Extracto
Antecedentes
Nos ha publicado recientemente la detección del virus rara relacionada con el virus de la leucemia murina xenotropic (XMRV) (1/105) en el cáncer de próstata (PCA) de tejido de pacientes en el norte Europa por PCR. Al descubrirse el controvertido debate sobre el virus en el tejido PCA, las muestras de sangre de pacientes que sufren de síndrome de fatiga crónica (SFC), así como de un número significativo de controles sanos nos llevó a profundizar en nuestros estudios sobre la detección de la infección por XMRV la aplicación de métodos de detección diferentes (PCR, del co-cultivo e inmunohistoquímica [IHC]).
se aislaron
Metodología /Principales conclusiones
Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de 92 PCA y 7 controles sanos, PHA activan y co-cultivaron con LNCaP células de hasta 8 semanas. El sobrenadante de estas células se aplicó a una línea celular reportero, Derse-IGFP. Por otra parte, las PBMCs y células LNCaP cocultivaron se ensayaron para determinar la presencia de XMRV por PCR así como el análisis Western Blot. Mientras que todas las amplificaciones de PCR y análisis de Western Blot fueron negativos para detectar signos de infección por XMRV, células Derse-IGFP muestran células positivas para GFP aislados en tres casos. En los tres casos la presencia del XMRV no pudo ser confirmado por la tecnología PCR. Además, se realizó el XMRV IHC específica en secciones de tejido de PCA. Sectores enteros de tejido (n = 20), así como los microarrays de tejidos (TMA), incluyendo 50 la hiperplasia benigna de próstata (HBP), el 50 de bajo grado y 50 secciones de PCA de alto grado y TMA, incluyendo cáncer de mama, cáncer de colon y los tejidos normales se tiñeron con dos XMRV antisueros específicos. expresión de la proteína XMRV no se detectó en ninguna de las secciones de cáncer incluidos. Un tejido de BPH muestra la expresión de proteínas específicas XMRV en las células basales aislados aleatorios.
Conclusión
No se pudo detectar de manera concluyente XMRV en la sangre de pacientes con PCA o de controles sanos y no hay evidencia concluyente de la expresión de la proteína XMRV en PCA, secciones de cáncer de mama y cáncer de colon tejidos probados por tinción IHC
Visto:. Stieler K, S Schindler, Schlomm T, Hohn O, N Bannert, Simon R, et al. (2011) Sin detección de XMRV en muestras de sangre y secciones de tejido de cáncer de próstata Los pacientes en el norte de Europa. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10.1371 /journal.pone.0025592
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2011; Aceptado: September 6, 2011; Publicado: 12 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Stieler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En la actualidad, la detección del virus de la leucemia murina relacionada Xenotropic retrovirus (XMRV) en muestras biológicas humanas se han despertado controversia que van desde el XMRV está asociado con dos importantes enfermedades humanas, síndrome de fatiga crónica (SFC) [1], [2] y el cáncer de próstata (PCA) [3], [4] para estar hombres generado contaminante laboratorio debido a pases de xenoinjerto a través de ratones [5] - [18]
en 2006, XMRV se ha identificado en tejido de la próstata de pacientes con cáncer de próstata familiarizado (PCA) con una mutación homocigota en el. gen RNaseL (R462Q) [19]. La asociación entre el XMRV y el PCA fue severamente reforzada por estudios que demuestran la expresión de la proteína XMRV, así como la presencia de secuencias de XMRV en hasta el 26% de todos los casos de PCA [3], [4], [20]. expresión de la proteína XMRV se observa sobre todo en el epitelio maligno que sugiere un papel más directo en la tumorigénesis. Sin embargo, hay numerosos estudios sólo en raras ocasiones o completamente no detectar XMRV en muestras de cáncer de próstata mediante PCR o métodos IHC [3], [4], [9], [21] - [26]. Últimamente hemos detectado XMRV en la frecuencia baja (1%) en muestras esporádicas PCA desde el norte de Europa el uso de métodos de amplificación por PCR y ARN aislado de las muestras de tejido fresco congelado [27]. La expresión de la proteína XMRV, así como la presencia de secuencias de XMRV en hasta el 26% de todas las muestras de PCA analizados se demostró en 2009 mediante la aplicación de técnicas de inmunohistoquímica (IHC) de secciones completas de montaje de PCA con un antisuero específico anti-XMRV [4], [20 ]. Sin embargo, un informe reciente utilizando antisueros Rauscher MLV gag que también reconoce la proteína XMRV gag, no confirmó estos resultados [24]. El estudio realizado por Schlaberg et al. nos llevó a examinar la prevalencia de XMRV en muestras de PCA por IHC ya que las infecciones focales visto por IHC pueden pasarse por alto en el análisis de PCR. Además, se evalúa la presencia de la expresión de proteínas XMRV en las secciones de otros tumores malignos, así como el tejido normal por IHC. Al utilizar el recientemente publicado antisuero anti-XMRV [4], así como un antisuero específico XMRV gag no fuimos capaces de detectar el XMRV gag tinción específica de las células en PCA u otro tejido canceroso. Sin embargo, una hiperplasia benigna de próstata (HBP) sección muestra claramente las células teñidas positivas utilizando suero anti-XMRV gag K121.
En 2009 el XMRV fue identificado en hasta el 68% de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) muestras de pacientes con síndrome de fatiga crónica y el 3-4% de la cohorte de control mostró signos de infección por XMRV [2]. PCR datos fueron reforzadas por células dependientes, así como la transmisión libre de células del virus a partir de muestras de sangre de pacientes con SFC a las células indicadoras. Sin embargo, varios estudios posteriores por otros laboratorios no pudieron confirmar los datos de PCR y no hay experimentos de transmisión del virus han sido reproducidos hasta la fecha [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. Recientemente, muestras de sangre de pacientes con SFC reportados previamente para contener secuencias de XMRV se ensayaron de nuevo, sin embargo, fueron identificados como XMRV negativo por las estrategias de amplificación por PCR y métodos serológicos [12], [32].
A principios de este año, mientras que este estudio estaba en marcha, varias publicaciones dirigidas el riesgo de contaminaciones por trazas de ADN de ratón (secciones de parafina, líneas celulares o de otras fuentes) [7], [13], [15] y el riesgo de los productos de PCR positivos falsos por algunos kits de amplificación comerciales [17], [33]. Además, el matiz y colegas sostienen que, debido a la falta de variabilidad de secuencia de fragmentos de genes XMRV en pacientes aislados en comparación con la variabilidad de secuencia identificado en una línea celular positiva XMRV 22Rv1, XMRV podría ser un contaminante de laboratorio en lugar de un verdadero virus humano exógeno [11 ]. Una fuerte indicación de que XMRV es un virus que circula en la población humana es la identificación de los sitios de integración viral en el genoma del huésped [34]. Sin embargo, los hallazgos más recientes demuestran que los dos sitios de integración publicados anteriormente son idénticos a los sitios de integración XMRV en una línea celular infectada in vitro DU145 [35]. Por otra parte, Paprotka y sus colegas proporcionan evidencia de que el XMRV deriva de dos ratón endógenos pre-virus que se sometieron a la recombinación retrovirales en cultivo celular lo que sugiere que todas las secuencias de XMRV reportados hasta la fecha tenían más probable es que se originan a partir de este evento cultivo celular [14]. En el estudio presentado se abordó la detección de XMRV y MLV secuencias relacionadas en células de sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos motivados por la detección de XMRV en los glóbulos de 3-4% de los controles sanos [2] y nuestra hipótesis de que el XMRV replicación podría ser activado debido a la inmunosupresión PCA y posteriormente detectable que acompaña en la sangre de los pacientes. Un total de 100 muestras de sangre fueron incluidos en nuestro estudio. Se aislaron PBMC, estimuladas y posteriormente utilizados para los experimentos de aislamiento de ADN o de cocultivo genómicas siguientes protocolos publicados [1], [2]. Además, los extractos de proteínas a partir de PBMCs activadas se generaron y analizaron para la expresión de proteínas XMRV. Se demuestra que las PBMC en general pueden ser in vitro infectadas con XMRV, lo que resulta en células infectadas 1-2%, que puedan controlarse fácilmente mediante PCR o análisis de la expresión de proteínas de esta manera confirma los resultados [10], recientemente publicado. Aunque los genomas virales son muy editados debido a la restricción APOBEC, el sobrenadante de PBMC XMRV infecta infecta de manera eficiente un reportero línea celular, Derse-IGFP. Esta línea celular (generada por Vineet N. KewalRamani, Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, EE.UU.) expresa un reportero GFP que se activa mediante la expresión de la transcriptasa inversa. Aunque la sensibilidad de todas las técnicas utilizadas en nuestro estudio es bastante alto, no se detectó secuencias XMRV o proteína específica XMRV expresión en PBMCs activados. Curiosamente, se detectó en el sobrenadante de PBMC activados 3/67 y 2/67 experimentos de cocultivo de PBMC con células LNCaP, dando como resultado la actividad RT en células Derse-IGFP GFP positivas, sin embargo, no hemos podido inequívoca prueba de que estas PBMC han sido infectadas con XMRV, otras fuentes de actividad RT no se puede excluir.
Materiales y Métodos
Ética declaración
el estudio fue aprobado por el Comité Ético del Estado Federal de Hamburgo (sin . OB-052-04).
población de estudio y recogida de muestras. Población de estudio y recogida de muestras
Las muestras de sangre de 92 pacientes con cáncer de próstata (edad 44-77) Se recogieron día antes de la prostatectomía radical. Los datos clínicos se resumen en la Tabla 1. Además, las muestras de sangre de 7 hombres (30 a 44 años de edad) sin evidencia de PCA se incluyeron en el estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso científico de las muestras de sangre; EDTA-sangre de los pacientes y controles sanos fueron procesados por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). Las células mononucleares de sangre primarias (PBMC) se separaron y se cultivan como se describe a continuación.
Las líneas celulares
La línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP (ATCC#CRL-1740), LNCaP DERSE- IGFP (amablemente proporcionado por Vineet N. KewalRamani, Instituto Nacional del cáncer, Frederick, EE.UU.) y la línea celular humana positiva XMRV cáncer de próstata 22Rv1 (ATCC#CRL-2505) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de FCS, 5 % de penicilina /estreptomicina y L-glutamina. células LNCaP crónicamente infectados (XMRV) fueron generados por transfección de ADN proviral XMRV VP62 según lo publicado anteriormente [36] y se mantuvo durante varias semanas. PBMC se aislaron de 10 ml de sangre con EDTA y se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco) similar a las líneas celulares de cáncer de próstata establecido pero, además, suplementado con PHA (5 g /ml, Thermo Fisher Scientific) y rhIL-2 (180 UI /ml, R & amp; D Systems).
experimentos de cocultivo
1 ml de suspensión celular que contiene 1 × 10
6-3 × 10
6 PBMCs activados durante 7 días se añadió a 2 × 10
5 LNCaP mantuvieron en RPMI 2 ml contiene 8 g /ml de polibreno en placas de 6 pocillos. Las placas se centrifugaron durante 30 min a 37 ° C y 800 × g. PBMCs fueron retirados 24h más tarde. células LNCaP fueron cultivadas durante 6-8 semanas. Las células se dividieron al alcanzar el 100% de confluencia. Los sobrenadantes fueron tomadas después de 6 y 8 semanas y se aplicaron a las células Derse-IGFP (véase más adelante).
Para los controles positivos PBMC humanos fueron infectados con el sobrenadante que contiene el XMRV-a partir de células LNCaP XMRV. cantidad indicada de virus que contiene el sobrenadante de las células productoras de XMRV (al menos 80% de confluencia) se esterilizó por filtración y se añade a 3 × 10
6 PBMCs pre-activado durante dos días. Las placas se centrifugaron durante 30 min a 37 ° C y 800 × g. XMRV que contiene sobrenadante se retiró al día siguiente por la granulación células a 200 x g, se lava con 10 ml de PBS (Gibco) y la difusión después de una etapa de centrifugación adicional en una nueva placa de 6 pocillos en 2 RPMI ml que contiene PHA y rhIL-2. PBMCs se cultivaron durante 7 días antes de analizar sobrenadante, co-cultivo, el ácido nucleico y la extracción de proteínas.
infección usando replicación competente XMRV
DNA proviral VP62 XMRV se transfectó en células LNCaP para producir virus que contiene sobrenadante como se describe anteriormente [34], [36].
PCR
ADN genómico fue extraído a partir de PBMCs utilizando mini kit Qiagen QIAamp y se almacena a 4 ° C. las concentraciones de ácido nucleico se determinaron utilizando un Nanodrop (Peqlab). Diferentes PCRs anidadas direccionamiento de secuencias gag y env se realizaron como se ha publicado recientemente [1], [3], [19], utilizando 650 ng de ADN molde por reacción. Gag imprimación exterior: 5'-419F ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 ', 5'-1154R GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3'; dentro de imprimación: NP116F 5'-3 'y CATGGGACAGACCGTAACTACC-5'-NP117R GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3'. Para determinar la sensibilidad de la PCR de la mordaza publicado originalmente por Urisman et al. Se aplicaron los siguientes cebadores: 5'-GAG DE CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 ', 5'-gag o CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3', 5'-GAG SI TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 'y 5'-GAG IR AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. El env PCR se realizó como se publicó recientemente [3] utilizando los pares de cebadores siguiente F 5'-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 ', R5'-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3', 5'-IF GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 'y 5'-IR CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3' . La integridad de las muestras de ADN y la presencia de inhibidores putativos fueron controlados mediante la amplificación de GAPDH, 5'-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 'y 5'-R GAAGATGG TGATGGGATTTC-3'.
Western Blot
Los lisados celulares se generaron utilizando tampón RIPA que contiene 1% de Triton X-100 y la mezcla de inhibidor de proteasa (Roche). bandas de proteínas específicas se detectaron mediante anticuerpo policlonal Env Rauscher 77S85 (regalo de C. Stocking, Instituto Heinrich-Pette, Hamburgo, Alemania), el XMRV policlonal de conejo específico de la mordaza del antisuero K121 y p30 Gag reconocer sobrenadante de hibridoma de células CRL-1912 (ATCC) . cantidades iguales de proteína por carril se aseguraron con el MAB anticuerpos actina 1501 incubación anti-humano (Chemicon). Para la detección de partículas XMRV en sobrenadantes de cultivo celular, medio de cultivo filtrado estéril de las células infectadas se ultracentrifugó 1 h, 110.000 × g a 4 ° C (Beckman SW60Ti). El sedimento de sobrenadante de 11 ml se resuspendió en 10 l de PBS y se analizó mediante inmunotransferencia.
secciones de parafina línea celular y TMA
1 × 10
7 células (LNCaP, LNCaP crónicamente infectados con el XMRV , 293T, 293T células infectadas crónicamente con XMRV y SC1 ratón) se fijaron durante 20 h en 10% formalina tamponada con fosfato, incrustado en agar y procesado de la cera de parafina [37].
Un TMA contiene tejido prostático preexistente ( 50 PCA bajo grado, 50 PCA de alto grado y el 50 por hiperplasia prostática benigna (HPB)) se utilizó para IHC.
Immunhistochemistry
Los portaobjetos con las secciones de parafina de pacientes con cáncer de próstata fueron desparafinados inicialmente utilizando xileno. Para antígeno secciones de recuperación se calentaron 4 × 2 min en un tampón de citrato, usando un horno de microondas (650W) y después se enfrió a temperatura ambiente durante 30 min. El bloqueo se realizó durante 30 min a TA con suero de cerdo al 10% en tampón de dilución de anticuerpos (Dako). Después endógena fue bloqueada biotina usando avidina /biotina Kit (Dako). El anticuerpo primario (diluido en tampón de dilución de anticuerpos con suero de cerdo 2%, anti-XMRV 1:7500; XMRV anti-gag K121 1:5000) se incubó durante 2 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Los controles fueron o bien recubiertas con el suero pre correspondiente (misma dilución) o sólo con tampón de dilución de anticuerpos con suero de cerdo 2%. La incubación con el anticuerpo secundario - biotina /estreptavidina marcada - se realizó durante 30 min a TA. Para una detección posterior de anticuerpos unidos secciones etiquetadas se recubrieron con una solución de fosfatasa alcalina (Dako, AK 5000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió solución de tinción IHC que contiene levamisol para inhibir la fosfatasa alcalina endógena a los portaobjetos durante 15-20 min, mientras que la contratinción se realizó con soluciones hamin Mayers. El suero anti-XMRV fue proporcionado amablemente por Ila Singh (Universidad de Utah, EE.UU.).
Resultados
expresión de la proteína XMRV en tejido PCA mediante métodos IHC
En el año 2009, el hallazgo de un 23% de PCA secciones positivas para la expresión de proteínas XMRV ha informado [4]. expresión de la proteína XMRV que en la mayoría de casos localizados en el epitelio tumor fuertemente correlacionada con mayores grados de Gleason. Curiosamente, los datos de expresión de la proteína no se correlacionaron con los resultados de PCR. Una explicación putativa siendo pocas células infectadas focales XMRV en la próstata que son difícilmente detectables por PCR utilizando ADN de secciones de tejido todo el montaje como plantilla. Sin embargo, estos hallazgos no fueron confirmados por otro estudio [24]. Para contribuir a la explicación de las discrepancias que exhibió secciones enteras de PCA, así como TMA utilizando el recientemente publicado suero anti-XMRV [4] y un suero policlonal de conejo anti-XMRV gag (gag K121).
Ambos sueros han sido probados en el análisis de Western blot con la mordaza K121 suero que reconoce específicamente la proteína gag xenotropic mientras se muestra ninguna reactividad cruzada con las proteínas celulares. En contraste, el suero anti-XMRV [4] también reconoció las proteínas celulares en líneas celulares de ratón y humanos no infectados (Figura S1). Hemos generado secciones de parafina que representan las líneas celulares humanas 293T, LNCaP, ambas líneas celulares infectados con el XMRV y una línea celular de ratón SC1. Ambos antisueros reconocen proteínas XMRV células que expresan en secciones de parafina que muestra tinción granular del citoplasma (Figura 1). No se detectó tinción de las células no infectadas y no tinción de células de ratón SC1. Un total de 100 PCA (de bajo grado y de alto grado PCA) y 50 HPB representado en una TMA, así como 10 grandes secciones de cáncer de próstata (con una alta puntuación de Gleason) se analizaron con suero gag K121 (Tabla 2). Además un TMA contiene de mama, colon y cáncer de próstata, así como varios tejidos normales se ensayó para la expresión de proteínas XMRV. Cada tinción IHC se controló mediante la inclusión de controles positivos (secciones de parafina de líneas celulares) y controles negativos (sin adición de primer anticuerpo), así como mayores diluciones de la primera anticuerpo. No se observó tinción de secciones de cáncer, así como la mayoría de los tejidos de control fueron negativos para la tinción gag K121. Sólo una sección de la HBP está representada muy pocas células basales azar tinción positiva con suero K121 anti-gag (Figura 2). Ninguno de los TMA se puso a prueba con el suero anti-XMRV desde el fondo elevado debido al procedimiento de generación de TMA se ha observado.
Las secciones en parafina de matriz de línea celular que contiene líneas de células infectadas XMRV, así como líneas de células no infectadas eran tiñeron para la expresión de proteínas XMRV utilizando suero anti-XMRV (a) o anti-gag suero de conejo K121 policlonal (B). aumentos más grandes se muestran para las células infectadas XMRV, así como para una línea celular de ratón salvaje, SC1.
En 1/50 HPB se observaron células teñidas positivas al azar, lo que podría ser células basales basa en su localización en la próstata.
PBMCs activadas pueden ser infectados con el XMRV, sin embargo la replicación del XMRV está restringido en PBMCs.
a raíz de la hipótesis publicada por Lombardi et al, que el XMRV puede detectarse en PBMCs de hasta el 67% de los pacientes con SFC, así como en el 4% de los controles sanos [2] nos destinada a accionar PBMCs de pacientes con PCA y los pacientes de control y pantalla para la infección por XMRV la aplicación de diferentes métodos. En primer lugar, establecimos nuestros métodos de detección de XMRV en PBMCs que han sido infectados in vitro con el sobrenadante viral que contiene VP62 XMRV. El material de ADN se utilizó para producir XMRV sobrenadantes infecciosos en las células LNCaP que apoyan fuertemente la replicación XMRV debido a la fuerte activación de la LTR, así como la falta de restricción retroviral factores de expresión APOBEC 3G [36], [38] - [41]. PHA PBMCs activadas in vitro fueron infectadas con las cantidades indicadas de sobrenadante viral (Figura 3) que se cultivaron en presencia de IL2 para otro 7 d. a continuación, Virus que contiene sobrenadante se sometió a ultracentrifugación y gránulos virales (Figura 3A), así como lisado de células (Figura 3B) a partir de las PBMC infectadas se analizaron por transferencia Western asegurar la expresión de proteínas específicas XMRV. Sobre la base de los experimentos de Western Blot utilizando células LNCaP con infección crónica se diluye con el número indicado de células 293T células no infectadas (Figura S2) se puede estimar que aproximadamente el 1-2% de las PBMC están infectados con el XMRV. Sólo si infectan PBMCs con altos títulos virales se detectó de manera eficiente XMRV en el sedimento viral después de la ultracentrifugación y análisis Western Blot (Figura 3A). El ADN genómico aislado a partir de estos XMRV in vitro infectado PBMCs fue positivo para las secuencias de XMRV por PCR usando 650 ng de DNA genómico y dos conjuntos de cebadores diferentes dirigidos gag y env (Figura 4A y Figura S3). La sensibilidad de todas las reacciones de PCR se indica en la figura S4 complementario con toda la PCR detección de 1-10 células infectadas en un fondo de 10
6 células no infectadas.
Se aislaron PBMCs de dos donantes diferentes, agrupados, estimulada por PHA y posteriormente infectados con las cantidades indicadas de XMRV que contiene sobrenadante (carril 1-5). El análisis de Western Blot de lisado de células a partir de PBMCs infectados se realizó 7 d pasado la infección (B). El sobrenadante de las PBMCs infectados se enriqueció para partículas de virus por ultracentrifugación y se tiñeron para la expresión de CA (A). (C) 500 l de sobrenadante que contiene XMRV originó a partir de PBMCs se muestran en A y B se utilizó para infectar células Derse-IGFP que se analizaron para la expresión de GFP 7 d pasado la infección por FACS. Los títulos se indican como GFP infecciosa unidades /ml. (D) La infección de células Derse-IGFP se 100fold aumentó en un cocultivo de PBMC infectados (que se muestran en (A)) con células LNCaP de 7 d, SN de las células LNCaP se aplicó luego a las células Derse-IGFP, que fueron analizados por FACS 5 d pi.
(B) células Derse-IGFP se infectaron con 500 l de sobrenadante 22Rv1 células, las células infectadas simuladas o células LNCaP cocultured con PBMCs XMRV infectados por 14 días. Se controlaron 72 h células Derse-IGFP infección pasada de células positivas para GFP mediante microscopía.
cocultivo de PBMC infectados con el XMRV células LNCaP aumenta significativamente la sensibilidad de la detección de XMRV.
Derse-IGFP células fueron expuestas a sobrenadante de cultivo filtrado de PBMCs infectados XMRV. Se añadieron 500 l de sobrenadante a 5 × 10
4 células Derse-IGFP el que se anotó para la expresión de GFP 7 d p.i. por microscopía y análisis de FACS (Figura 3C). En general, el sobrenadante viral a partir de PBMC es infecciosa, sin embargo, sólo se detectaron muy pocas células positivas para GFP. Curiosamente, si cocultivate las PBMC infectadas con XMRV células LNCaP durante 5 días, recoger el sobrenadante y vuelva a infectar las células Derse-IGFP con sobrenadante filtrado, sensibilidad de detección XMRV utilizando células Derse-IGFP se 100fold aumentó la figura 3D y la figura 4B.
PBMCs de pacientes PCA son negativos para la detección de XMRV por análisis de PCR
el uso de este enfoque se aislaron PBMC de 92 pacientes de PCA y 7 voluntarios sanos por gradiente de Ficoll; PBMCs aisladas se activan PHA y se cultivaron en presencia de IL-2 para 7 d. PBMCs fueron sometidos a diferentes ensayos como contornos en la Figura 5A: aislamiento de ADN genómico seguido de XMRV PCR anidada específica aplicando dos estrategias XMRV PCR publicados [1], [3], [19]; cocultivo de PBMC activadas con células LNCaP para 8 semanas con una infección posterior de las células Derse-IGFP usando sobrenadante 6 semanas y 8 semanas después del co-cultivo. La localización de los diferentes conjuntos de cebadores utilizados se muestra en la Figura S3 y la sensibilidad de los diferentes PCRs XMRV se refleja en la figura S4. La integridad del ADN genómico junto con la ausencia de inhibidores de la PCR putativos se aseguró mediante la amplificación GAPDH (Figura S4). El cultivo de CMSP, preparaciones de ADN y la amplificación por PCR se llevaron a cabo en los laboratorios del Instituto Heinrich-Pette donde no se realizaron otros estudios XMRV. Además, todas las PCR anidada para detectar secuencias XMRV utilizando dos pares de cebadores diferentes dirigidas a la mordaza, ambos publicados recientemente, así como un env PCR se realizaron por dos operadores que utilizan 650 ng de ADN genómico como molde. Se encontró que todas las muestras de ADN a ser consistentemente negativos (Tabla 3). Las reacciones de PCR se controlaron de forma rutinaria para la contaminación del ratón utilizando cebadores dirigidos contra retrotransposones, intracisternal Una partícula (IAP), como recientemente publicado [15]. Ninguna de las reacciones de PCR fue positivo para las secuencias de ADN de ratón (datos no mostrados).
Métodos (a) utilizado para la detección de XMRV en PBMCs de los pacientes de PCA y controles sanos. (B) células Derse-IGFP 72 h p.i. con SN a partir de células LNCaP cocultured durante 8 semanas con PBMCs de pacientes derivada (paneles superiores). Los paneles inferiores muestran celdas Derse-IGFP 72 h p.i. con SN de PBMCs derivadas de pacientes que fueron activadas con PHA durante 7d.
67 muestras de PBMC fueron cocultured con células LNCaP para un máximo de 8 semanas y SN de las células LNCaP se aplicó a la reportera línea celular Derse-IGFP. Esta línea celular lleva un vector MLV, que conduce a la expresión de un reportero GFP si se expresa de la transcriptasa inversa. 72 h p.i. Se monitorizaron las células Derse-IGFP para la expresión de GFP mediante microscopía. De 67 muestras de sobrenadante de PBMC cocultured con células LNCaP, dos resultó en células positivas GFP 2-3 en 5 × 10
4 células (Figura 5B). No se observó un aumento de células positivas para GFP con el tiempo lo que indica que no hubo propagación de la infección viral. Curiosamente, el sobrenadante de las PBMC activadas de estos dos pacientes sin cocultivo también dio lugar a células positivas GFP 1-2 Derse-IGFP por pocillo. En un caso, se realizaron dos aislamientos PBMC independientes de un mismo paciente (# 99 y#100), que tanto dio lugar a células positivas para GFP 1-2 Derse-IGFP. Sin embargo, ambos aislamientos se realizaron en el mismo día por el mismo operador. PCR de células LNCaP cocultured con PBMCs de estos dos pacientes no dieron como resultado la detección de secuencias específicas de XMRV, así como no fuimos capaces de expandir la cultura y las células positivas para GFP-Derse IGFP para su posterior análisis.
Discusión
en este estudio hemos examinado la detección de XMRV en pacientes con cáncer de próstata mediante el estudio de diferentes especímenes biológicos de diagnóstico para detectar la presencia del XMRV o secuencias relacionadas MLV. En particular, se analizaron muestras de tejido de PCA, así como secciones de tejido de otros tumores malignos y tejidos normales para la expresión de proteínas XMRV por IHC. Además, PBMCs de 92 PCA y 7 controles sanos fueron seleccionados para la presencia de secuencias XMRV y la recuperación de virus infeccioso. PBMC se activaron PHA, cocultured para un máximo de 8 semanas y la presencia del XMRV fue examinado por cualquiera de PCR anidada que dos regiones XMRV diferentes, Western Blot análisis utilizando diferentes anticuerpos anti-XMRV o infección de las células Derse-IGFP aplican sobrenadante de PBMC activados o sobrenadante de células LNCaP cocultured con PBMCs de hasta 8 semanas.
no se pudieron demostrar de manera concluyente que las secuencias de XMRV se pueden detectar en PBMCs activadas de pacientes PCA aunque en dos pacientes se detectaron células GFP-Derse IGFP positivos. En ambos casos, los análisis de PCR subsiguiente de PBMC activados, así como células LNCaP cocultivadas fueron negativos para las secuencias de XMRV, así como no encontramos la expresión de proteínas XMRV en secciones PCA de uno de estos pacientes.
previamente publicados que XMRV secuencias se detectaron sólo en raras ocasiones en Alemania usando ADNc generados a partir de ARN de tejido PCA amplificado por PCR [27]. resultados similares para un estudio en los EE.UU. han sido publicados recientemente por Switzer y col., [26]. Sin embargo, hay varios estudios no identifican ningún secuencias XMRV en el tejido PCA, así como hay estudios con mayor prevalencia de XMRV en PCA [3], [9], [21] - [24], [31], [42] . Teniendo en cuenta la posibilidad de la infección por XMRV focal en la próstata que podrían pasar desapercibidas con la amplificación por PCR, debido a que sólo una minoría de las células infectadas establecimos tinción IHC usando el suero anti-XMRV publicados y un suero anti-gag XMRV específica. No fue posible detectar la expresión de proteínas XMRV en tejido, cáncer de mama o cáncer de colon tejido PCA, así como la mayor parte del tejido de control (incluyendo 10 secciones cada una: la glándula suprarrenal, colon, endometrio, epidídimo, corazón, riñón, pulmón, páncreas, placenta, glándula parótida , bazo, estómago, músculo estriado, timo, amígdalas, y testículo) no mostró ninguna tinción positiva para el suero gag K121. Curiosamente, utilizando el suero anti-K121 gag se detectó 1/50 secciones BPH positivos para la expresión de proteínas XMRV. expresión de la proteína se identificó en unas pocas células basales aislados en el epitelio de la próstata. Las células basales están ausentes en PCA, apoyando el hecho de que XMRV más probable es que no está directamente involucrado en el desarrollo de PCA. El pequeño número de secciones de tejido examinado todo el montaje podría explicar la discrepancia entre nuestros resultados y las conclusiones anteriores por Schlaberg et al. [4]. Nosotros sólo diez secciones de tejido teñidas todo el montaje con ambos antisueros, el suero anti-XMRV [4] no se utilizó en TMA secciones debido a la alta tinción de fondo. Aloia et al. y Sakuma et al. tanto discutir una reactividad cruzada del suero anti-XMRV con antígenos de proteína humana que resulta en una tinción positiva IHC en las secciones de PCA [16], [24]. Detectamos alguna reactividad cruzada con el suero anti-XMRV publicada en transferencias Western de lisados de células de análisis a partir de células infectadas y no infectadas, sin embargo no había fondo observado en secciones de parafina de líneas celulares o en secciones enteras de tejido PCA utilizando suero a las diluciones indicadas . Negativo tinción IHC no excluye la posibilidad de que algunas células que portan secuencias proviral XMRV, que se podrían pasar por amplificación por PCR. No se aplicó la tecnología FISH de ADN para detectar la integración proviral XMRV en tejido humano. Evaluación de la señal positiva FISH en 0,1% o menos de las células, especialmente si sólo una copia viral por célula es de esperar, es muy propenso a errores
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Recientemente, Lombardi et al. informaron de detección y transmisión de XMRV infeccioso a partir de PBMCs o plasma de pacientes con CFS por cocultivo con células LNCaP [2]. Curiosamente, el 3-4% de las PBMC aisladas de pacientes de control fueron identificados como positivos para el virus XMRV infeccioso que resulta en la preocupación general por la seguridad de los productos sanguíneos. Varios estudios posteriores motivados por estos resultados no pudieron confirmar estos hallazgos originales. Las razones para la discordancia no son claros y actualmente se investigan. Mientras que la mayoría de los estudios se centraron en las técnicas de PCR, así como la detección de anticuerpos específicos XMRV sólo un estudio incluyó cocultivo de PBMC activados de pacientes con SFC con células LNCaP [10] y un estudio más reciente probado la transmisión del XMRV en plasma (la derivada de SFC pacientes) a LNCaP células [43]. Ambos estudios no detectaron XMRV en ninguna de las muestras analizadas. Centrándose en la posibilidad de que XMRV es un virus espectador reactivado en pacientes con cáncer de próstata junto con el hallazgo de que XMRV se puede detectar en PBMCs de los pacientes [2] se realizaron búsquedas de signos de infección XMRV en las células de sangre de pacientes de PCA aplicando tecnología PCR y cocultivo de PBMCs activadas con células indicadoras.