Extracto
El crecimiento del tumor después de la radioterapia es una causa común de fracaso terapéutico reconocido. De esta manera, se analizó el crecimiento de las células tumorales después de la radioterapia mediante el establecimiento de un modelo de crecimiento de células de cáncer
in vitro
. Hemos logrado este modelo sembrando luciferase2 no irradiados de luciérnaga y el gen de fusión de proteína verde fluorescente (Fluc) marcado células vivas de cáncer de reportero en una capa de alimentación de células de cáncer irradiados. El crecimiento de células tumorales que viven se controló mediante imágenes de bioluminiscencia. Las células indicadoras que viven crecieron más rápidamente cuando sembradas en células alimentadoras irradiadas letalmente que cuando sembradas en células alimentadoras no irradiados o cuando sembradas en ausencia de células alimentadoras. Se encontró que los niveles de expresión de las proteínas Shh y Gli1, ambos de los cuales son proteínas críticos en Sonic hedgehog (SHH) de señalización, se incrementaron después de la irradiación y que esta expresión se correlacionó positivamente con el crecimiento celular reportero. Por otra parte, la estimulación de células morir de crecimiento de células tumorales vivas se ve reforzada por la adición de los agonistas de la señalización de Shh y inhibida por antagonistas de la señalización de Shh. agonistas de SHH también mejoran el crecimiento celular del informador en ausencia de células alimentadoras irradiadas, lo que sugiere que este mecanismo desempeña un papel en la estimulación del crecimiento de células de alimentación. Teniendo en cuenta estos resultados, se concluye que la activación de la señalización de SHH desempeña un papel importante durante la repoblación tumoral después de la radioterapia
Visto: Ma. J, L Tian, Cheng J, Z Chen, Xu B, Wang L, et al. (2013) Sonic Hedgehog Signaling Pathway apoya el crecimiento de células cancerosas durante cáncer de radioterapia. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10.1371 /journal.pone.0065032
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de febrero de 2013; Aceptado: April 20, 2013; Publicado: 10 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (81120108017, 81172030) y el Programa de Investigación básica Nacional de China (2010CB529902) (a Q Huang y L Tian) y en parte por subvenciones del Instituto de los Estados Unidos Nacional del cáncer (CA131408, CA136748, CA155270 ) (a CY Li). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En muchos tipos de cáncer, la repoblación tumoral se produce después de la radioterapia y plantea un gran desafío para los médicos. En este proceso, las pocas células tumorales que sobreviven después de la radioterapia vuelven a crecer y reemplazar las células tumorales perdidos. Repoblación durante la radioterapia fraccionada se reconoce como una causa importante de fracaso del tratamiento y la evidencia sugiere que la tasa de repoblación se puede producir a un ritmo acelerado en algunos casos [1]. Repoblación depende de la activación de las vías que estimulan la proliferación de células tumorales y muchos agentes moleculares dirigidas de señalización se han desarrollado que inhiben estas vías, tales como gefitinib que se enfoca en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de señalización [2]. Con el fin de crear un modelo para el estudio de la repoblación de células tumorales después de la radioterapia, muchos otros han intentado utilizar los llamados "células alimentadoras" que han sido tratados con radiación para promover el crecimiento de células tumorales no tratadas sembradas en experimentos de co-cultivo. Aunque este modelo no muestra directamente repoblación de las células cancerosas tratadas durante la radioterapia, creemos que las señales promotoras del crecimiento liberados de células alimentadoras tratadas letalmente replican las condiciones en un tumor tratado de forma homogénea. Por lo tanto, vamos a utilizar el concepto de repoblación celular y la muerte estimulado vivir crecimiento de células tumorales como sinónimos en todo nuestro estudio.
A pesar de nuestro conocimiento que morir las células de alimentación puede aumentar el crecimiento de las células tumorales vivas, el mecanismo por el cual esto ocurre sigue siendo en gran parte desconocido. El sonic hedgehog (SHH) vía de señalización, primero identificado en Drosophila melanogaster, está implicado en el desarrollo de órganos normal y la homeostasis, el vástago de mantenimiento celular y la proliferación en los vertebrados y por lo tanto puede ser un candidato para el mecanismo detrás de sobrevivir crecimiento de células tumorales [3]. Por otra parte, muchos cánceres están asociados con la señalización de SHH, tales como carcinoma de células basales, de esófago y cáncer de estómago, cáncer de pulmón de células pequeñas [4] y el adenocarcinoma de páncreas [5]. SHH activación de la vía se inicia por la unión del receptor transmembrana secretada y el ligando modificado con lípido Shh a Patched1 (Ptch1). Como consecuencia, la inhibición Ptch1 de Smoothened (Smo), una proteína transmembrana que abarca 7-pass, se alivia y se inicia la cascada de señalización de SHH, que a su vez activa los factores de transcripción Gli [6]. Hay tres proteínas Gli que codifican tanto activador y función represora. Gli1 actúa como un activador transcripcional, Gli2 es un compuesto de dominios reguladores positivos y negativos, y Gli3 actúa principalmente como un represor transcripcional [7]. En presencia de Shh, Gli1 está transcripcionalmente activa y el procesamiento fosforilada y proteolítica de Gli2 y Gli3 a sus formas represor truncadas se inhibe, lo que conduce a la activación de genes diana de la vía de señalización de SHH específicos, tales como Gli1 y Ptch1 [8].
Dado que los mecanismos que subyacen a la repoblación acelerada del tumor durante la radioterapia no se conocen bien, se puede investigar el papel de la vía SHH bien establecida en la proliferación de células tumorales después del proceso de radioterapia. Es bien sabido que la radioterapia causa apoptosis que puede jugar un papel crítico en la repoblación de células tumorales [9]. En nuestros estudios anteriores, hemos demostrado que las células tumorales mueren utilizan el proceso de apoptosis para generar la caspasa 3 señales de crecimiento estimulante de mediadas para estimular la repoblación de los tumores sometidos a radioterapia [10]. Por otra parte, también hemos encontrado vía "Phoenix Rising" a través del cual las caspasas ejecutoras, como la caspasa 3 y 7, en las células apoptóticas promueven la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en organismos multicelulares [11]. En el cáncer de esófago, la vía de señalización de SHH se activó ampliamente en los xenoinjertos y los tumores residuales después de quimioterapia y la señalización de bloqueo de SHH mejorada radiación citotoxicidad [12]. Por lo tanto, la vía "Phoenix Rising" con la estimulación del crecimiento tumoral mediada por caspasa y la vía de señalización de SHH pueden estar implicados en la repoblación de células tumorales después de la radioterapia.
En este estudio, hemos examinado el papel de la vía de señalización de SHH en célula que muere estimuló el crecimiento de células tumorales. Nuestros datos muestran una clara evidencia de un papel para Shh secretada por las células que mueren en la promoción de la rápida repoblación de los tumores a partir de un pequeño número de células tumorales vivas. Creemos que esta vía recientemente descubierta de Shh estimulada repoblación tumor juega un papel clave en la radioterapia del cáncer. Por otra parte, la orientación de la vía SHH puede tener implicaciones clínicas para la mejora de los resultados de la radioterapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular Condiciones
Panc1 células de cáncer de páncreas humanos y de colon humano las células HT29 de cáncer, fueron adquiridos de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se cultivaron en medio de Dulbecco modificado Eagles (DMEM) (Thermo, Pekín, china) con suero bovino fetal al 10% (FBS, Sijiqing, Hangzhou, china), 100 ml T
-1 penicilina, y 100 mg ml
-1 estreptomicina a 37 ° C en atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
tumor Repoblación Modelo
in vitro
, las células HT29 o células Panc1 cultivadas en 10 cm placa de Petri habían sido irradiadas con rayos X y veinticuatro horas después, se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 24 pocillos (Corning, NewYork, EE.UU.) a una densidad de 2,5 × 10
5 células por pocillo por triplicado en DMEM que contenía 2% de FBS. Veinticuatro horas más tarde, Fluc etiquetado, HT29 sin tratar o las células Panc1 se sembraron a una densidad celular de 1.000 células por pocillo. El medio se cambió cada 2 días durante 14 días.
La irradiación de las células del cáncer
irradiación con rayos X de las células se llevó a cabo usando un acelerador lineal de Oncor (Siemens, Amberg, Alemania), situado en el departamento de oncología de radiación en la Universidad de Shanghai Jiaotong afiliadas hospital de First People. La tasa de dosis para la máquina es alrededor de 3,6 Gy /min.
transducción génica en las células
transducidas varios genes exógenos en las células diana mediante el uso de vectores de lentivirus. El vector lentiviral más comúnmente utilizado es el complejo sistema (Thermo Scientific Inc, Pekín, China), que contenía un gen de resistencia a puromicina. Los genes que fueron clonados en este vector incluyen los siguientes: luciferase2 luciérnaga y el gen de fusión de proteína verde fluorescente (Fluc) impulsado por el promotor CMV, el gen de luciferasa dirigido por 8 × de tipo salvaje Gli1 sitio de unión u 8 × mutado sitio de unión Gli1 (es decir, de tipo salvaje tipo 8 × GBS gen de la luciferasa o mutado 8 × gen de la luciferasa GBS), así como shRNA contra Gli1. Todos los vectores lentivirales fueron empaquetados en células 293T siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células HT29 de forma estable transducidas o Panc1 se obtuvieron por la infección por lentivirus y selección de puromicina en presencia de 2 g de puromicina /ml durante dos semanas.
Luciferase Assay
El informador de luciferasa sistema de ensayo E1500 (Promega , se utilizó Wisconsin, EE.UU.) para determinar las actividades de luciferasa de luciérnaga de acuerdo con las instrucciones del fabricante. células HT29 y Panc1 que expresan el tipo salvaje 8 × GBS gen de la luciferasa o la 8 × gen de la luciferasa GBS mutado se irradiaron con 6 Gy de radiación ionizante. Las actividades de luciferasa para el 6 Gy irradiados se probaron las células y las células no irradiadas. Las mediciones se realizaron con un luminómetro Berthold (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania), y los valores de luciferasa de luciérnaga de células que expresan gen de la luciferasa de tipo silvestre se normalizaron los valores de luciferasa de luciérnaga de células que expresan gen de la luciferasa mutante. La normalización reduce al mínimo la variabilidad experimental. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
La bioluminiscencia de imágenes
Para la imagen de las señales emitidas luciferasa de las células, se utilizó el instrumento NC100 de Berthold Technologies (Bad Wildbad, Alemania) situadas en la Facultad de Ciencias médicas básicas de la Universidad de Fudan. Para Panc1 y las células HT29, que mide las señales de luciferasa mediante la adición de D-luciferina (Promega, Wisconsin, EE.UU.) en PBS a una concentración final de 0,15 mg /ml. Cinco minutos después de la administración de D-luciferina, se tomaron las imágenes y las señales de luciferasa (fotones /seg) se procesaron a continuación y se analizaron cuantitativamente mediante el uso de software suministrado por el fabricante. Las imágenes siempre fueron tomadas en el mismo punto en el tiempo para minimizar la variabilidad. Las señales de luciferasa se midieron en células HT29 Panc1 y en 14 puntos durante el día para maximizar la diferencia observada entre los controles no tratados alimentadoras y del grupo experimental de fibroblastos irradiados.
Los anticuerpos y los principales productos químicos utilizados en este estudio
Los anticuerpos comercialmente disponibles contra Shh, Gli1, β-actina, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, EE.UU.) y el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad, California, EE.UU.). SHH señalización ciclopamina antagonista y Gant61 fueron ambos obtenidos de Sigma-Aldrich (Missouri, EE.UU.). GDC-0449 se adquirió de Selleck Químicos (Texas, EE.UU.). SHH señalización agonista SAG se obtuvo de Ciencias de la Vida (Enzo New York, USA) y ratón sonic hedgehog recombinante N-terminal se obtuvo a partir de I + amp; D Systems (Minnesota, EE.UU.)
Tratamiento agonistas y antagonistas
se añadieron agonistas o antagonistas cuando se irradia HT29 o células Panc1 fueron sembradas en placas de 24 pocillos como alimentadores. Se utilizaron las siguientes concentraciones: ciclopamina para las células HT29 (2 M y 5 M), la ciclopamina de las células Panc1 (0,5 M, 1 M, 2 M y 5 M), GDC-0449 para las células HT29 (0,2 M, 0,5 M, 1 M y 2 M), GDC-0449 para las células Panc1 (0,5 M, 1 M y 2 M), Gant61 para células HT29 (1 M, 2 M y 5 M), Gant61 para las células Panc1 (2 M, 5 M, 10 M y 20 M), de ratón recombinante hedgehog sonic N-terminal para las células HT29 y Panc1 (600 ng /ml), SAG para las células HT29 (5 nM, 10 nM y 100 nM), SAG para las células Panc1 (3 nM, 5 nM , 10 nM y 100 nM). Para confirmar el efecto de los agonistas en las células tumorales vivas, agonistas También se añadieron a pocillos que contienen células HT29 o reportero Panc1 solo. Las concentraciones se utilizaron como: SAG para Panc1 y células HT29 (5 nM, 10 nM y 100 nM), de ratón recombinante hedgehog sonic péptido N-terminal de las células HT29 y Panc1 (600 ng /ml). El medio se cambió cada cuarenta y ocho horas y se reemplazó con medio fresco que contiene la misma concentración de los agonistas o antagonistas. El crecimiento de las células reportero se controló 14 días más tarde por la imagen.
ShRNA Derribo
Los plásmidos que codifican lentiviral shRNA contra el gen Gli1 (HSH007701-HIVmU6) y control de mezcla aleatoria (CSHCTR001-HIVmU6) fueron adquiridos de Genecopoeia (Maryland, EE.UU.). La secuencia para shRNA contra Gli1 es 5'-acgccatgttcaactcgat-3 '. Los lentivirus que codifican Gli1 shRNA y control de mezcla aleatoria se produjeron como se ha descrito anteriormente. células HT29 y Panc1 se sembraron en placas de seis pocillos y posteriormente se infectaron. Las células se trataron luego con puromycin para seleccionar para aquellos que expresan establemente shRNA contra Gli1 y ARN control de mezcla aleatoria. silenciando la eficiencia se confirmó mediante Western blot para la proteína Gli1.
Western Blot
Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron usando 120-200 l de tampón RIPA estándar que contiene inhibidores de la proteína (Beyotime, Jiangsu, China ). La concentración de proteína de cada muestra se cuantificó y 40 a 60 g de proteína por muestra se utilizó para el análisis de transferencia de Western. En general, 40 a 60 g de proteína en tampón de carga se calentó a 100 ° C durante 10 minutos y luego se separó en un gel de SDS-poliacrilamida por electroforesis, y se transfirió a una membrana de PVDF (Bio-Rad, California, EE.UU.). Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C y luego con anticuerpos secundarios durante 2 horas a temperatura ambiente. ECL Plus (Roche, Basilea, Suiza) se utiliza para visualizar las señales de la membrana.
fueron analizados Análisis estadístico
Resultados usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) de prueba para evaluar la estadística importancia, respectivamente, con valores de
P & lt; 0,05
considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
Números Reportero celulares fueron linealmente asociada con la actividad de la luciferasa Cuando Imaging
para confirmar la correlación de la actividad luciferasa en imágenes con el número de células reportero, hicimos una serie de dilución para Fluc etiquetado células tumorales (denominadas "células indicadoras"). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 y 10000 células tumorales Panc1Fluc o HT29Fluc eran semillas en placas de 96 pocillos en 6 replica el día antes de formación de imágenes. La toma de imágenes se realizó 5 minutos después de la adición de D-luciferina de utilizar el instrumento NC100. Los fotones de cada pocillo se recogieron y se analizaron posteriormente por ANOVA de dos colas. Los resultados indicaron que los fotones /seg se asociaron de forma lineal con el número de células sembradas en los pocillos (Fig. 1A, 1B, R
2 = 0,9967 en las células y Panc1Fluc R
2 = 0,9973 en las células HT29Fluc respectivamente).
A. El análisis de correlación de fotones medidos por imágenes de bioluminiscencia
vs números de teléfonos
plateados. Fluc etiquetado células Panc1 se sembraron en placas de 96 pocillos en 6 repeticiones en el número indicado el día antes de Imaging. El promedio de fotones /seg a partir de 6 repeticiones en cada uno de los números de células fueron analizados por ANOVA de dos colas (R
2 = 0,9967). Los resultados indicaron que la intensidad de la señal de imagen se correlacionó positivamente con el número de células plateado. barra blanca representa la escala de 1 cm de longitud. B. Análisis de correlación de fotones medidos por imágenes de bioluminiscencia
vs números
celular en las células HT29. El procedimiento y el resultado del análisis fueron las mismas que las células Panc1 mencionados anteriormente (R
2 = 0,9973). La barra de escala representa 1 cm. C. Análisis de la intensidad de la señal de las células cultivadas en células Panc1Fluc Panc1 irradiados. 2,5 × 10
5 de rayos X irradia células Panc1 se sembraron en placas de 24 pocillos como alimentador. Las dosis fueron 0 Gy, 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy y 20 Gy, respectivamente. 1000 células Panc1Fluc se sembraron en cada pocillo con o sin células alimentadoras como reportero. 14 días después, la placa fue fotografiada para la intensidad de la bioluminiscencia. Parte superior: análisis de la actividad de la luciferasa; Abajo: imagen representativa de bioluminiscencia, barra de escala representa 1 cm. D. Análisis de la intensidad de señal de las células HT29Fluc cultivadas en células HT29 irradiados. El procedimiento y el resultado del análisis fueron las mismas que las células Panc1 mencionados anteriormente. Arriba: La actividad de luciferasa; En pocas palabras:. Bioluminiscencia imagen representativa, barra de escala representa 1 cm
irradiado muerte de células tumorales de estar estimulada Tumor Cell Growth
Hemos llevado a cabo una serie de experimentos para examinar los efectos de morir, células tumorales irradiadas a diversas dosis en las células tumorales de estar. Para simular
in vivo
escenarios en los que la gran mayoría de las células tumorales son destruidas por la radiación o la quimioterapia, se sembraron un pequeño número (10
3) de Fluc etiquetado células Panc1 humanos cáncer de páncreas o el cáncer de colon humano HT29 células sobre un lecho de un número mucho más grande (2,5 x 10
5) de las células cancerosas homóloga no marcados. Las células cancerosas últimas denominadas "células alimentadoras" se irradiaron a 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy y 20 Gy, o sin tratar (0 Gy) respectivamente. El crecimiento de la pequeña cantidad de vida "células" reportero se controló por microscopía de epi-fluorescencia a intervalos de 3 días y por imágenes de bioluminiscencia en Día 14 (Fig. 1C, 1D). Las actividades de luciferasa se utilizaron como sustitutos para el número de "células indicadoras", que fue verificado por nuestro experimento asociación lineal (fig. 1A, 1B). Nuestros resultados indican que las células reportero crecieron significativamente más rápido cuando las células sembradas en que cuando se sembró solo morir. Además, las células alimentadoras irradiadas con 6 Gy mostraron el mayor crecimiento de la mejora de la capacidad que otros hicieron dosis, con células alimentadoras no irradiados que no muestran ningún papel de apoyo. En las células tumorales irradiadas con dosis superiores a 6 Gy, la capacidad de estimular el crecimiento se redujo al aumentar la dosis de irradiación (Fig. 1C, 1D). Estas observaciones fueron cierto tanto para las células HT29 y células Panc1.
La activación de la señalización de Shh Camino correlacionó positivamente con la muerte de la célula estimulada estar crecimiento de células tumorales
Para examinar si la activación de la vía de señalización de SHH se asoció con la estimulación del crecimiento de células tumorales por las células que mueren, se llevó a cabo experimentos de Western blot con dos líneas celulares de cáncer, Panc1 (Fig. 2A) y HT29 (Fig. 2B). la señalización de SHH activado fue confirmado por los niveles de proteína de Shh y Gli1 que se cuantificaron mediante la medición de la señal de la 19-kD y 160 kD-bandas, respectivamente. Se encontró que los niveles de proteínas Shh y Gli1 fueron mayores en 6 Gy irradiado células de cáncer que otras dosis tratadas las células cancerosas (Fig. 2C, 2D). Además, en las células tumorales irradiadas con dosis superiores a 6 Gy, Shh y Gli1 los niveles de proteína se redujo con el incremento de la dosis de irradiación. Es interesante que las tendencias en el nivel de expresión de la proteína de la vía de señalización de SHH mostraron la misma tendencia con el efecto de la estimulación del crecimiento después de la irradiación, los cuales fueron más altos para 6 Gy y fue disminuyendo al aumentar la dosis de irradiación.
. cambios en la expresión perfil de proteínas Shh y Gli1 en células Panc1 irradiados a diferentes dosis y detectados por Western blot. B. Expresión cambios de perfil de proteínas Shh y Gli1 en células HT29 irradiados a diferentes dosis y detectados por Western blot. C. La intensidad relativa de las bandas de proteína Shh y Gli1 en Western blot en células Panc1 irradiados a diferentes dosis. D. La intensidad relativa de las bandas de proteína Shh y Gli1 en Western blot en células HT29 irradiados a diferentes dosis. E. actividad luciferasa del reportero Gli1 en las células Panc1 irradiados y no irradiados. ** Representa
P Hotel & lt; 0,01. F. actividad luciferasa del reportero Gli1 en las células HT29 irradiados y no irradiados. ** Representa
P
. & Lt; 0,01
Para confirmar aún más la activación de la vía de señalización de SHH en las células alimentadoras, las células cancerosas HT29 Panc1 y fueron transducidas con lentivirus que lleva un silvestre tipo 8 × indicador de luciferasa de GBS o un 8 × indicador de luciferasa GBS mutado que alberga una mutación puntual que abole la unión de Gli1. Se seleccionaron las células infectadas por lentivirus con 2 g puromicina /ml. Las células Panc1 y HT29 de forma estable transducidas eran sin tratar o irradiado a una dosis de 6 Gy, y luego se midió la actividad de luciferasa. Los resultados sugieren que la actividad de luciferasa relativa en 6 Gy irradiado células de cáncer era significativamente mayor que en las células cancerosas no irradiados (
P & lt;
0,01), lo que indica que la actividad del factor de transcripción Gli1 se aumentó en 6 Gy irradiado cáncer Células. Los resultados que se observaron tanto en las células Panc1 (Fig. 2E) y células HT29 (Fig. 2F) fueron similares y consistente con los resultados de formación de imágenes bioluminence se muestran arriba.
SHH señalización Antagonistas de inhibición de muerte de células tumorales Tumor estimulada Living crecimiento celular
Teniendo en cuenta la actividad de la vía SHH significativamente hasta reguladas en las células irradiadas, hemos determinado si la manipulación de la vía SHH podría inhibir o promover la muerte de las células tumorales estimulado vivir crecimiento de células tumorales. Cerca de 2.5 × 10
5 6 Gy irradiado células Panc1 fueron sembradas en placas de 24 pocillos en medio que contiene antagonista del Smo (GDC-0449) a 0,5 M, 1 M, 2 M o el control del vehículo, respectivamente. 1000 Fluc etiquetado células Panc1 vivo fueron sembradas en la irradiado con o sin tratado con fármaco capa de alimentación. Como se muestra en la Fig. 3A GDC-0449 reduce Panc1 crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis. En comparación con los controles que contenían vehículo, la señal en los pozos que contenía 1 mM GDC-0449 o 2 M GDC-0449 se redujo significativamente (
P Hotel & lt; 0,05). Estos hallazgos sugieren que la GDC-0449 podría inhibir la muerte celular tumoral estimulado vivir crecimiento de células tumorales.
A. GDC0449, un inhibidor de la vía SHH preclínica, inhibe el crecimiento celular Panc1Fluc inducida por morir de células Panc1 de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
P Hotel & lt; 0,05. B. Gant61 inhibe Panc1Fluc crecimiento celular inducida por las células moribundas Panc1 de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. ** Representa
P Hotel & lt; 0,01. C. Cyclopamin inhibe el crecimiento celular inducido por HT29Fluc morir las células HT29 en una forma dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
P Hotel & lt; 0,05, ** representa
P Hotel & lt; 0,01. D. Gant61 inhibe el crecimiento celular inducido por HT29Fluc morir las células HT29 en una forma dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. ** Representa
P Hotel & lt; 0,01. E. GDC0449 inhibe el crecimiento celular HT29 Fluc inducida por morir las células HT29 en una forma dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm.
Para confirmar aún más las funciones de señalización de SHH en el teñido de las células tumorales estimulado vivir crecimiento de células tumorales, probamos otro antagonista Gli1 (Gant61). La condición era idéntica a la condición antes mencionada para GDC-0449, excepto que la concentración Gant61 era o bien 5 mM, 10 mM o 20 mM. Se observó una reducción del crecimiento similar en Gant61 pocillos tratados en comparación con los tratados con vehículo pocillos de control (
P
& lt; 0,01, Fig 3B.). Sin embargo, las células Panc1 tratados con otro antagonista de Smo (ciclopamina) no mostraron una reducción en el crecimiento celular (datos no presentados).
Experimentos similares se llevaron a cabo en las células HT29. Acerca de 2,5 × 10
5 6 Gy irradiado HT29 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos en medio con o sin ciclopamina a 2 M, 5 M o vehículo de control, respectivamente, sobre la que 1000 Fluc etiquetado se sembraron las células HT29 en vivo. En comparación con el grupo tratado de control del vehículo, la ciclopamina redujo el crecimiento de células HT29 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). Las células HT29 se cultivan en el control del vehículo mostraron una significativa mayor actividad de luciferasa de las células cultivadas en 2 mM de ciclopamina (
P & lt; 0,05
) y 5 ciclopamina mu M (
P
& lt; 0,01).
además, la prueba del Gli1 antagonista Gant61 (Fig. 3D) y el antagonista del Smo GDC-0449 (Fig. 3E). En ambos casos, se observaron resultados similares. El Gli1 antagonista Gant61 inhibida HT29 crecimiento muriendo células alimentadoras de manera significativa. Sin embargo, la diferencia entre el grupo de control del vehículo y los grupos tratados GDC-0449 no fue significativa (
P Hotel & gt; 0,05).
Tumor
Gli1 Knockdown por shRNA Reduce la muerte de la célula estimulada de estar de células tumorales crecimiento
además, confirmó la función de señalización de SHH en la muerte de células tumorales estimulado vivir crecimiento de células tumorales mediante el uso de shRNA desmontables expresión Gli1 en células alimentadoras. Se seleccionaron las células HT29 y Panc1 infectadas con lentivirus shRNA llevar Gli1 en medios con 2 mg /ml de puromicina, y se utilizó el análisis de Western blot para la expresión Gli1 para verificar la selección correcta. Los niveles de proteína de Gli1 tanto en las células HT29 Panc1 y (Fig. 4A, 4B) se redujeron notablemente. Panc1 células HT29 o transducidas por Gli1 shRNA o scramble shRNA fueron irradiados con 6 Gy y se utilizan como células alimentadoras, respectivamente. El crecimiento de Fluc etiquetado células Panc1 o HT29 sembradas sobre células alimentadoras caída Gli1 fue atenuada significativamente como lo demuestran las actividades de luciferasa significativamente más bajos en los pozos con Gli1 desmontables células Panc1 o HT29 de pozos con scramble shRNA transducir células Panc1 o HT29 (de estar
P Hotel & lt; 0,05) (figura 4A, 4B)
A... La expresión de la proteína Gli1 reducido en Gli1 shRNA transduce células Panc1 detectados por Western blot (panel superior). La reducción del crecimiento celular en las células que mueren Panc1Fluc Panc1 transducidas Gli1 shRNA. * Representa
P Hotel & lt; 0,05; barra de escala representa 1 cm. B. La expresión de la proteína reducida Gli1 en células HT29 transducidas Gli1 shRNA detectados por Western blot (panel superior). La reducción del crecimiento celular HT29Fluc al morir las células HT29 transducidas Gli1 shRNA. barra de escala representa 1 cm.
SHH señalización agonistas Activar Tumor Cell Growth
A continuación preguntamos si el agonista vía de señalización de SHH, SAG, que actúa uniéndose directamente a aguas abajo alisado, lo haría promover el crecimiento de células de cáncer. Panc1 células HT29 y se irradiaron a 6 Gy y se sembraron en placas de 24 pocillos como alimentadores en medio con o sin 3 nM, 5 nM, 10 nM o 100 nM SAG, respectivamente. tratamiento SAG resultó en un aumento del crecimiento celular reportera de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A, 5B). A fin de verificar los resultados obtenidos con SAG, añadimos una forma activa de Shh, es decir, fragmentos N-terminal recombinante de Shh en 600 ng /ml en el medio. Los resultados sugieren que el fragmento N-terminal recombinante de Shh mejora de forma significativa el crecimiento de células tumorales en el teñido células de alimentación en comparación con el control del vehículo (
P
& lt; 0,01). (Fig. 5C, 5D)
A. La activación de la señalización de Shh con agonista de señalización SHH SAG aumenta el crecimiento de células que mueren en Panc1Fluc células Panc1 irradiadas de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
P Hotel & lt; 0,05, ** representa
P & lt; 0,01
. B. La activación de la señalización con SAG SHH aumenta el crecimiento celular en células HT29 HT29Fluc mueren irradiadas de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. ** Representa
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. C. La activación de la señalización de Shh con agonistas de la señalización de Shh, fragmento N-terminal de la Shh, mejora el crecimiento celular en las células Panc1 Panc1Fluc mueren irradiados. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
P Hotel & lt; 0,05. D. La activación de la señalización de Shh con el fragmento N-terminal de la Shh aumenta el crecimiento celular en células HT29 HT29Fluc mueren irradiados. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
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señalización de Shh agonistas fortalecer su vida Crecimiento Reportero celular en ausencia de células de fibroblastos irradiados
Desde Shh y Gli1 expresión aumentó en irradiado Panc1 y células HT29 y SHH agonistas de señalización mejorada de las células tumorales mueren estimulado vivir crecimiento de células tumorales, se asumió que el crecimiento celular reportera mejorada fue causada por la señal SHH liberado de las células moribundas, activando de este modo la vía de señalización de SHH en las células reporteras viven también debería causar celular crecimiento. Con el fin de verificar nuestra hipótesis hemos añadido la señalización agonistas SAG y el fragmento N-terminal recombinante de Shh a los pozos que contienen Panc1 o HT29 reportero solos SHH. Tanto SAG y la forma activa de Shh aumentaron significativamente Panc1 o el crecimiento de células HT29 reportero (Fig. 6). Estos hallazgos sugieren que la señal de SHH liberado de las células que mueren como resultado el crecimiento de células reportero debido a la activación de la vía de SHH en las células indicadoras.
A. SHH señalización agonista SAG aumenta el crecimiento celular Panc1Fluc de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. ** Representa
P Hotel & lt; 0,01. B. SHH agonista de señalización SAG aumenta el crecimiento celular HT29Fluc de una manera dependiente de la dosis. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
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P Hotel & lt; 0,01. células C. Panc1Fluc tratados con el fragmento N-terminal Shh muestran una mayor crecimiento. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. * Representa
P Hotel & lt; 0,05. células D. HT29Fluc tratados con el fragmento N-terminal Shh muestran una mayor crecimiento. Arriba: análisis de la intensidad de señal de imagen de bioluminiscencia; En pocas palabras: las imágenes de bioluminiscencia representativos; barra de escala representa 1 cm. ** Representa
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Discusión
repoblación celular tumoral es un proceso clave que causa la recaída del tumor durante la quimioterapia o radioterapia del cáncer [13]. Repoblación de las células tumorales supervivientes se puede producir entre fracciones de dosis de radiación o la quimioterapia y puede conducir al fracaso del tratamiento [14].