Extracto
Se encontraron actividades RNasa potentes en el suero de los mamíferos, pero la función fisiológica de las RNasas nunca fue así se ilustra, en gran parte debido a las advertencias en los métodos de medición de la actividad de RNasa. Ninguno de los métodos existentes puede distinguir entre las RNasas con diferentes especificidades de destino. Un estudio sistemático se llevó a cabo recientemente en nuestro laboratorio para investigar la especificidad de sitio de RNasas suero sobre sustratos de ARN de doble cadena, y se encontró que los ARN de doble cadena RNasas suero escinden predominantemente en el 5'-T /A-3 'y 5' sitios de dinucleótidos -C /a-3 ', de una manera muy parecidas a la RNasa A. en base a este hallazgo, un ensayo de FRET fue desarrollado en el estudio actual para medir esta actividad RNasa suero específica de sitio en muestras humanas utilizando un sustrato de ARN de doble hebra . Hemos demostrado que el método tiene un rango dinámico de 10
-5 mg /ml- 10
-1 mg /ml utilizando dilución en serie de la RNasa A. Los sueros de 303 pacientes de cáncer fueron sometidos a comparación con 128 controles sanos , y se encontró que se encontraron actividades RNasa suero visualizados con esta sonda de doble cadena específica de sitio que se reduzca de manera significativa en pacientes con cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de pulmón, mientras que sólo cambios menores se encontraron en pacientes de mama y cáncer de colon. Este es el primer informe utilizando ARN de doble cadena como sonda para cuantificar las actividades específicas de sitio de la RNasa A en un suero. Los resultados ilustran que la RNasa A podría evaluarse adicionalmente para determinar si puede servir como una nueva clase de biomarcadores para ciertos tipos de cáncer
Visto:. Huang W, M Zhao, Wei N, Wang X, Cao H, du Q, et al. (2014) Site-Specific RNasa A La actividad se redujo drásticamente en el suero de los múltiples tipos de pacientes con cáncer. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10.1371 /journal.pone.0096490
Editor: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Noviembre 2013; Aceptado: 8 Abril 2014; Publicado: May 7, 2014
Derechos de Autor © 2014 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Beijing Ciencias Naturales (5132015), Programa Nacional de Investigación básica de China (2011CBA01102), de alta tecnología nacional R & amp; D del Programa de China (2012AA022501), el fondo de Guangdong Departamento de Ciencia y Tecnología (2011B090400478) y el Departamento de Educación China (20090001110052 y 200800010019). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
RNasa A es un endorribonucleasa con funciones en el metabolismo y la regulación de la expresión de genes de ARN. Se encontró que desempeñan un papel en enfermedades tales como enfermedades autoinmunes, insuficiencias renales y el trastorno de páncreas [1], [2], [3], [4]. Más recientemente, también se informó de una actividad antitumoral de una RNasa A con citotóxicos y citostáticos propiedades [5], [6].
En las últimas décadas, las propiedades bioquímicas de RNasa A fueron bien investigados [7]. Como una familia única proteína conservada evolutivo, los miembros de la superfamilia de la RNasa A se componen normalmente de 124 aminoácidos [8]. Los miembros de la superfamilia de la RNasa A se expresan ampliamente y presente en el suero y en los tejidos de los mamíferos [9]. Cinco RNasas, a saber, la RNasa 1, 2 RNasa, RNasa 3, 4 y RNasa RNasa 5, se identificaron en suero humano ya en 1976 [10], [11]. RNasa 1 se encontró más tarde que el homólogo humano de la RNasa A y por lo tanto también se refiere como la RNasa A. humano RNasa A es el componente endoribonuclease predominante en órganos y tejidos humanos [9]. RNasa 2 y RNasa 3 se comportan con una función ribonucleolítica similar [2]. Además de funcionar en mRNA y rRNA 18S degradación, RNasa 4 y 5 RNasa También se informó que tienen una función de la angiogénesis, mientras que la RNasa 5, en particular, podría promover el crecimiento de los vasos sanguíneos [1].
Ranpirnase es una Un miembro de la superfamilia RNasa identificado en rana (rana pipiens) ovocitos [12]. Como el miembro más pequeño de la superfamilia RNasa A, ranpirnase es una hebra única de poli-péptido compuesto por 104 aminoácidos [12]. En la actualidad, es ranpirnase en un ensayo clínico de Fase IIIb, en la que, ranpirnase fue probado para el tratamiento de pacientes con mesotelioma maligno no resecable, cáncer de pulmón y leucemia, y se ha demostrado para aumentar el tiempo de supervivencia en los pacientes tratados [13], [14]. El descubrimiento inesperado de la actividad anticancerígena de ranpirnase dio a entender que otras funciones novedosas podría explorarse más a los miembros de la superfamilia de la RNasa A
.
A los pocos métodos han sido probados para medir los niveles de suero de RNasa. Marcado radiactivamente t-RNA y el sustrato dsRNA fueron utilizados por Saxena y Ben-Artzi para determinar la actividad de RNasa de la angiogenina y RNasa III [15], [16]. ARN hibridado compuesto por una cadena de ARN antisentido 17-mer y el ARN de la línea celular T24 fue utilizada en un estudio para caracterizar la actividad ribonucleolítica RNasa de doble hebra [17]. En un estudio angiogenina, un método FRET fue utilizado por Kelemen
et al.
Para investigar la eficiencia catalítica de la ARNasa. Este método, sin embargo, sólo funciona con niveles extremadamente bajos de RNasa [18]. Sorprendentemente, a pesar de que estos métodos son similares en principio, los resultados obtenidos de estos ensayos no fueron consistentes. Reddi
et al. Y usados poli-C como sustrato para determinar el nivel de RNasa midiendo el sustrato que queda después de tratamiento con RNasa [19]. El método fue utilizado por Funakoshi y otros grupos en 1976 y se obtuvieron relaciones significativas entre los niveles de RNasa y enfermedades en el páncreas, incluyendo cáncer de páncreas y pancreatitis [20], [21], [22]. En aproximadamente el mismo tiempo, Marabella demostró un método para llevar a cabo ensayo de RNasa, usando ARN de levadura como sustrato [23]. Más adelante, se utilizó un método de yodación de etiquetar ARN ribosomal. El uso de un sustrato marcado radiactivo, el sustrato restante se determinó cuantitativamente, utilizando un espectrómetro de centelleo auto-gamma [24]. Por medio de este protocolo, Kurihara
et al.
Midió la actividad de RNasa en el suero, y se encontró que los niveles de suero de RNasa no se correlacionaron con la histología del cáncer, en lugar que muestra una correlación con algún índice fisiológica [25]. Además, químico sintetizado poli-C, así como t-ARN extraído de
E. coli
, se utilizaron como sustratos en ensayo de RNasa por Kemmer
et al.
[26]. A pesar de que las mediciones de nivel de RNasa suero se llevaron a cabo en estos estudios, la capacidad insuficiente para diferenciar RNasa individual en una mezcla podría haber sido el obstáculo técnico que impidió a los investigadores para llegar a los resultados de consenso en los diferentes estudios RNasa suero.
En el año 2003 , Czauderna
et al.
investigó la estabilidad en suero de siRNA y se encontró que la degradación se debió principalmente a la escisión endorribonucleasa. También encontraron que, cuando se modificaron algunos sitios críticos, estabilidad en suero de los siRNAs se mejoró significativamente [27]. Más tarde, Turner y los estudios de Haupenthal indicaron que la RNasa A jugó un papel esencial en la degradación de suero de siRNA en los mamíferos [28], [29]. Posteriormente específicos del sitio patrones de escisión en C-A, U-G y sitios U-A fueron identificados por Volkov [30]. En un estudio previo realizado with125 siRNAs, que ilustra además que la escisión de los ARN de doble cadena se produjo principalmente en dos sitios, 5'-C /A-3 '(5'-T /G-3' en la hebra complementaria) y 5 sitios '-U /a-3' dinucleotide [31].
En el presente estudio, hemos diseñado un marcado con fluorescencia dual ARN dúplex que contenía un sitio de corte 5'-C /a-3 'como el concreto substrato para la RNasa A. suero método de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET), una tecnología óptica de alta sensibilidad, para estudiar la dinámica de la reacción entre sustratos marcados con fluorescencia y RNasa a, para construir una curva de calibración para correlacionar los niveles de RNasa con la cantidad Empleamos de los productos catalíticos con el fin de deducir la RNasa a nivel del suero. Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de controlar la actividad de RNasa A en el suero de pacientes con cáncer. Se comparó la RNasa A nivel de los pacientes con 11 tipos de cánceres con la de los controles sanos, y encontramos el suero de RNasa A nivel en pacientes con cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de hígado y cáncer gástrico son significativamente regulados hacia abajo en comparación con la de los controles sanos (P & lt; 0,001), mientras que el nivel de RNasa suero de cáncer de mama y pacientes con cáncer de colon no era muy significativamente diferente de la de los individuos sanos
resultados
Diseño y caracterización de una sonda FRET para el suero RNasa Medición
un hecho bien conocido en biología molecular es que los ARN de cadena simple son muy inestables en la mayoría de las circunstancias, en particular en el presencia de las ribonucleasas. Los procesos de degradación rápidos hacen que sea muy difícil de controlar el proceso de degradación en tiempo real. Esta situación conduce, a las dificultades para establecer medidas cuantitativas de la actividad RNasa.
A diferencia de los ARN de cadena simple, ARN de doble cadena son generalmente mucho más estable. En un estudio reciente de perfiles de la degradación de suero de siRNAs de doble hebra, se encontró que los dos ARN de doble cadena larga y corta se degradan predominantemente en dos sitios susceptibles, a saber, 5'-T /A-3 'y 5'-C /A 3 'sitios de dinucleótidos [31]. Basándose en este hallazgo, se especuló que los ARN de doble cadena pueden ser utilizados como un sustrato para medir la actividad de RNasa suero. Con este fin, una secuencia de ARN de doble cadena fue diseñado para llevar una sola /A-3 sitio susceptible 5'-C ', que se confirmó en el ensayo de degradación (Figura 1A). RNasa A es la RNasa predominante en el suero humano que media el proceso de degradación de tales dsRNAs (Figura 1B). Para facilitar el seguimiento del proceso de degradación de esta sonda en tiempo real, un sistema de FRET fue diseñada por la integración de un FAM fluorescencia del donador y un aceptor de fluorescencia TAMRA en el extremo 5 'de cada uno de cadenas de ARN de componentes. Mientras el dúplex de ARN mantiene intacto, los dos colorantes fluorescentes marcados en el extremo están lo suficientemente cerca para mediar en la transferencia de energía del donante al aceptor (Figura 2A), que conduce a un pico de emisión a 575 nm cuando se excita a 480 nm (Figura 2B ). Cuando se degrada el dúplex, se interrumpirá la transferencia de energía desde FAM para TAMRA, y pico de emisión pasará de 575 nm a 515 nm, en las mismas condiciones de excitación (Figura 2B). Por lo tanto, la medición del cambio del pico de emisión a 515 nm se puede usar para controlar el proceso de degradación del ARN dúplex y reflejar la actividad de la RNasa en el sistema (Figura 2C).
A) La degradación de una 1860 pb de longitud RNA duplex se realizó en RNasa A. fragmentos de degradación se extrajeron y se secuenció. Mediante la alineación de los fragmentos de degradación de la secuencia de ARN original, se identificaron los sitios de escisión y se presentan en términos de la relación para cada posible sitio dinucleótido [31]. B) Ensayo de la degradación del ARN dúplex. RNA dúplex de doble etiquetado se incubó separadamente con RNasa A, la mezcla de la RNasa A y RNasa inhibidor A, suero humano, la mezcla de suero humano y RNasa inhibidor A. Las muestras se recogieron y se ejecutan en un gel PÁGINA desnaturalizado.
A) Representación esquemática del ensayo de RNasa a base de FRET. El RNA dúplex (13 pb) era de doble etiquetado con una fluoresceína (FAM) como donante y tetrametilrodamina (TAMRA) como aceptor en cada extremo. B) espectro de fluorescencia normalizada de ARN dúplex (13 pb) se incubaron con (línea verde) o sin (línea roja) RNasa /suero a 25 ° C durante 15 minutos. C) RNA Duplex degradación medición ensayo en tiempo real. RNA Duplex se recoció y se incubó en tampón de hibridación a 25 ° C. RNasa o suero se añadió en el momento indicado. La fluorescencia del donante (FAM) se registró en tiempo real (puntos negros). Las muestras en tiempo diferente (de izquierda a derecha: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) se recogieron y se ejecutan en un gel desnaturalizado PÁGINA (recuadro). La fluorescencia fue escaneada en Typhoon que muestra la cantidad restante de larga duración ARN de doble cadena.
Está bien establecido que la eficacia de transferencia de energía depende principalmente de la distancia y la orientación relativa de la donante y el aceptor de fluorescencia en el sonda [32]. Por un lado, una sonda corta aumenta la eficiencia de transferencia de energía en la FRET, mientras que por otro lado, una sonda más larga tiene una temperatura de fusión más alta y es más estable. Se estudiaron ARN dúplex de 8 y 13 pb para optimizar la longitud del sustrato. Los resultados mostraron que el sustrato 13 pb, con secuencias 5 'AUGAGCCUGAUUU-3' /3'-UACUCGGACUAAA-5 ', era óptima para la detección de FRET. Este dúplex de ARN se utilizó entonces como el sustrato de reacción en el estudio.
Optimización del sistema de ensayo
Para medir la actividad de RNasa en el sistema, cuatro microlitros de 5 mM de sustrato de doble etiquetado de ARN se añadido en 2 ml de tampón FRET con agitación constante. Antes de añadir de RNasa o muestras de ensayo, una curva de referencia se registró a 480 nm de excitación durante unos 30 segundos, utilizando un QuantaMaster 30 espectrofluorímetro (Photon Technology International, Birmingham). A continuación, se añadieron una solución de prueba o muestras de RNasa al sistema de reacción, y la fluorescencia se registró a 515 nm en un intervalo de 3 segundos durante 15 minutos. Para el análisis de datos, la fluorescencia de fondo se resta de la fluorescencia de la muestra para obtener una curva en tiempo real, a fin de controlar el proceso de degradación en tiempo real durante el tratamiento (Figura 2C). Un método de regresión no lineal (ecuación de un solo exponencial) se utilizó para ajustar los datos y obtener la constante K
obs de la reacción de degradación (Figura 3A).
A) La cuantificación de la degradación en el ensayo de FRET. La intensidad fluorescente FAM se convierte como la relación de la degradación mediante la definición de parte inferior y la intensidad de fluorescencia superior como 0% y 100%. El fondo es la intensidad de fluorescencia de longitud completa de doble etiquetado ARN de doble cadena; la parte superior es la intensidad de fluorescencia de FAM etiquetados sola hebra de ARN. El Delta F
max se definió como 100%. La lectura de fluorescencia de las muestras se ajustaron a la ecuación de un solo exponencial (línea roja) para obtener la constante de velocidad K
obs. El porcentaje de degradación en un momento dado se calculó como 100 ×? F /? F
max. B) La degradación de ARN de doble cadena de doble etiquetado en diversas concentraciones de RNasa A, supervisado por el ensayo de FRET (de abajo a arriba: 10
-7 mg /ml, 10
-6 mg /ml, 10
- 5 mg /ml, 0,001 mg /ml, 0,003 mg /ml, 0,006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) Curva estándar de RNasa A la concentración y K
obs. K
se obtuvieron obs como se describe en la Figura 3A. D) K
obs patrón de cambio en tratamiento de congelación-descongelación. K
obs se determina a partir de muestras de suero humano congelado en -80 ° C, y se descongela a temperatura ambiente de 0 a 6 veces.
De este modo, una curva estándar se estableció midiendo RNasa a la actividad en soluciones diluidas en serie de RNasa a, en un intervalo de concentración between10
-7-10
-1 g /l (Figura 3C). Para cada concentración, una curva de cinética se registró (Figura 3A), y se hizo una curva de referencia de acuerdo con el calculado K
obs para describir la relación entre la actividad y la concentración de RNasa A. Una curva simulada mostraron que la degradación actividad aumentó rápidamente cuando la concentración de RNasa se incrementó (Figura 3C). Los resultados mostraron que una relación lineal dentro de un amplio intervalo de concentraciones de RNasa A de 10
-7-10
-3 g /l. Después de la adición de RNasa A 10
-7 g /l, la intensidad de la señal fluorescente aumentó a.u. 1000, la relación señal ruido era 2 veces. El límite de detección del ensayo de FRET era 10
-7 g /l. Cuando el ensayo de RNasa se realizó con 1 × 10
-6 g /l de RNasa A, la intensidad de la señal fluorescente se incrementó de 41.000 a.u. a 58.000 a.u., y el ruido en este ensayo fue de 500. La relación de ruido de la señal en virtud de 1 × 10
-6 g /l es 34 veces. De acuerdo con esta relación señal ruido, el rango detectable era tan bajo as1 × 10
-6 g /l. La regresión no lineal R
2 a 1 × 10
-6 g /l de concentración fue 0,9856. Bajo la concentración de 1 × 10
-5 g /l, la regresión no lineal R
2 fue de 0.9945. Por otra parte, la intensidad de la señal fluorescente se incrementó de 43.000 a.u. a 78.000 a.u., y la relación de ruido de la señal era 70 veces. De acuerdo con el R
2 y la relación de ruido de la señal, se concluye que el intervalo de concentración de RNasas que se puede medir fácilmente por este método debe ser de 1 × 10
-5-,1 g /l.
a fin de validar este sistema de ensayo, se midieron las actividades de RNasa muestras de suero humano que han sido objeto repetidamente tratamiento de congelación-descongelación. Al congelar las muestras a -80 ° C y descongelación en hielo durante varias veces, se midieron las actividades de RNasa de las muestras utilizando el método FRET actual. Se encontró que la RNasa podría sobrevivir múltiples ciclos de congelación-descongelación y sin ninguna pérdida de actividad, lo que indica el método actual se puede utilizar para muestras clínicas congeladas (Figura 3D).
Medición Serum RNasa La actividad en los pacientes de cáncer
Utilizando esta medición basado en FRET de la actividad de RNasa, se estudió un conjunto de muestras de suero humano, incluyendo 55 individuos sanos y 34 pacientes de cáncer que cubren algunos tipos comunes de cáncer. La curva estándar se ha descrito anteriormente se utilizó para calcular las concentraciones de RNasa suero relativas de muestras de suero humano, y luego se comparó la concentración de RNasa relativa de los pacientes de cáncer a la de los individuos sanos (media de los controles normales arbitrariamente se fijó a 100%). Los resultados mostraron que los niveles séricos de RNasa fueron significativamente las reguladas para los 7 tipos de tipos de cáncer (Figura 4).
Suero actividades RNasa se determinaron para las personas sanas, así como 4 pacientes con cáncer gástrico, los pacientes con cáncer de colon 5 , 5 pacientes con cáncer de pulmón, 5 pacientes con cáncer esofágico, 5 pacientes con cáncer de riñón, cáncer de útero 5 pacientes y 5 pacientes con cáncer de páncreas. La concentración de RNasa de cada muestra de suero se calculó mediante la curva estándar y K
obs obtenido a partir de la ecuación de un solo exponencial. La actividad RNasa suero relativa de cada paciente de cáncer se cuantificó mediante la normalización de la concentración de suero del paciente con cáncer de la concentración media de las muestras de suero de los individuos sanos.
Para confirmar estas observaciones, las muestras de suero adicionales se recogieron de pacientes con cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de pulmón, en un tamaño de muestra de 303 pacientes de cáncer en total. La evaluación de estas muestras demostró una baja regulación de los niveles séricos de RNasa en el cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de pulmón (Tabla S1). No se observaron cambios evidentes de los niveles séricos de RNasa para pacientes con cáncer de mama y pacientes con cáncer de colon. Estos resultados apoyan en gran medida nuestras observaciones anteriores. El cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de pulmón de grupos de pacientes difería de grupo sano con un valor de P menor que 0,001. En comparación, el valor P para el grupo de cáncer de mama fue sólo 0,0619, mostrando ninguna diferencia obvia entre el grupo de control (Figura 5). Tomados en conjunto, estos datos indican que la baja regulación de la actividad de RNasa de suero es un fenómeno general en muchos tipos comunes de cáncer. Esta observación dio a entender un potencial de RNasa específica del sitio como un biomarcador de cáncer común.
Los niveles séricos de RNasa se cuantificaron los individuos sanos, así como 37 pacientes con cáncer de cuello uterino, 37 pacientes con cáncer de esófago, los pacientes con cáncer de riñón 37, 24 de pulmón los pacientes con cáncer, 10 pacientes cáncer de vejiga, 21 pacientes con cáncer de páncreas, 23 pacientes con cáncer de ovario, 32 pacientes con cáncer de hígado, 27 pacientes con cáncer gástrico, 31 pacientes con cáncer de colon, y 24 pacientes con cáncer de mama (para más detalles de los datos véase el cuadro S1).
Hubo 32 cáncer de hígado probado, la actividad relativa media en comparación con el control normal fue de 32,9%, con P & lt; 0,0001. De las 32 muestras, solamente 1 muestra cayó en rango de actividad de control. suero veintisiete gástricas los pacientes de cáncer se pusieron a prueba, la actividad relativa media fue de 38,8%, con P & lt; 0,001. Hubo 24 pacientes de pulmón suero de cáncer 'se pusieron a prueba, la actividad relativa promedio fue de 29,1%, P & lt; 0,0001. 'suero y 35 cervicales pacientes con cáncer treinta y siete del esófago de pacientes con cáncer de suero, suero de cáncer de 37 pacientes renales' y 21 cáncer de páncreas se han probado y demostrado que tiene un 21,1% con P & lt; 0,0001, un 20,2% con P & lt; 0,0001, el 27,6% con P & lt ; 0,0001, 29,4% con P & lt; 0,0001, respectivamente. Había se midieron 23 sueros de ovario de pacientes con cáncer, la actividad relativa de cáncer de ovario fue del 28,6%, con P & lt; 0,0001, y en un caso se ha caído en el rango de control. Para el cáncer de vejiga también se observó un caso excepcional que cayó en el rango normal, mientras que la actividad relativa promedio fue de 29,5%, con P & lt; 0,0001. El cáncer de mama no ha dado la pauta reguladas por similares RNasa con todos los otros 10 tipos de cánceres, la actividad relativa de cáncer de mama fue del 61,4%, ligeramente inferior a los individuos normales, pero el análisis estadístico sugiere una diferencia tal vez no sea significativa (P = 0,0619). Una situación similar se encontró en pacientes con cáncer de colon estudiados con la RNasa relativa media Una actividad al 54,5% y P & lt;. 0.05
No hay diferencia en los niveles séricos de RNasa entre pacientes con cáncer de colon primario y metastásico
niveles de RNasa fueron examinados en pacientes con cáncer de colon primarios y metastásicos, a fin de explorar si los valores de toda la extensión de las actividades de ARNasa en el suero de pacientes con cáncer de colon eran debido a la mezcla de fases, y si las diferencias de actividad de RNasa que se pueden utilizar para discriminar diferentes etapas de este cáncer. Las muestras de suero se obtuvieron de pacientes con cáncer de colon primarios y metástasis por quien las etapas de la metástasis se determinaron mediante el examen de la biopsia de tejido. Las muestras de suero de diez pacientes con metástasis de ganglios linfáticos y 10 sin metástasis se recogieron y analizaron, utilizando el ensayo de FRET de RNasa. Los resultados no mostraron diferencias entre los dos grupos (Figura 6).
Estas actividades ron RNasa de 10 pacientes con cáncer de colon primarias y 10 pacientes con cáncer de colon metástasis se cuantificaron mediante un ensayo de FRET.
Discusión
una correlación entre los niveles séricos de ARNasa y el cáncer de páncreas fue reportado por primera vez por Reddi en 1976. Usando un método óptico, que mide el nivel de RNasa suero mediante la cuantificación de su actividad en poli-C ARN, un no sustrato RNasa específica [19]. En finales de 1970 y principios de 1980, radioinmunoensayo se llevó a cabo en la medición de la RNasa [24], [25], y en algunos estudios E. coli tRNA se utilizó para reemplazar poli-C como sustrato de ensayo [26], estas mejoras aumentan la precisión de la medición de RNasa. Varios estudios se han llevado a cabo para investigar los niveles séricos de RNasa en los pacientes con carcinoma maligno, tumor benigno, fumador, insuficiencia renal, y en particular los pacientes con pancreatitis y cáncer de páncreas. Estos estudios revelaron sin embargo un cuadro mixto [22], [24]. Aunque Funakushi y grupos Kemmer reportaron un aumento en los niveles de RNasa en suero en pacientes tanto con cáncer de páncreas y pancreatitis [21], [26], grupos Reddi y Warshaw sin embargo encontró que el nivel de RNasa aumentó sólo en pacientes con cáncer de páncreas [19], [22], mientras que los niveles de RNasa suero de pacientes con pancreatitis estaban en un nivel similar como controles sanos [19], [22]. grupos Mitsuhashi y Kurihara, por otra parte, encontraron que los niveles de RNasa suero relacionados solamente con la edad, el tabaquismo, así como algún otro índice fisiológico, incluyendo nitrógeno ureico en sangre y el contenido de albúmina [25]. Además, un estudio reciente informó de niveles elevados de RNasa suero en pacientes con diabetes mellitus juvenil [33]. Sin embargo, otro informe muestra que la RNasa 1 ha cambiado su nivel de expresión por microarray y el método Western Blot durante el desarrollo del cáncer gástrico [34].
Estas discrepancias pueden ser causados por la complejidad del ensayo de Reddi, por ejemplo, la terminación de la reacción etapa o las etapas de purificación de sustancias. En estos ensayos, los sistemas de reacción se dejaron en hielo durante bastante tiempo, antes del alta dosis de HClO
4 se añadió para detener la digestión. Sin embargo, en nuestro estudio, se observó que el tratamiento con baño de hielo no pudo abolir completamente la actividad de RNasa. Adicional, la purificación de polinucleótido sin digerir podría ser otro paso de complicación para el ensayo de Reddi. En este paso se usó una centrifugación fácil de quitar di-nucleótidos y tri-nucleótido resultante de la digestión de RNasa. Este proceso, sin embargo también podría también eliminar algunos polinucleótidos más largos que no fueron digeridos por completo, por lo tanto, conduce a la actividad sobre-estimado de RNasa suero.
Un ensayo de FRET fue utilizado en nuestro estudio para registrar la intensidad de fluorescencia en tiempo real, a fin de evitar el proceso de terminación de la reacción y la etapa de purificación. El registro de los cambios de la señal de fluorescencia en tiempo real, y el uso de una sonda FRET que tiene sólo un sitio de escisión de ARNasa A, al parecer permitido un cálculo exacto de la K
obs para la reacción.
En el presente estudio, un método basado en FRET se estableció para medir los niveles séricos de RNasa consistente con una alta sensibilidad para detectar un precio tan bajo como 1 × 10 RNasa
-7 g /l. En este estudio, el rendimiento de espectrofluorómetro se optimizó sistemáticamente utilizando el espectro Raman de agua. Esto se ha encontrado para mejorar la calidad de la medición y la reproducibilidad entre ensayos. Mediante la aplicación de un volumen de reacción de 2 ml, que fueron realmente capaces de medir el nivel sérico de ARNasa sin dilución en serie, la desviación potencial de este modo evitar una dilución provocada por 1000 Tiempo en otros protocolos.
El redescubrimiento del mundo del ARN tiene dibujado más y más atención a una variedad de RNasas que funcionan en la modificación de ARN y el metabolismo. De este modo un método fiable de RNasas A de detección puede ser plausible para tales estudios. El ensayo FRET establecido en el presente estudio no se limita únicamente a la medición de RNasa en muestras de suero, pero también se puede utilizar en muchas otras pruebas clínicas y análisis científicos. Con la interpretación de los resultados, como la disminución observada de las RNasas una actividad en el suero de cierto tipo de pacientes con cáncer, un grano de precaución necesitan ser tomadas, ya que no estaban tomando medicación de pacientes diferentes en cuenta, y hay una necesidad de determinar si cualquier medicamento puede inhibir la actividad de RNasa A. La estadificación de los pacientes sometidos a medición RNasa suero es obviamente uno de los factores más importantes a considerar antes de alistarse RNasa como un biomarcador potencial, y por esta razón más pacientes con cáncer en fase inicial se debe probar para rastrear la detección inicial de disminución de la RNasa A la actividad .
Materiales y Métodos
Recogida de muestras humana y Ética Declaración
Este estudio ha seguido la Declaración de Helsinki, y llevado a cabo de acuerdo con los principios aprobados por las juntas de revisión ética de la el hospital del cáncer, Academia china de Ciencias médicas (Pekín, china). Se proporcionó el consentimiento informado por escrito para la toma de muestras y su posterior análisis. En total, se recogieron 431 muestras de suero de individuos sanos y pacientes de cáncer y se analizaron en el estudio. Las características de los pacientes de cáncer se describen en la Tabla 1. Los sueros fueron almacenados a -80 ° C después de la recogida.
oligonucleótido de síntesis y preparación
Dos oligonucleótidos de ARN complementarias y marcados con fluoróforo con secuencias de 5'-FAM-AUGAGCCUGAUUU y 5'-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU se sintetizaron y se purificaron por TAKARA (Dalian, china). Las concentraciones del oligonucleótido de ARN se determinaron midiendo la absorción a 260 nm, utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. El coeficiente de extinción también se midió a 260 nm, lo que resulta en 140.860 L /(mol * cm) para el oligonucleótido de ARN marcado con FAM y 156.900 L /(mol * cm) para el oligonucleótido de ARN marcado con TAMRA. Los dos oligonucleótidos de ARN complementarias se mezclaron en un tampón de hibridación (5 mM Tris-HCl, pH = 7,6, NaCl 10 mM) a una concentración de 5 mM. La mezcla se incubó a 95 ° C durante 5 min en un ciclador térmico, y después la temperatura se disminuyó en 5 ° C por cada 5 min para permitir la formación de dúplex. Los dúplex resultantes fueron examinadas en un gel de poliacrilamida al 20% y se visualizaron por tinción con SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.).
Ensayo de FRET
Las medidas de fluorescencia se llevaron a cabo en tampón de FRET (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, MgCl 0,002
2), utilizando un QuantaMaster 30 espectrofluorímetro (Photon Technology International, Birmingham).
En 2 ml de buffer FRET, se añadieron 10 nM de ARN dúplex que se está agitación constante. La longitud de onda de excitación se fijó a 480 nm, y se midió la señal de espectro de emisión entre 500 a 650 nm. Un aumento en la emisión de fluorescencia a 515 nm indica el progreso de la escisión de ARN. Un ejemplo de los datos recogidos se presenta en la Figura 2C
.
Para la normalización de datos, un 13 pb intacta siRNA se analizó como control dúplex, y un siRNA completamente escindido se incluyó como un control de la degradación. Las intensidades fluorescentes FAM se convirtieron como relación de la degradación mediante la definición de inferior y superior intensidades fluorescentes como 0% y 100%. El método de normalización se mencionó en la Figura 3. Las lecturas de fluorescencia se ajustaron a la ecuación de un solo exponencial (línea roja) para obtener la constante de velocidad K
obs. El porcentaje de degradación en un momento dado se calculó como 100 ×? F /? F
max (Figura 3A).
Para garantizar la condición libre de RNasa, fijamos la longitud de onda de excitación a 480 nm, y examinamos la emisión entre 500 a 650 nm de sustratos intactos. sustrato intacto muestra una baja señal en 515 nm y una alta señal en 575 nm, mientras que los productos degradados resultados en señales elevadas en 515 nm.
De acuerdo con la descripción anterior, cuando el doble siRNA marcado 13-bp en 2 ml de FRET tampón se mezcla con la solución de suero o muestras de RNasa a, la fluorescencia de FAM se incrementaría. El cambio de fluorescencia se controló en el tiempo con la longitud de onda de excitación ajustado a 480 nm y emisión a 515 nm. Para el análisis de la cinética de un solo volumen de negocios, la constante de velocidad k
obs y la amplitud de la degradación máxima F
max se deriva ajustando los datos experimentales a la de un solo exponencial ecuación:.
Identificación de los sitios de escisión de ARNasa
Para localizar los sitios de escisión de ARNasa, productos de degradación de ARN de doble cadena se extrajeron y se clonan utilizando como kit de extracción de gel de ARN centro comercial y kit de clonación de Takara (Kyoto, Japón).