas. Sin embargo, el miR-497 también puede atenuar la malignidad del cáncer mediante la regulación de otros objetivos, tales como TARBP2, Dicer, BCL2, CCND1, CCNE1, CDC25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].
El aumento de la expresión de IGF-1R se ha encontrado en muchos tipos de cáncer [26] y muestra los valores de pronóstico [27]. Alta expresión de IGF-1R en los tejidos humanos PDAC También se ha informado [11] y se asocia con un mayor grado tumoral y la supervivencia de los pobres [12]. Sin embargo, no se han detectado niveles de plasma de IGF-1R en pacientes con cáncer pancreático. Nuestro estudio demostró que los niveles de plasma de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas aumentaron significativamente, en comparación con la de los pacientes con pancreatitis crónica, otros tumores pancreáticos y PNET. Pero no hubo una diferencia significativa de los niveles de plasma de IGF-1R entre los pacientes de cáncer de páncreas y en voluntarios sanos, lo que podría ser dilucidado en parte por que el IGF-1R se expresa generalmente en tejidos normales, tales como el hígado, el endometrio y las células neuronales [28]. El valor de plasma de IGF-1R en el diagnóstico de cáncer de páncreas se evaluó en el estudio actual. Hubo un valor potencial para distinguir el cáncer de páncreas con pancreatitis crónica, PNET y otros tumores pancreáticos. Sin embargo, la sensibilidad o especificidad de diagnóstico no era perfecto, se necesitan grandes detecciones de muestra para identificar aún más el valor diagnóstico de plasma de IGF-1R.
estadio TNM se asoció con niveles plasmáticos de IGF-1R en nuestro estudio. Los pacientes con tumores en estadios avanzados tenían altos niveles de plasma de IGF-1R. Plasma de IGF-1R podría ser un nuevo biomarcador para guiar el estadio TNM del cáncer de páncreas. Sorprendentemente, la alta expresión de plasma de IGF-1R no era un factor pronóstico adverso en el presente estudio.
Conclusión
miR-497 se downregulated significativamente en los tejidos de cáncer de páncreas. La regulación positiva de miR-497 suprime la malignidad del cáncer de páncreas y re-sensibilizado células PDAC a la gemcitabina mediante la regulación negativa directa expresión de la proteína IGF-1R. Los niveles plasmáticos de IGF-1R en pacientes con cáncer de páncreas aumentaron, y se muestran los valores posibles para distinguir las lesiones pancreáticas. IGF-1R podría ser también un nuevo biomarcador de plasma para guiar el estadio TNM del cáncer de páncreas.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El nivel de expresión de miR-497 después de la transfección de imita o inhibidor. la expresión de miR-497 fue detectado por QRT-PCR. U6 se sirve como un control interno. (A) BxPC-3 células transfectadas con miR-497 imita mostró un aumento en la expresión de miR-497. (B) Las células transfectadas con inhibidor de miR-497 mostraron una disminución en la expresión de miR-497. Los datos se muestran como media ± desviación estándar. (*
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doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s001 gratis (TIF)
figura S2.
niveles relativos de expresión de la caspasa-3 y PARP escindido. Los datos se muestran como media ± desviación estándar. (A) Los niveles relativos de expresión de proteínas en células AsPC-1. (B) Los niveles relativos de expresión de proteínas en BxPC-3 células. (*
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doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
niveles relativos de expresión de IGF-1R y p-AKT. los niveles relativos de expresión se muestran como media ± desviación estándar. (A) Los niveles relativos de IGF-1R y p-AKT en las células AsPC-1. (B) Los niveles relativos de proteínas en BxPC-3 células. (*
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doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s003 gratis (TIF)