Extracto
La resistencia a fármacos es un obstáculo para el tratamiento eficaz del cáncer de ovario. Nosotros y otros han demostrado que la vía de señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) es un objetivo potencial novela para superar la resistencia de drogas. El propósito de este estudio fue validar IGF-2 como una posible diana terapéutica en el cáncer de ovario resistente a los medicamentos y para determinar la eficacia de la orientación IGF-2
in vivo
. Un análisis de los datos del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) en la cohorte serosa cáncer de ovario mostró que la expresión de ARNm de alta IGF-2 se asocia significativamente con acortar el intervalo hasta la progresión de la enfermedad y la muerte, los indicadores clínicos de resistencia a los medicamentos. En un panel genéticamente diversa de líneas celulares de cáncer de ovario, se encontró que los niveles de ARNm de IGF2 mide en líneas celulares resistentes a varios agentes estabilizadores de microtúbulos incluyendo Taxol a ser significativamente elevada en comparación con las líneas de células sensibles a fármacos. El efecto del IGF-2 caída en la resistencia a Taxol fue investigado
in vitro
y
in vivo
. Transient knockdown IGF2 sensibilizado significativamente las células resistentes a fármacos para tratamiento con taxol. A ovario modelo de xenoinjerto de cáncer de Taxol resistente, desarrollado a partir de las células HEY-T30, exhibió resistencia a los medicamentos extremo, en el que la dosis máxima tolerada de Taxol no retrasó el crecimiento tumoral en ratones. El bloqueo de la IGF1R (un receptor transmembrana que transmite señales de IGF1 y IGF2) utilizando un anticuerpo monoclonal no alteró la respuesta a Taxol. Sin embargo, IGF2 estables desmontables utilizando ARN-horquilla corta en HEY-T30 restaurado sensibilidad de forma eficaz Taxol. Estos resultados validan IGF-2 como una posible diana terapéutica en el cáncer de ovario resistente a los medicamentos y muestran que la orientación directa IGF-2 puede ser una estrategia preferible en comparación con la orientación IGF1R sola
Visto:. Brouwer-Visser J, Lee J, K McCullagh, Cossio MJ, Wang Y, Huang GS (2014) Similar a la insulina Factor de Crecimiento 2 El silenciamiento Restaura Taxol sensibilidad resistente a los medicamentos en el cáncer ovárico. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10.1371 /journal.pone.0100165
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Febrero, 2014; Aceptado: 22 de mayo de 2014; Publicado: 16 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Brouwer-Visser et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda fue proporcionada por el Instituto Nacional-Instituto Nacional del cáncer de Salud infantil y Desarrollo humano (K12 HD00849) y el Congreso americano de Obstetras y Ginecólogos a través de la adjudicación del Programa de Desarrollo Científico para la reproducción de GSH. Los autores reconocen el uso de los Einstein Cancer Center de recursos compartidos Albert (Citometría de Flujo Core, Histología y Patología Comparada Core), apoyados por la subvención P30CA013330 Soporte Centro Nacional del Cáncer Cancer Institute. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en los Estados Unidos. Desde mediados de la década de 1990, el tratamiento estándar para el cáncer de ovario es la citorreducción quirúrgica y la quimioterapia sistémica, por lo general taxol y platino [1]. Sin embargo, la mayoría de los pacientes finalmente sucumben a recurrente, enfermedad progresiva debido a la resistencia a la quimioterapia
Además de sus papeles bien establecidos en el desarrollo y el crecimiento, el envejecimiento, y la carcinogénesis [2] - [6]., la vía de señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) ha sido recientemente implicada en la resistencia a fármacos [7] - [11]. Como se informó anteriormente, la regulación al alza del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2) es una respuesta celular aguda al tratamiento con taxol, y su expresión modula la respuesta a Taxol en líneas celulares de cáncer de ovario resistentes a los fármacos. [7]. Dado que el Taxol se utiliza en el tratamiento de primera línea del cáncer de ovario, la hipótesis de que la alta IGF-2 podría estar asociada con la resistencia a fármacos intrínseca clínica, que se manifiesta como una disminución de tiempo de progresión de la enfermedad /recurrencia en los pacientes. En apoyo de esta hipótesis, nuestro estudio anterior que utiliza un enfoque de microarrays de tejidos indicó que la expresión de alto IGF-2 en el tejido tumoral de ovario era en efecto predictivo de acortar el intervalo hasta la progresión /recidiva.
Sobre la base de estos datos clínicos y de laboratorio, se determinó que IGF2 es una posible diana terapéutica para mejorar la resistencia a fármacos en cáncer de ovario, pero hasta donde sabemos, no antes de
in vivo se han realizado estudios de validación
. Por lo tanto, tal como se describe en este documento, hemos realizado estudios para evaluar si la resistencia Taxol podría superarse
in vivo fotos: por la orientación IGF-2. Se examinó el impacto de la caída de IGF-2 no sólo los efectos de Taxol, sino también la respuesta a la no-taxano los microtúbulos que interactúan los medicamentos y otros fármacos de uso común en el tratamiento de cáncer de ovario. Para confirmar la relevancia clínica de nuestros resultados, un análisis de la serosa cohorte de cáncer de ovario de The Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) fue realizado para evaluar la relación de la expresión de IGF-2 y los resultados clínicos.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Cuidado y uso de animales Institucional (Protocolo 20130604) del Albert Einstein College de Medicina de la Universidad de Yeshiva. El Institutional Animal Welfare Aseguramiento (A3312-01) para esta instalación está totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) desde el 22 de febrero de 1983. Los animales fueron atendidos según la Ley de Protección de los Animales y los NIH "Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio".
líneas celulares y reactivos
la líneas celulares de carcinoma de ovario A2780 [12] y [13] HEY (tipo de regalos del Dr. Susan Band Horwitz), y la línea celular de carcinoma de ovario NIH: OVCAR8 [14] (a especie de regalo del Dr. David Goldman) se cultivaron en medio RPMI-1640 (Life Technologies) con 10% de suero bovino fetal (Life Technologies) y 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) a 37ºC con 5% de CO
2. Todas las líneas celulares resistentes a fármacos fueron generados por los autores, excepto HEY-Epo8 (un regalo del Dr. Susan Horwitz Band) que fue desarrollado por el Dr. C-P Huang Yang utilizando epotilona B [15]. La línea de células HEY-T30 taxol resistentes se generó a partir de células HEY, tal como se describe anteriormente [7]. La línea celular A2780-T15 fue generado de manera similar a partir de A2780 usando selección Taxol, pero en presencia continua de 15 verapamil mu M (Sigma). A2780-B20-B20 y HEY fueron seleccionados para la resistencia a la ixabepilona (Ixempra Bristol-Myers Squibb), y OVCAR8-D30 de discodermolida. Las líneas celulares se autentican utilizando el kit Genemarker 10 (Promega). líneas celulares resistentes fueron emparejados a sus líneas sensibles y con los datos publicados cuando esté disponible. Las líneas celulares se examinan rutinariamente para micoplasma con MycoAlert (Lonza). Las células fueron cultivadas en medio libre de fármaco durante al menos 18 horas antes de los experimentos, excepto A2780-T15, que se cultiva en presencia de 0,5 nM Taxol. Clínicamente formulado Taxol (Hospira) se diluyó 6 veces en 5% de agua de dextrosa (Hospira) a una concentración final de 1 mg /ml para los experimentos de xenoinjerto. NVP-AEW541, un pequeño inhibidor de quinasa del peso molecular de IGF1R, fue proporcionada por Novartis Pharma AG [16]. Un anticuerpo monoclonal de IGF1R, IMC-A12 (cixutumumab) fue proporcionado por Imclone, una subsidiaria de propiedad de Eli Lilly and Company.
Análisis de Expresión Génica IGF-2 en muestras clínicas de cáncer de ovario
La cBioPortal de Genómica del cáncer fue utilizado para acceder a la expresión de los genes y los datos clínicos del Proyecto del Genoma del cáncer Atlas (TGCA) [17]. La consulta se realizó utilizando todos los tumores completos del conjunto de datos de ovario seroso Cistoadenocarcinoma (TCGA, Naturaleza 2011), que incluye 489 casos de cáncer de ovario seroso de alto grado. Para IGF2 expresión de ARNm puntuaciones Z, un umbral de 1,6 desviaciones estándar por encima de la media define el grupo de IGF-alta; todos los demás casos se incluyeron en el grupo de IGF-2-normal.
PCR cuantitativa
Los lisados celulares se homogeneizaron utilizando columnas de Qiagen (Qiashredder Inc., Valencia, CA) y el ARN total se aisló por RNeasy Mini Kit (Qiagen). concentración de ARN y la pureza se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Fisher Scientific Thermo), mostrando OD 260/280 intervalo de relaciones de 02/03 a 02/11. La integridad del ARN se tomaron muestras utilizando un Bioanalyzer Agilent (Agilent Technologies), que muestra un rango de RIN puntuación de 9,8 a 10. El ADN complementario se hizo mediante la realización de la transcripción inversa (RT) usando el kit de superíndice VILO cDNA Synthesis (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante, utilizando 1 g de ARN total para todas las líneas celulares, excepto A2780, A2780 y A2780-T15-B20, para lo cual se utilizó 2 mg de ARN total. Quantitative PCR en tiempo real se realizó utilizando un ep Eppendorf Mastercycler
realplex2
utilizando un método de 3 pasos (95C 10 min, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 10 seg, 60ºC durante 20 seg, 72ºC durante 20 seg; a continuación, para la fusión de la curva 95C 15 segundos, 60C a 95C durante 20 min). Cada reacción utiliza 1 /20a de la reacción de ADNc, cebadores directos e inversos a una concentración final de 200 nM, y PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) diluido en agua ultrapura (Life Technologies) a 1X concentración final en una reacción final volumen de 10 l. Exón cebadores de unión que abarca la (Tabla S1) fueron validados por análisis de curvas de fusión y la eficiencia de amplificación. Una puntuación de la expresión de ARNm se calculó utilizando la fórmula * 1000, donde? C
t es la diferencia de C
t (ciclo umbral) entre el gen de interés y el gen de normalización interna,
PPIB gratis ( peptidylprolyl isomerasa B; ciclofilina B).
PPIB
fue verificado para tener estables los niveles de expresión del ARNm de la de los padres, resistentes a los fármacos, y se transfectaron líneas celulares de ovario, incluyendo: HEY, HEY-T30, HEY-B20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -v, HEY-T30 shScrambled, A2780, A2780-T15, A2780-B20. La diferencia media en C
valores de t en la evaluación de
PPIB
expresión en comparaciones por pares de estas líneas de células fue de 0,2 (intervalo de confianza del 95%: -0,1 a la 0.5). Veces el cambio en la expresión del ARNm relativa se calculó utilizando el método [7]. El ADN genómico se aisló con el kit AllPrep mini (Qiagen). Los cebadores fueron diseñados para abarcar una juntura-intrón exón y fueron validados por análisis de la curva de fusión y la eficiencia. Albúmina (
ALB
) se utilizó para la normalización interna. Por la gama de hibridación genómica comparativa, se encontró que las células HEY tener dos copias del
IGF2
,
ABCB1
y
ALB
genes (datos no mostrados). número de copias variación se determinó a partir de ADN genómico qPCR utilizando el método y el establecimiento de HEY 2 copias [18].
cinética de proliferación y Ensayos de citotoxicidad
En la cinética de proliferación, las células fueron sembradas en 6- y placas. Cada 24 horas, los pocillos duplicados se contaron usando un contador de Scepter (Millipore). Para los ensayos de citotoxicidad, las células fueron sembradas en una placa de 96 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron con diluciones en serie de la droga indicada, con una concentración fija de 1 M NVP-AEW541 o 10 mg /ml IMC-A12 si está indicado. Después de 72 horas de tratamiento, se determinó el número relativo de células en cada pocillo usando el ensayo de sulforrodamina B [7]. El IC
50 es la concentración del fármaco correspondiente a una disminución del 50% en el número de células calculado utilizando la curva de dosis-efecto.
ELISA para el receptor de fosforilación
Las células fueron cultivadas en medio completo para 24 horas, a continuación, privadas de suero durante 12 horas antes de la estimulación durante 10 minutos con IGF2 recombinante (50 ng /mL; Abcam) o insulina (50 nM; Sigma), con o sin tratamiento previo de las células con NVP-AEW541 (1 M) o IMC-A12 (10 mg /ml) durante 2 horas. Las células se lisaron usando tampón de lisis a base de NP40 con PhosSTOP (Roche) y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma). Después de cuantificación de proteínas, el fosfo-IGF-1 humano DuoSet IC R y fosfo-Insulina R (R & amp; D Systems) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Western Blot El análisis de la expresión de proteína
para el análisis de AKT y ERK fosforilada y total, cantidades iguales de proteína (15 a 20 g, dependiendo del experimento) fueron cargados en cada carril en un gel de Tris-glicina y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se bloquearon y se incubaron durante la noche con los anticuerpos primarios indicados se diluyeron en tampón de bloqueo 1:1000 (Li-Cor Biosciences), excepto GAPDH utilizado a una dilución 1:5000. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: PhosphoAKT (Thr308) (Cell Signaling Technology 4056), PhosphoAKT (Ser473) (Cell Signaling Technology 4060), AKT1 (Cell Signaling Technology 2938), PhosphoERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), ERK 1/2 (Cell Signaling Technology 4695), GAPDH (Cell tecnología de señalización 2118), IGF-2 (Abcam AB9574). Después de anticuerpo secundario (1:10 000 anti-conejo, LI-COR Biosciences 926 a 32.211) de incubación, las membranas fueron digitalizadas en un sistema de formación de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences) a 800 nm de longitud de onda. La densitometría se realizó en los archivos TIFF de medición de la densidad integrada usando ImageJ, la corrección para el fondo y la normalización de Ponceau tinción del carril respectivo.
Los estudios terapéuticos en ratones portadores de xenoinjerto
Mujer ratones desnudos atímicos ( Harlan) entre 6 y 8 semanas de edad fueron inyectados por vía subcutánea con millón de las células indicadas, se suspendió en 100 OptiMem l. El tamaño del tumor se midió utilizando calibradores digitales y el volumen calculado mediante la fórmula: (longitud * anchura
2) /2. Los ratones fueron tratados como se describe en las leyendas de las figuras. Los ratones se sacrificaron por anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical, cuando su xenoinjerto alcanzó 20 mm de diámetro, o en los puntos de tiempo especificados para el análisis de xenoinjerto. Hematoxilina y eosina secciones teñidas de xenoinjertos fueron evaluados por el estudio forense (Y.W.). La inmunohistoquímica para IGF2 (Abcam ab9574) se realizó sobre secciones incluidas en parafina fijadas con formalina como se ha descrito anteriormente para los tejidos tumorales [7] y anotado por el patólogo estudio (PA).
IGF-2 e IR Derribo
El IGF-2 e IR-dirigidos siRNA oligonucleótidos se adquirieron de Life Technologies. Usando RNAiMax Lipofectamina (Life Technologies), revertir la transfección se realizó tal como se describe anteriormente [7] en paralelo con la orientación no-transfección siRNA y controles de transfección simulada. ARN se recogió a las 48 horas después de la transfección para confirmar caída por RT-qPCR (Fig. S2A /D en S1 Archivo). Para las células HEY-T30, los resultados de la primera secuencia de oligonucleótidos IGF-2 siRNA probado se muestran en una publicación anterior [7]; la validación de estos resultados se hizo por este manuscrito utilizando dos nuevas secuencias de oligonucleótidos única nombrados arbitrariamente siIGF2-1 y siIGF2-2. Para las células A2780-T15, se utilizaron dos secuencias de oligonucleótidos, que corresponde a la primera siRNA utilizado en HEY-T30 (llamado arbitrariamente siIGF2-3), así como el nuevo oligonucleótido siIGF2-1. Para desmontables estable utilizando el sistema de bloqueo-iT inducible H1 Lentiviral RNAi (Life Technologies), los vectores se han diseñado para expresar una shRNA orientación IGF-2, o un control no focalización (shScrambled). Las células HEY-T30 se transfectaron con el plásmido directamente o con partículas de lentivirus, a continuación, seleccionados con zeocina (Life Technologies). Los clones de células transfectadas por plásmidos y células lentivirales transfectadas fueron seleccionadas para IGF2 caída. El clon con la expresión mRNA IGF2 más bajo de cada grupo se utilizó para experimentos posteriores.
ciclo celular y análisis de apoptosis
Las células se trataron como se describe en las leyendas de las figuras. Después de 16 horas, se recogieron las células adherentes y flotantes. Para el análisis del ciclo celular, las células se fijaron con etanol al 70% frío durante 1 hora, después se incubaron con 20 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma) y 100 mg /ml de RNasa (Fisher Thermo Scientific) en PBS. Para el análisis de apoptosis, la membrana Violet Ratiometric Asimetría sonda /Dead Cell Apoptosis Kit (Life Technologies) fue utilizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una violeta colorante excitable 4 '-N, N-dietilamino-6- (N, N, N- dodecil-metilamino-sulfopropil) -metil-3-hidroxiflavona (F2N12S) se utilizó para la detección de cambios de asimetría de membrana que se producen durante la primera apoptosis, lo que resulta en una disminución en la proporción de emisión de 585 nm a 530 nm. Al mismo tiempo, SYTOX (R) Aadvanced se utilizó como una mancha de células muertas. El uso de células no teñidas y células no tratadas de control, se determinó gating de cuadrantes; viven, apoptosis, y las células muertas se cuantificaron utilizando FlowJo (TreeStar).
Análisis de eflujo de drogas
Doscientos mil HEY HEY-T30 y las células se resuspendieron en 1 ml de PBS caliente + FBS al 5% . Todos los pasos de incubación se realizaron a 37ºC en la incubadora de cultivo celular. se añadió Verapamilo (15 M) o NVP-AEW541 (1 M) y las muestras se incubaron durante 1 hora. A continuación, se añadió 50 mM de tubulina Rastreador de reactivo verde (Oregon Green 488 Taxol, bis-acetato) (Life Technologies) y las muestras se incubaron durante 45 minutos. Las células se sedimentaron a continuación, se resuspendieron en PBS + 5% de FBS, con verapamil o NVP-AEW541 si está indicado, y se incubaron durante 20 minutos, se lavaron en PBS y se tiñeron con TO-PRO-3 (Life Technologies). Las células se analizaron inmediatamente usando un FACSCanto II (BD) y FlowJo; TO-PRO-3 células positivas (células muertas) fueron cerrada y se graficaron las células restantes para determinar la etiqueta de retención Taxol [19].
Análisis estadístico
Para cada análisis, los datos eran de al menos dos experimentos independientes. El número de repeticiones por experimento se describen en las leyendas de las figuras. Las diferencias entre las medias de dos grupos se analizaron usando la prueba t. Para las diferencias entre tres o más grupos, ANOVA de una vía con un post-test de Bonferroni se utilizó. Para el análisis de dos variables independientes, se utilizó ANOVA de dos vías con un post-test de Bonferroni. Para el análisis de supervivencia, se utilizó la prueba de rango logarítmico. Todos los valores de p son de dos colas y P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Métodos Complementarios
File S2 contiene los materiales y métodos utilizados para generar los datos de mutación beta-tubulina (que se muestra en la Fig. . S1 del archivo S1) y el IGF-2 Western blot (datos mostrados en la Fig. S2E de S1 archivo).
resultados
Nuestro estudio previo de expresión de la proteína IGF-2 usando un microarray de tejido de ovario epitelial tumores indicaron que los niveles de expresión de tejido de alta IGF2 se asociaron con un intervalo acortado hasta la progresión /recidiva [7]. Desde entonces, se pusieron a disposición los datos de expresión génica de muestras de cáncer de ovario seroso 489 en estadio II-IV de alto grado anotada clínicamente del proyecto Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) a través de la cBioPortal de Genómica del Cáncer [17]. El uso de este portal de datos, hemos probado una relación de la expresión de IGF2 y resistencia a los fármacos intrínseca, en el que alta IGF2 se definió como 1,6 SD por encima de la media, que corresponde a 94-95th percentil en una distribución normal. Mediante el uso de este punto de corte, el tamaño del grupo de IGF2-alta se aproxima a la fracción de los pacientes con cáncer de ovario espera que tengan tumores resistentes a los fármacos intrínseca, que se manifiestan por la progresión durante o poco después de terminar la quimioterapia. En nuestro análisis de los datos del TCGA, que de hecho encontramos que la expresión del ARNm de alta IGF-2 en el tejido tumoral significativamente correlacionado con acortar el intervalo hasta la progresión /recidiva, es decir, la supervivencia libre de progresión (fig. 1A). La mediana de la supervivencia libre de progresión en este grupo fue & lt; 12 meses, indicativos de la resistencia intrínseca de drogas. la expresión de ARNm de alta IGF2 también se correlacionó con la supervivencia global acortado significativamente (Fig. 1B). El análisis multivariado no se ha habilitado por este portal de datos, sin embargo, en nuestra publicación anterior hemos observado una asociación de la expresión de IGF-2 con una mayor estadio y el grado [7].
expresión de IGF-2 y la supervivencia del cáncer de ovario. Utilizando el cBioPortal de Genómica del Cáncer para analizar los datos del estudio del Genoma del Cáncer Atlas de cystadenocarcinoma seroso de ovario, se comparó la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global en pacientes con niveles altos de tumores de IGF-2 mRNA (mayor de 1,6 desviaciones estándar por encima de la media; línea gris) y aquellos con niveles tumorales normales de IGF-2 mRNA (el resto de los pacientes; línea de negro). Los pacientes con niveles elevados de ARNm de IGF-2 habían acortado significativamente la supervivencia libre de progresión (A) y la supervivencia global (B). (C) la expresión de IGF-2 en líneas celulares sensibles y resistentes. Por RT-qPCR, que mide el nivel de IGF-2 mRNA en líneas de ovario resistentes a drogas de seis células de carcinoma y sus tres líneas celulares de origen. Todas las líneas celulares resistentes a drogas tienen significativamente más alta expresión del ARNm de IGF-2 en comparación con su línea de células sensibles de origen. Las barras muestran la media ± SEM de IGF-2 mRNA expresión de la puntuación de al menos dos experimentos independientes para cada línea celular, cada uno hizo por triplicado, y el símbolo encima de la barra indica la significación estadística comparando esa línea celular resistente con su homólogo de los padres; * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001, **** p & lt; 0,0001 por ANOVA de una vía con el post-test de Bonferroni. (D) la expresión de ABCB1. los niveles de expresión de ARNm de ABCB1 se midieron por RT-qPCR en HEY, HEY-T30, A2780 y A2780-T15. HEY-T30 tiene mayor expresión de ARNm de ABCB1 en comparación con las otras líneas celulares. Las barras muestran la media ± SEM de ABCB1 ARNm puntuación de expresión de al menos cuatro experimentos independientes para cada línea celular, cada uno hizo por triplicado, (E) número de copias de ADN ABCB1. Por qPCR realizó en el ADN genómico, HEY-T30 tiene un aumento de seis veces en el número de copias de ADN que indica la amplificación del gen ABCB1. Las barras muestran la media ± SEM de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado.
anteriormente mostró que los niveles de ARNm de IGF-2 aumentan durante el tratamiento agudo de Taxol, y la hipótesis de que la regulación positiva de IGF-2 se asocia con el sobreviviente persistente las células que dan lugar a la enfermedad recurrente resistente a los medicamentos. Para el estudio de la resistencia a fármacos en el laboratorio, Taxol, así como agentes estabilizadores de microtúbulos sin taxanos (MSA), ixabepilona, discodermolida, y epotilona B, se utilizaron para desarrollar seis líneas celulares resistentes a distintas. Según lo determinado por PCR en tiempo real, todos los modelos de la línea celular MSA-resistentes tuvieron niveles elevados de IGF-2 mRNA expresión en relación con su línea parental sensible (Fig. 1C). Desde Taxol es de lejos el más clínicamente utilizado entre estos fármacos, los experimentos posteriores se centraron en las líneas celulares resistentes Taxol HEY-T30 y A2780-T15.
Se evaluaron las líneas de células resistentes a fármaco para tratar otros mecanismos de resistencia Taxol [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 tiene ABCB1 ARNm más de expresión (Fig. 1D) asociado con la amplificación genómica de
ABCB1 gratis (Fig. 1E), mientras HEY no tiene cambio de número de copia de
ABCB1
. Estos hallazgos fueron confirmados por la gama de hibridación genómica comparativa (datos no mostrados). A2780-T15 fue seleccionada en presencia de verapamilo y no sobreexpresan ABCB1 (Fig. 1D), y tampoco A2780 A2780-T15 ni tiene ADN cambio de número de copia de
ABCB1 gratis (Fig. 1E). No se encontró correlación significativa entre el IGF-2 y la expresión de ABCB1 en nuestro panel de líneas celulares (Fig. S3 de archivo S1). La secuenciación del ADN reveló que A2780-T15 tiene una mutación (glicina en la posición 360 se cambia a un ácido aspártico) en el bolsillo de unión Taxol-de β-tubulina (Fig. S1A y S1B de archivo S1), mientras que HEY-T30 no tiene una mutación en β-tubulina.
HEY-T30 proliferó de manera similar en los medios de comunicación Taxol-libres o medios que contienen bajas concentraciones de Taxol (≤30 nM) (Fig. 2A). A2780-T15 proliferaron mucho más lentamente en medios Taxol-libres que en medios que contienen Taxol (≤15 nM) (Fig. 2B), lo que sugiere posible dependiente de crecimiento Taxol asociado con su mutación β-tubulina. Cuando bajas dosis de Taxol estaba presente, A2780-T15 proliferó a una tasa similar a la A2780. Las líneas celulares resistentes mostraron resistencia cruzada a la ixabepilona, un MSA que comparte un sitio de unión β-tubulina común con Taxol. perfilado Ampliado de HEY-T30 (Fig. 2C, panel de la izquierda) mostró resistencia a la vinblastina microtúbulos desestabilización de drogas y la resistencia a la doxorrubicina, pero la sensibilidad similar al cisplatino, en comparación con los padres HEY. A2780-T15 (Fig. 2C, panel derecho) fue cruzada resistente a la doxorrubicina y CDDP, pero fue más sensible a la vinblastina. Hipersensibilidad a los fármacos desestabilizar microtúbulos se ha observado previamente en otra línea celular resistente a los medicamentos que alberga una mutación β-tubulina que estaba asociado con la dependencia de fármacos estabilizadores de microtúbulos para la proliferación [22].
cinética de proliferación de líneas celulares. Las células fueron cultivadas en medio completo con la concentración indicada de Taxol en platos de 6 pocillos, y las células de los pocillos duplicados contados cada 24 horas. células (A) HEY-T30 en presencia o ausencia de 30 nM Taxol proliferan más lentamente que las células HEY (p & lt; 0,05, medidas repetidas ANOVA de dos vías, post-test de Bonferroni). (B) A2780-T15 en presencia de 2 nM y 15 nM Taxol crecen de manera similar a A2780. Sin embargo, en ausencia de Taxol, A2780-T15 prolifera más lentamente, lo que sugiere la dependencia Taxol (p & lt; 0,01, ANOVA de dos vías, de Bonferroni post-test). Cada curva de crecimiento representa la media de al menos dos experimentos independientes cada uno hecho por duplicado, cada punto se representa como la media ± SEM. (C) IC
50 del fármacos quimioterapéuticos en líneas celulares sensibles y resistentes. En placas de 96 pocillos, las células se trataron con diluciones en serie de los fármacos indicados y la concentración de inhibición de la proliferación del 50% (IC
50) medida por el ensayo de SRB citotoxicidad. HEY-T30 son resistencia cruzada a la ixabepilona y vinblastina. No es modesta resistencia cruzada a la doxorrubicina, pero no a CDDP. A2780-T15 son resistencia cruzada a la ixabepilona, y modestamente resistencia cruzada a la doxorrubicina y CDDP, pero más sensible a la vinblastina. Los datos se presentan como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes realizados con seis repeticiones. P-valores calculados mediante la prueba t no pareada. (D, E) Comparación de HEY HEY-T30 y la respuesta de xenoinjertos de Taxol. Después de la inyección subcutánea de HEY-T30 o células HEY, los ratones se dividieron en grupos de tratamiento de 6 animales cada uno. Cuando el volumen promedio de xenoinjerto alcanzó 120 mm
3, el tratamiento Taxol se administró a la dosis máxima tolerada (MTD) de 20 mg /kg por vía intraperitoneal cada tres días durante cinco tratamientos (días de tratamiento: 0, 3, 6, 9, 12 ), resultando en una dosis acumulativa de 100 mg /kg. Los animales de control recibieron inyecciones intraperitoneales de diluyente (dextrosa 5% en agua; D5W) de acuerdo con el mismo horario. Los tumores se midieron cada tres días, y la media de los volúmenes tumorales ± SEM para cada grupo se muestra en cada punto de tiempo. HEY xenoinjertos respondieron al tratamiento con taxol, que suprimió potentemente el crecimiento del tumor (Figura 2D;. Punteada línea azul). xenoinjertos HEY-T30 no respondieron al tratamiento con taxol (figura 2E;. línea naranja discontinua) y crecieron a una tasa similar como xenoinjertos HEY-T30 tratadas con vehículo. HEY Taxol vs HEY D5W en día 19, p & lt; 0,001; no apareado t-test.
Un paso crítico en la traducción de los hallazgos de laboratorio en terapias potenciales para los pacientes es llevar a cabo
in vivo
prueba utilizando modelos animales. Dado que las células A2780-T15 dependían de Taxol para su crecimiento, pero HEY-T30 no estaban, se evaluaron HEY-T30 como un modelo de xenoinjerto de
in vivo
ensayo de estrategias terapéuticas dirigidas a la resistencia a fármacos. Se administró Taxol utilizando la dosis determinada previamente de máxima tolerada (MTD; dosis acumulativa de 100 mg /kg) [23] para evaluar la resistencia a fármacos
in vivo
. HEY crecimiento de xenoinjerto de los padres se suprimió eficazmente por Taxol, lo que indica la sensibilidad a Taxol (Fig. 2D). En contraste, el Taxol no inhibir el crecimiento de xenoinjertos HEY-T30 comparación con el vehículo (dextrosa al 5% en agua; D5W) de tratamiento, lo que indica la resistencia a fármacos (figura 2E).
Para crear estrategias de cómo orientar las drogas IGF-2-mediada. resistencia, se analizó la expresión del receptor y la activación en las líneas celulares resistentes y sensibles a fármacos. estudios publicados anteriormente indican que induce la unión de IGF2-autofosforilación de IGF1R y la isoforma del receptor de la insulina A, IR-A [24], [25], lo que resulta en la activación del receptor y la señalización aguas abajo a moléculas efectoras tales como AKT. Además, la expresión /IGF1R alta IR-A se asoció con resistencia a las terapias anti-IGF1R, como la señalización a través IR-A puede eludir la dependencia de IGF1R [26]. Se determinó que la expresión de IGF1R mRNA fue mayor en HEY y HEY-T30, en comparación con A2780 y A2780-T15, sin diferencias significativas entre las líneas sensibles y resistentes emparejados (Fig. 3A). Como se muestra en la Fig. 3B, los niveles de IR-A fueron menores en HEY HEY-T30 y en comparación con A2780 y A2780-T15. los datos de PCR en tiempo real también se analizó con la corrección de las diferencias en la eficiencia de amplificación entre conjuntos de cebadores (Tabla S1 del Archivo S1), con resultados similares. Por Western blot, IGF1R y IR expresión de la proteína corresponde a los niveles de ARNm (datos no mostrados). De esta manera, HEY HEY-T30 y tenía relaciones /IGF1R inferiores IR-A que A2780 y A2780-T15.
(A) IGF1R ARNm de líneas celulares sensibles y resistentes. Medido por RT-qPCR (n = 5 experimentos independientes cada realizaron por triplicado), los niveles de ARNm de IGF1R son similares cuando las líneas de células resistentes se comparan con sus líneas de células parentales de origen. Las barras muestran la media ± SEM. (B) ARNm IR de líneas celulares sensibles y resistentes. Medido por RT-qPCR (n = 5 experimentos independientes cada uno hizo por triplicado) los niveles de IR-A y ARNm IR-B en HEY-T30 se reducen significativamente cuando se compara con HEY, mientras que se observan niveles similares al comparar A2780-T15 para A2780. Las barras muestran la media ± SEM, **** p & lt; 0,0001; no apareado t-test. (C) La fosfo-IGF1R y fosfo-IR ELISA en HEY-T30. Las células se mantuvieron en ayunas durante la noche, se incubaron con 1 M NVP-AEW541 o 10 mg /ml IMC-A12 durante 2 horas, se estimularon con 50 ng /ml IGF2 o 50 nM de insulina durante 10 minutos, se lisaron, y los niveles de IGF1R fosforilada y IR determinado por ELISA. Tanto IGF2 y la insulina causados de 5 a 6 veces de cambio de aumento de los niveles de fosfo-IGF1R que podría ser suprimida por NVP-AEW541 o IMC-A12. Los cambios en fosfo-IR después de la estimulación con IGF-2 o insulina eran mucho más pequeños (pliegue de cambio & lt; 1,5). Las barras representan la media ± SEM niveles de factor de cambio de fosforilación de al menos dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. (D) La fosfo-AKT y Western blot fosfo-ERK. Los lisados celulares preparados como se describe en (C) se utilizaron para inmunotransferencia utilizando AKT-fosforilación específica y anticuerpos ERK. IGF-2 inducida por la fosforilación de AKT en la treonina 308 y serina 473 fue suprimida por NVP-AEW541 y IMC-A12, mientras que AKT total fue sin cambios. No se observó efecto sobre los niveles de fosfo-ERK. Se muestra un experimento representativo de dos experimentos independientes. La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por tinción Ponceau e inmunotransferencia GAPDH. (E) La fosfo-IGF1R y fosfo-IR ELISA en el A2780-T15. Las células se prepararon de manera similar a (C). IGF-2 y la insulina causados 7 veces y 10 veces el aumento de los niveles de fosfo-IGF1R, respectivamente, y esto podría ser suprimidas por NVP-AEW541 o IMC-A12. Los niveles de fosfo-IR después de IGF2 o la estimulación de insulina también aumentó, 4 veces y 9 veces, respectivamente. Como se muestra en la Fig.