Extracto
Objetivos
La señalización hedgehog vía juega un papel importante en la EMT de las células de cáncer de páncreas, pero los mecanismos precisos siendo difícil de alcanzar. Debido S100A4 como se encontró un marcador clave EMT moleculer que se upregulated en Gli1 en las células de cáncer de páncreas, nos hemos centrado en la relación entre las señales de Shh-Gli1 y los genes de la familia S100.
Métodos
En el la base de datos de cDNA microarray, hemos investigado mecanismo de regulación de Gli1 a algunos miembros de la familia S100A genes en líneas celulares de cáncer de páncreas en primer lugar. Entonces, la regulación de Gli1 al gen S100A4 se estudió mediante ensayos de biología molecular y la effection pro-metástasis de S100A4 Gli1 dependientes se investigó in vitro. Por último, las expresiones de Shh, Gli1, S100A4 y E-cadherina en los tejidos de cáncer de páncreas se estudiaron mediante el uso de ensayos de inmunohistoquímica.
Resultados
Cinco miembros de la familia de genes S100, S100A2, S100A4, S100A6, s100a11, y S100A14 se han encontrado para ser regulados a la baja de manera significativa al Gli1 caída. Gli1 predicción promotor de la combinación con los datos in vitro demostró que Gli1 regula principalmente miembros de la familia S100A a través de elementos que actúan en cis. De hecho, los datos indican S100A4 y genes vimentina se upregulated significativamente por Shh /Gli1-expresión creciente y E-cadherina se redujo significativamente al mismo tiempo. La migración de las células PC se incrementó significativamente de una manera dependiente de la dosis de la expresión Gli1 (P & lt; 0,05) y siS100A4 invierte significativamente la respuesta de las células PC inducidas por L-Shh transducción (P & lt; 0,01).
Conclusión
Nuestros datos establecen una nueva conexión entre Shh-Gli1 de señalización y regulación S100A4, S100A4, que implica que podría ser uno de los factores clave en la EMT mediadas por Shh-Gli1 de señalización en el cáncer de páncreas.
Visto : Xu X, Su B, C Xie, Wei S, Zhou Y, Liu H, et al. (2014) Sonic Hedgehog-Gli1 vía de señalización Regula la transición epitelial mesenquimal (EMT) por mediación de un gen nuevo objetivo, S100A4, en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10.1371 /journal.pone.0096441
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Marzo, 2013; Aceptado: 8 Abril 2014; Publicado: July 29, 2014
Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81072005, 81172312 y 81101839). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas representa una de las principales causas de muerte por cáncer en los países industrializados [1]. El mal pronóstico de esta enfermedad se debe principalmente a su metástasis sistémica temprana [1] - [3]. Un gran número de estudios han demostrado que la transición epitelial mesenquimal (EMT) podría ser un mecanismo clave de las células de cáncer de páncreas se separe de la localización del tumor primario y diseminarse a órganos lejanos. Sin embargo, las vías de señalización de la EMT-iniciando ahora siendo difícil de alcanzar en las células de cáncer de páncreas. Recientemente, hedgehog (Hh) vía de señalización se ha demostrado ser un importante promotor del crecimiento del tumor en varios cánceres del tracto gastrointestinal [4], [5]. Como el cáncer de páncreas, se ha demostrado que la activación aberrante de la vía de señalización Hh fue el resultado de la sobreexpresión de sonic hedgehog (Shh) en la mayoría de los casos [6] - [8]. Un gran número de estudios han demostrado que los principales mecanismos de la vía de señalización Hh en las células cancerosas fueron promover proceso epitelial mesenquimal (EMT) [9] - [11]. Por otra parte, se ha demostrado que el bloqueo de esta vía significativamente inhibido metástasis de las células tumorales in vivo y en modelos de xenoinjerto [12], [13].
Puesto que los genes diana de Gli1 fueron los mecanismos clave de la vía de señalización Hh, hemos tratado de comprender sus mecanismos pro-metastásicos por identifing los objetivos de Gli1 en las células de cáncer de páncreas. Como una llave gen diana pro-metastásico del cáncer de páncreas en Gli1 debe tener las siguientes características: En primer lugar, hay elementos eficaces que actúan en cis Gli1 en su secuencia génica; En segundo lugar, su transcripción estaba regulada positivamente por Gli1; En tercer lugar, se reguló en la mayoría de los tejidos de cáncer de páncreas y de su nivel de expresión se correlacionó positivamente con la señalización de Hh; En cuarto lugar, su debe ser un factor funcional pro-metastásico clave. En el estudio anterior, hemos realizado una investigación sistemática sobre los perfiles de genes diana sobre Gli1 en línea celular de cáncer de páncreas metastásico-alta a través de microarrays de ADNc y encontró que 5 los miembros de esta familia de genes se upregulated por Gli1. Especialmente, la S100A4 como marcador moleculer clave que promueve proceso de EMT en el cáncer de páncreas se encontró que se upregulated más de 3 veces en este estudio. Sobre la base de estos estudios se centró en la relación entre las señales de Shh-Gli1 familia de genes y S100.
En este estudio, hemos analizado la Gli1 presagiar sitios dentro de las secuencias de ADN de los genes de la familia S100 con herramientas de bioinformática y bases de datos. Por otra parte, hemos intentado identificar nuevas conexiones de la vía de señalización de Shh-S100 Gli1 con la familia de genes y para demostrar la función pro-metastásico del gen S100A4 mediada por señales de Shh-Gli1 en el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
los cultivos de células
las líneas celulares humanas de PC, BxPC3, AsPC-1 y Panc-1, fueron todas las líneas celulares comerciales y que obtienen estas líneas celulares del Instituto de Citología de la Academia china de las células Science.These líneas fueron ampliamente utilizados en la investigación del cáncer de páncreas [14] - [18]. Tres líneas celulares fueron todos cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire.
vectores La construcción y las células infección
Lentiviral Los vectores de transferencia para personas Gli1 shRNA o Shh ADNc se construyeron mediante Genechem Co., Ltd, Shanghai, china. Este sistema incluye la pLVTHM lentiviral vector, el plásmido envuelve pMD2G, y el plásmido de empaquetamiento PRSV-REV y pMDLg-pRRE. El lentivirus-Shh (L-Shh) contenía una secuencia de codificación de 3,3 kb para Shh y lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) contenía Gli1 pequeños ARN de horquilla (5'-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ') a la secuencia de dirección de la shRNA como descrito anteriormente [19]. El control de lentivirus (L-C) que no incluía las secuencias de interferencia Gli1 o secuencias de ADNc de Shh sirvió como control. Finalmente construcciones lentivirales se verificaron mediante secuenciación del ADN para asegurar la exactitud. lentivirus recombinante se produce mediante transfección transitoria de células 293T siguiendo un protocolo estándar. Cuando las células BxPC3, AsPC-1 y Panc-1 fueron aproximadamente 50% de confluencia en RPMI-1640 que contenía FCS al 2%, que fueron infectadas con las construcciones de lentivirus a MOI 5. Las células se recogieron después de 72 horas para experimentos adicionales. Para identificar funcional L-Shh y L-Gli1i construye, se analizaron de forma rutinaria Shh y Gli1 expresión de QRT-PCR y transferencia de Western.
S100A4 transitoria Derribo
Se utilizó una secuencia de ARNi (siS100A4 ) y una secuencia de control negtive (siS100A4 MIS), que ha demostrado caída eficiente de S100A4 en las células HT29 de cáncer de colon humano en un informe anterior [20]. S100A4 desmontables se controló mediante la determinación de sus niveles de ARNm y de la proteína después de 48 h a siRNA transfección, respectivamente. Y a continuación, se utilizaron las células para ensayos de Transwell. Las células fueron a lipofección con los siRNAs utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en acuerdo con las instrucciones del fabricante.
extracciones de ARN y en tiempo real los ensayos de RT-PCR
muestras de ARN totales se extrajeron con el reactivo Trizol (Invitrogen ) de acuerdo con el protocolo del fabricante y el ARN total 100 ng fue transcrito inverso en un volumen de 20 l y 2 l de cDNA usado para la PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Takara Biotecnología, Dalian, China). El primer secuencias fueron vistos en la tabla 1. Los valores de CT (ciclo umbral) fueron normalizados a valores CT de GAPDH.
extracciones de proteínas y ensayos de Western Blot
se extrajeron muestras de proteínas totales con tampón RIPA de acuerdo con el método estándar y las muestras se normalizaron para el contenido de proteínas mediante un kit disponible comercialmente (Bio-Rad Company). Igual cantidad de proteína se utilizaron para los ensayos de transferencia de Western de acuerdo con el protocolo estándar para Shh, Gli1, S100A4, E-cadherina, VIM (vimentina) y la detección de GAPDH.
Transwell ensayos
Cell invasión de ensayo-24 muestras kits (Chemicon, Bedford, MA) se utilizaron para estudiar la invasión /migración de las líneas celulares PC. Después de la incubación 24 horas, los recuentos de migración de las células PC se obtuvieron fotografiando la membrana a través del microscopio. Los conteos se toman en 5 zonas más altas células a una magnificación de alta energía (x200). El valor medio de los campos que contaba era considerado como el recuento de la migración de las células PC.
El formaldehído entrecruzamiento ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (XChip) guía
Los ensayos se llevaron a cabo XChip como los estudios previos [21]. En resumen, la cromatina de las células AsPC-1 se recogió (3 × 10
7) con 1 ml de tampón IP que contiene un cóctel inhibidor de proteasa. La cromatina se cortó mediante el uso de un aparato de ultrasonidos en una caja de hielo (6 rondas de 10s legumbres, 350 W, 60 segundos de intervalo) y la reticulación se invirtió mediante la adición de 20 l de 5 M NaCl durante la noche a 65 ° C. Se extrajo el ADN usando el ensayo de fenol /cloroformo. 20 l de ADN se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y el resto se utilizó como ADN de entrada. se utilizó cabra chip-grado anticuerpo policlonal Gli1 (0,1 mg /ml) (Cruz Company de Santa) para la inmunoprecipitación, se añadió la IgG de ratón (0,1 mg /ml) (Cruz Company de Santa) como un control aleatorio, la ARN polimerasa de anticuerpos II (0,1 g /ml) como control positivo y el anticuerpo β-actina (0,1 mg /ml) como control negativo. El cebador de la región promotora de GAPDH (Cruz Company de Santa) se utilizó como control negativo. (Tabla 2).
vectores indicadores de luciferasa ensayos
Los vectores indicadores de luciferasa promotor S100A4 se construyeron mediante Genechem Co., Ltd, Shanghai, China. Brevemente, un fragmento de ADNc de 1,5 kb (-766 a 734 del gen S100A4 humano) con sitios XhoI y HindIII se sintetizó y se clonó en los sitios Xho I y Hind III del vector de la luciferasa pGL3 básico para producir pGL3-1.5 S100A4 que contiene tres sitios Biding Gli1 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) y CTGGTGGGG (126~134)]. En los vectores de mutagénesis, Gli1 posibles sitios de unión secuencias fueron sustituidos, respectivamente, por la secuencia GATTCTTAA que nadie ha conocido sitios de unión para los factores de transcripción [22]. Las únicas Gli1 sitio de presagiar vectores de mutagénesis incluyen pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) y CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) y CTGGTGGGG (126~134)] y pGL3-1.5 S100A4 Mut 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) y GATTCTTAA (126~134)]. Los múltiples sitios de unión Gli1 vectores de mutagénesis incluyen pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) y CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) y GATTCTTAA (126~134)] y pGL3 1,5 S100A4 Mut 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) y GATTCTTAA (126~134)]. Las construcciones de vectores finales se verificaron mediante secuenciación del ADN para asegurar la exactitud. células AsPC-1 se transfectaron con 5 mg de cualquiera de la S100A4 pGL3-1500 o los constructos mutantes pGL3-1500 S100A4 y 2 g del constructo de luciferasa de Renilla (pGL4.75, Promega) como un control interno para la normalización utilizando el método de reactivo de lipofectina protocolo. 48 horas después de la transfección, se utilizaron células AsPC-1 para los ensayos de luciferasa de acuerdo con el protocolo del kit de indicador de luciferasa dual (Promega) y los volues fueron leido usando un luminómetro. Cada experimento se repitió al menos 3 veces, cada vez por triplicado.
Las muestras de pacientes
En este trabajo, 102 peraltadas incluidos en parafina tejidos de cáncer de diferentes pacientes de PC (63 hombres y 39 mujeres , con una edad media de 56,7 años, rango 44-75 años) fueron analizados mediante técnicas de inmunohistoquímica. Todos los pacientes han acordado esta investigación. Todas las muestras se obtuvieron de un hospital de la universidad de Tongji, China el décimo personas y todos los pacientes firmaron un documento de consentimiento, en la que acordaron que la extirpación quirúrgica del tumor maligno sería utilizado en la investigación médica antes de que sus operaciones. Los comités de ética de las universidades de Tongji aprobaron el procedimiento de autorización y los estudios.
ensayos de inmunohistoquímica
Los tejidos de PC embebidos en parafina se utilizan para la identificación de Shh, Gli1, S100A4 y E-cadherina. Shh anticuerpo policlonal fue adquirido de I + amp; D Company y los otros (Gli1, S100A4 y E-cadherina) eran de Sant Cruz Company. Los ensayos de inmunohistoquímica se realizaron como los estudios anteriores y los niveles de expresión de Shh, Gli1, S100A4 y E-cadherina genes fueron clasificados con base en indicaciones descritas previamente [23].
Análisis estadístico
para todos los análisis estadísticos, se utilizó un SPSS17.0 paquete de software (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Las variables continuas se expresan como medias ± SE y la prueba t de Student no pareado se utilizó para la evaluación estadística. Las correlaciones entre la expresión de Shh, Gli1, S100A4 y proteínas E-cadherina y la relación entre las características clínicas de los pacientes y las cinco proteínas se analizaron mediante el test de rangos de Spearman.
P
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Expresión diferencial de la familia de genes S100 a Gli1 en las células ASPC-1 |
Para delinear la expresión génica inducida por señales de Shh-Gli1 en células de cáncer pancreático, se utilizaron células AsPC-1 para los ensayos de cDNA microarrays que comparan lentivirus control vs células lentivirus-Gli1i. Al centrarse en los genes relacionados con la EMT-en cDNA de datos, encontramos la relación positiva entre las señales de Shh y S100 genes de la familia [21]. En nuestra pantalla (las señales de expresión incluidos 23 miembros de S100 de la familia de genes a excepción de S100A17 y S100A18) 10 genes, S100A10, s100a11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P y TCHH, se expresaron y 13 genes, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN y FLG no se expresaron en células AsPC-1. El análisis de comparación grupo de control lentivirus vs células del grupo lentivirus Gli1i mostró que S100A2, S100A4, S100A6, s100a11 y S100A14 se upregulated en Gli1. (Figura 1A). Los diez genes, S100A10, s100a11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P y TCHH, fueron recogidos para su validación por tiempo real RT-PCR. Como se muestra en la Figura 1B, S100A2, S100A4, S100A6, se encontraron s100a11 y S100A14 que se upregulated, sin cambios significativos en los otros cinco genes. Estos datos son consistentes con los obtenidos a partir del cDNA microarray
A:. CDNA microarray de datos acerca de la familia de genes S100; B: Los niveles de expresión diferencial de los miembros de la familia de genes parciales S100 por QRT-PCR. La expresión de GAPDH es como control. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Predicción de sitios Biding Gli1 y putativos genes diana Gli1 dentro S100A familia de genes
Para estudiar más a fondo el mecanismo de Shh-Gli1 vía de señalización en la regulación de la familia de genes S100, hemos descargado las secuencias de ADN de los genes S100A de Banco de genes y analizaron las secuencias homólogas de Gli1 sitio de presagiar (GACCACCCA) mediante la utilización de blastz herramienta bioinformática . Los datos de bioinformática mostraron que casi todos los miembros de la familia de genes S100A contienen muchas secuencias homólogas muy conservadas (la diferencia no sea más de una base) y estos sitios Gli1 Biding putativas exhibió las características del contrato de agrupación. La Tabla 3 mostró la putativo Gli1 presagiar sitios dentro de la región reguladora proximal que contiene regiones intergénicas, regiones intragenic, regiones untranscripted y las regiones no traducidas (no más de 5,0 kb de distancia de TSS). Los datos probablemente confered un grado algo mayor general de la evidencia de que estos candidatos son de hecho expresados diferencialmente en el ajuste de cáncer de páncreas, posiblemente como objetivos de abajo de una manera aberrante reactivado.
El nuevo gen diana y su Gli1 efectiva unión de identificación en sitios AsPC-1 |
Los cebadores de PCR para los ensayos de XChip fueron diseñados de acuerdo con las secuencias del promotor de 1,5 kb de longitud de S100A2, A4 y A6 genes, que contienen varios sitios de presagiar Gli1 predichos (64~72 , 326~334, 418~426 para S100A2; -349~-357, -227~-235, 126~134 para S100A4;. -246~-254, 786~794 para S100A6 la homología de cada sitio es de 89%. ). (Tabla 3). Los resultados de los ensayos mostraron que XChip factor de transcripción Gli1 obligado a los promotores de S100A2, 4 y 6 genes, respectivamente, en las células AsPC-1 en cultivo (Figura 2) guía
M:. Marcador de ADN; PC: RNA polimerasa II para el control de anticuerpo positivo XChip; IP: Gli1 XChip; IGG: IgG de ratón para el control aleatorio XChip; NC:. Anticuerpo ß-actina para control negativo XChip
Resultados de ensayos de luciferasa mostraron que las actividades promotoras de pGL3-1500 S100A4 aumentaron con niveles de expresión de gen Gli1 de una manera dependiente de la dosis (
P Hotel & lt; 0,05). El pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 o 3 no tuvieron un efecto significativo sobre la actividad de la luciferasa (
P Hotel & gt; 0,05), sin embargo, pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 disminución de la actividad luciferasa significativamente en comparación con pGL3-1.5 S100A4 (
P Hotel & lt; 0,05), lo que sugiere que el sitio 1 podría ser potenciadores de Gli1. La actividad de luciferasa de plásmidos contiene sitio 1 aumentó significativamente (
P
& lt; 0,01) y la de plásmidos contienen sitio 2 o 3 no cambiaron significativamente (
P
& gt; 0,05). (Figura 3A, B, C). La secuencia del sitio 1, ACCCACCAC, había también ha demostrado ser reconocido y sis-activado por proteínas Gli1 anteriormente [24], [25]
A:. S100A4 actividad luciferasa aumenta al aumentar el nivel de expresión de Shh en células AsPC-1. Los vectores de luciferasa de Renilla pGL3-1.5 S100A4 y se transfectaron de forma transitoria en L-Gli1i infectado, L-C infectado o L-Shh infectado células AsPC-1, respectivamente. Los resultados fueron normalizados para la eficacia de transfección usando la luciferasa de Renilla y el grupo L-C infectado se le dio arbitrariamente un valor de 1. B: actividad de luciferasa relativa de los mutantes de sitio de unión S100A4 promotor Gli1. células AsPC-1 transfectadas por L-Shh se transfectaron transitoriamente 5 mg de cada constructo reportero incluyendo pGL3-1.5 S100A4, S100A4 pGL3-1.5 Mut1, Mut2 y Mut3 respectivamente. El pGL3-1.5 S100A4 se le dio arbitrariamente un valor de 1 y las actividades de los otros transfecciones se ajustaron en relación con esta actividad. C: Sitio 1 era responsable de la transcripción Gli1. la actividad de luciferasa relativa de diferentes grupos AsPC-1 de células, infección L-Gli1i, infección o LC infección L-Shh, transfectadas por diferentes construcciones, pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2, 2-3 y Mut Mut 1-3 con vectores de luciferasa de Renilla . Los resultados se normalizaron para la eficacia de transfección usando la luciferasa de Renilla y el grupo infectado LC fue dado arbitrariamente un valor de 1. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Reglamento de las señales de Shh-Gli1 a la expresión de S100A4 y de la invasión /migración de las células PC a través de la mediación de S100A4 in vitro
para estudiar más a fondo la función pro-metástasis de S100A4 derivado de Gli1 de páncreas las células cancerosas, cinco grupos de células PC, L-Gli1i, LC, L-Shh, L-Shh + siS100A4 MIS y L-Shh + siS100A4, se utilizaron para analizar la regulación de las señales de Shh-Gli1 a S100A4, e-cadherina y genes VIM por tiempo real de RT-PCR y ensayos de Western Blot. Y a continuación, se utilizaron los mismos cinco celdas de grupo para evaluar la invasión /migración de las células PC
in vitro fotos: por transwell ensayos. Los resultados de QRT-PCR y transferencia de Western mostraron que los niveles de expresión de los genes S100A4 y VIM se incrementaron significativamente por Shh /Gli1-expresión en aumento. En contraste, los niveles de expresión de E-cadherina se redujo significativamente al mismo tiempo. (Figura 4A, C). Por otra parte, el derribado S100A4 signifiantly invierte downregulated E-cadherina y VIM upregulated inducida por L-Shh transducción. (Figura 4B, D). Los resultados de transwell ensayos mostraron la migración de las células PC se redujeron significativamente en el grupo L-Gli1i y aumentó en el grupo L-Shh respectivamente, en comparación con el grupo L-C (
P
& lt; 0,05). (Figura 4E). Por otra parte, siS100A4 invierte significativamente la respuesta de las células PC inducidas por L-Shh transducción (
P
& lt; 0,01). (Figura 4F). Por lo tanto, parece que S100A4 mediada por abnomal activa Shh-Gli1 vía de señalización podría ser uno de los factores clave a favor de la migración de células de cáncer de páncreas
A:. Los niveles relativos de transcripción de Shh, Gli1, S100A4, E- cadherina y vimentina fueron regulados por la L-Gli1i /L-Shh transducción. B: Los niveles relativos de transcripción de S100A4, E-cadherina y vimentina en células transfectadas L-Shh se invirtieron por siS100A4 transducción. C: Los niveles de expresión de Gli1, S100A4, E-cadherina y vimentina proteínas reguladas por la L-Gli1i /L-Shh transducción. D: Los niveles de expresión de S100A4, E-cadherina y vimentina proteínas fueron contrarrestados por siS100A4 transducción. E: La invasión /migración de las células de cáncer de páncreas regulados por L-Gli1i /L-Shh transducción se analizaron por transwell ensayos. F: La invasión /migración de las células transfectadas L-Shh se invirtiera por siS100A4 transducción. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Correlación entre la expresión de Shh, Gli1, S100A4 proteínas y E-cadherina en tejidos
PC
los resultados de inmunohistoquímica mostraron que las tinciones positivas de Shh. Gli1 y proteínas S100A4 localizan casi exclusivamente a las células neoplásicas al lado de tinción débilmente positivo de Shh en las células de los islotes y el complejo conducto pancreatitic crónica ocasionalmente ser visto en tejidos pancreáticos aparte de cáncer. En contraste, la expresión de la proteína de E-cadherina se downregulated notablemente en los tejidos de PC en comparación con los tejidos normales del tumor adyacente. Los patrones de coloración de Shh y S100A4 eran difusas tipo citoplasmática, la de la E-cadherina era difusa tipo citomembrana y la de Gli1 muestran perinuclear tinción citoplasmática y nuclear. Debido a que el Gli1 se activa sólo después de entrar en el núcleo, las muestras con solamente tinción citoplásmica se contaron como expresión negativa. (Figura 5). relaciones de inmunorreactividad fueron 78,43% de Shh (80 de 102), 51,96% para Gli1 (53 de 102), el 81,37% de S100A4 (83 de 102) y 48,04% para E-cadherina (49 de 102) en las muestras de PC. El análisis de la prueba de rangos de Spearman mostró que se observaron correlaciones positivas significativas entre Shh, Gli1 y S100A4 en el nivel de proteína en la PC (Shh vs Gli1: CC = 0,697,
P Hotel & lt; 0,01; Shh vs S100A4: CC = 0.476,
P Hotel & lt; 0,01; Gli1 vs S100A4: CC = 0,510,
P Hotel & lt; 0,01). Por el contrario, se confirmaron las correlaciones negativas significativas entre las tres proteínas y E-cadherina (Shh vs E-cadherina: CC = -0,278,
P Hotel & lt; 0,01; Gli1 vs E-cadherina: CC = -0,207,
P Hotel & lt; 0,05; S100A4 vs E-cadherina: CC = -0,285,
P Hotel & lt; 0,01)
a:. fuerte tinción citoplasmática de Shh en el cáncer de páncreas células (× 400); B: Débil tinción positiva para Shh en el complejo ductal de tejidos con pancreatitis crónica (× 400); C: Débil tinción positiva para Shh en células de los islotes de tejido de cáncer de lado normal (× 200); D: tinción negtive para Shh en las células epiteliales /acinares ductales normales de tejido lado cáncer (× 200); E: Las células de cáncer muestran fuerte tinción nuclear para los tejidos secundarios cáncer Gli1 y normales se negtive (× 400); F: citoplasmático perinuclear fuerte positivo y tinción nuclear para la parte Gli1 en las células de cáncer de páncreas (x400); G: Fuerte tinción citoplásmica positiva para S100A4 en las células de cáncer de páncreas (x400); H: Positivo tinción citoplasmática para E-cadherina en las células de cáncer de páncreas. Las flechas negras indican el área de tinción positiva y flechas blancas punto de negtive área de tinción.
La correlación entre la expresión de cuatro proteínas y las características clínico-patológicas de los pacientes de PC
Los datos de análisis estadístico mostraron que los niveles de expresión de Shh (CC = 0,245,
P Hotel & lt; 0,05 y CC = 0,254,
P Hotel & lt; 0,05) y S100A4 (CC = 0,265,
P
& lt; 0,01 y CC = 0,220,
P Hotel & lt; 0,05), las proteínas se correlacionó positivamente con el tamaño del tumor y la metástasis ganglionares y la de la proteína Gli1 se correlacionó positivamente con metástasis en los ganglios linfáticos (CC = -0,370, P & lt ; 0,01), mientras que la de la proteína E-cadherina era negtive correlacionado con metástasis en los ganglios linfáticos (CC = -0,203,
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, no se encontró correlación significativa entre las cuatro proteínas y la edad, el género, la localización del tumor y de diferenciación.
Discusión
Durante la activación del tejido morfogénesis de la vía de señalización Hh casi acompañan a la aparición de la EMT y esto se requiere para el proceso de migración de las células sensibles a Hh [26], [27]. Se informó de que los mecanismos de la vía de señalización de Shh-Gli1 la promoción de tumores malignos implicada en muchos aspectos de comportamientos biológicos malignas pero su papel principal en los tumores es promover EMT y mantener las células madre tumorales [28]. En este estudio, proporcionamos una investigación sistemática sobre el mecanismo de Gli1 en una línea celular de cáncer de páncreas alta metástasis, AsPC-1. La línea celular AsPC-1 contiene tanto Ki-ras mutación genética y DPC4 deleción del gen, que eran típicos cáncer de páncreas cambio molecular patológica [29], [30]. Por otra parte, el nivel de expresión de Gli1 fue derribado moderadamente mediante el sistema de interferencia de ARN, que era más coherente con el cambio patológico molecular real de cáncer de páncreas que nocaut gen artificial. Por lo que el espectro del gen diana obtenido en nuestra selección fue más consistente con la situación real de las células de cáncer de páncreas.
Hasta la fecha, se han reportado al menos 25 miembros que pertenecen a la familia S100 en los seres humanos. Veintiuno de ellos están codificados por genes agrupados en el cromosoma 1q21 locus, conocido como el complejo de la diferenciación epidérmica (EDC) que implica en la diferenciación de las células epiteliales derivadas de [31]. Se ha informado de que algunos miembros de esta familia se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y sus funciones podría involucrados metástasis y la EMT [32] - [34]. El EDC contiene dos grupos de genes S100A consecutivamente distribuidos. Un grupo contiene S100A1, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2-S100A7, S100A15, S100A8, S100A9 y S100A12 y el otro contiene FLG, HRNR (S100A18), RPTN, TCHH, TCHH1 (S100A17), s100a11 y S100A10. Los otros genes pertenecientes a las subfamilias de S100B, S100P, S100Z y S100G son, respectivamente, situados en el cromosoma 21q22 loci, 4p16, 5q14 y Xp22. Se ha informado de que los genes S100A tenido un origen común en la evolución molecular, mientras que S100B, de S100P, S100Z y S100G tenían diferentes orígenes, por lo que los genes S100A podría tener un programa universal de secuencias reguladoras conservadas [35]. Teniendo en cuenta sus altamente conservadas de unión Gli1 secuencias homólogas, se especula que desempeñan un papel similar relacionado con Gil1, aunque no podemos excluir la posibilidad de que tienen diferentes funciones no relacionadas con Gil1. Nuestros resultados sugieren que la expresión de genes de la familia S100A en células PC tiene tres maneras: En primer lugar, la expresión y función de Gli1; en segundo lugar, expresar, pero no en función de Gli1; tercero, que no expresan. Combinating predicción promotor de Gli1 con los datos de microarrays, especuló que Gli1 genes S100A regulado a través de los elementos que actúan en cis pueden ser un modo fundamental de la regulación. estudio previo había informado que S100A7 y S100A9 transcripción fueron inducidos por el tratamiento GLI1 en las células epidérmicas [25]. Durante el proceso evolutivo algunos genes de expresión S100A podría estar apagado debido a obtener la secuencia represora desconocido y luego algunos de estos genes podría ser activado de nuevo, pero ya no estaban regulados por Gli1 como resultado de la obtención de elementos adicionales que actúan en cis. Esta hipótesis puede interpretar en parte por qué la expresión de la familia S100A se caracteriza por la selectividad tisular aunque todavía es la falta de pruebas suficientes. Detallados estudios de genómica comparativa entre distintas especies, así como diferentes genes S100A podrían ayudar a entender más los mecanismos exactos. En nuestro microensayo y los consiguientes estudios de PCR en tiempo real, varios genes S100A, incluyendo S100A2, S100A4, S100A6, s100a11, y S100A14, se upregulated en respuesta a Gil1. Varios de estos genes S100A como S100A2, A4 y A6 se han demostrado estar involucrados en el cáncer de páncreas. En este estudio, los datos de los ensayos mostraron que XChip factor de transcripción Gli1 unido a las secuencias reguladoras de genes S100A2, A4 y A6 respectivamente en las células AsPC-1, lo que sugiere que estos genes pueden ser cis-regulado por Gli1.
los estudios han demostrado que las funciones de los miembros de la familia de genes S100 eran complejos y diversos, y hasta el momento, sólo se S100A4 se encontró que estaba estrechamente asociado a los procesos de EMT. Además, en estudios previos se ha propuesto la hipótesis de que el gen S100A4 podría ser uno de los factores clave en la red molecular EMT regulados por vía de señalización de Shh-Gli1 en las células de cáncer de páncreas [19]. Por lo tanto, el gen S100A4 se utilizó como un ejemplo para explorar la relación entre las señales de Shh-Gli1 y familia de genes S100. Como cuestión de hecho, numerosos estudios han indicado que los niveles de proteína S100A4 en el tejido de cáncer, jugo pancreático y suero de pacientes con cáncer de páncreas se incrementaron significativamente [36] - [38]. Algunos estudios han implicado que S100A4 podría ser utilizado como un biomarcador potencial de cáncer de páncreas [39]. Sin embargo, ¿por qué gen se sobreexpresa S100A4 selectivamente en PC era incierto. Tal gen S100A4 podría ser regulada por cierto vía de señalización activado selectivamente al mismo tiempo en el cáncer de páncreas. En el presente estudio, que por primera vez se encontró que los niveles de expresión de la proteína S100A4 se correlacionaron positivamente con la actividad de las señales de Shh-Gli1 en tejidos de cáncer de páncreas y de la proteína Gli1 upregulated S100A4 ARNm a través forma de activación de la CEI en las células PC que estableció una vía molecular exacta de las señales de Shh-Gli1 a S100A4 en células PC.
a pesar de que la activación de las señales de Hh casi acompañó a la ocurrencia de la EMT, hasta la fecha, no había pruebas de que Gli1 directamente regulada Caracol /Slug transcripción. Se ha informado de que S100A4 y E-cadherina fueron regulados inversamente en varios sistemas de células y S100A4 promovido la expresión de los factores de transcripción esenciales, Twist and Snail, en el proceso de EMT, así como marcadores mesenquimales, incluyendo VIM y MMPs [40] - [42].