Extracto

La desregulación del sonic hedgehog (Shh) vía de señalización se ha asociado con las células madre del cáncer (CSC) e implicado en la iniciación del cáncer de páncreas. CSC pancreáticas son células tumorales raras se caracterizan por su capacidad de auto-renovación, y son responsables de la recurrencia del tumor acompañado de resistencia a las terapias actuales. La letalidad de estos tumores pancreáticos incurables, agresivos e invasivos sigue siendo un reto clínico de enormes proporciones. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar el papel de la vía de Shh en el cáncer de páncreas y examinar los mecanismos moleculares por los que el sulforafano (SFN), un compuesto activo en las verduras crucíferas, inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas humanas. Curiosamente, se demuestra aquí que la vía Shh es muy activa en células madre cancerosas pancreáticas y juega un papel importante en el mantenimiento de stemness mediante la regulación de la expresión de genes stemness. Teniendo en cuenta el requisito de erizo en el cáncer de páncreas, se investigó si erizo bloqueo por parte de SFN podría tener como objetivo la población de células madre en el cáncer de páncreas. En un
in vitro
modelo, células madre cancerosas pancreáticas humanas derivadas esferas se inhibieron significativamente el tratamiento con SFN, lo que sugiere el agotamiento clonogénico de las células madre cancerosas. Curiosamente, SFN inhibe los componentes de la vía de Shh y la actividad transcripcional Gli. La interferencia de la señalización de Shh-Gli bloqueado significativamente los efectos inhibitorios inducidos por SFN que demuestran la exigencia de una vía activa para el crecimiento de células madre cancerosas pancreáticas. SFN también inhibió abajo objetivos de Gli transcripción mediante la supresión de la expresión de pluripotencia mantenimiento de factores (Nanog Octubre-4), así como PDGFRa y ciclina D1. Además, SFN la apoptosis inducida por la inhibición de Bcl-2 y la activación de las caspasas. Nuestros datos revelan el papel esencial de la señalización de Shh-Gli en el control de las características de células madre cancerosas pancreáticas. Proponemos que el cáncer de páncreas efectos preventivos de SFN pueden ser resultado de la inhibición de la vía de Shh. Por lo tanto sulforafano representa potencialmente una alternativa económica, segura y eficaz para el tratamiento del cáncer de páncreas

Visto:. Rodova H, J Fu, Watkins DN, RK Srivastava, Shankar S (2012) Sonic Hedgehog señalización Inhibición proporciona oportunidades para Terapia dirigida por sulforafano en la regulación de la célula del cáncer pancreático auto-renovación del tallo. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10.1371 /journal.pone.0046083

Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América

Recibido: 10 de mayo de 2012; Aceptado: 27 Agosto 2012; Publicado: 28 Septiembre, 2012

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Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia .

Introducción

cáncer de páncreas (CP) tiene uno de los pronósticos más pobres entre todos los tipos de cáncer y la tasa de supervivencia global a 5 años de 3% [1], [2], [3]. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos de cáncer de páncreas no es resecable en el momento del diagnóstico. Hay opciones limitadas de tratamiento disponibles para esta enfermedad debido a la quimio y radio-terapias son en gran medida ineficaces, y con frecuencia vuelve a desarrollar la enfermedad metastásica, incluso después de la cirugía [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir enfoques novedosos y eficientes quimiopreventivos para el cáncer de páncreas.

Las células madre del cáncer de las células iniciadoras de tumores /(TIC) se han propuesto para ser la causa del cáncer de iniciación, progresión y el fracaso de la quimioterapia en varios tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de páncreas [5], [6], [7]. La hipótesis CSC sugiere que sólo el compartimento de células madre en tumores es capaz de ilimitada auto-renovación y que la eliminación de estas células en última instancia, detener la expansión neoplásica, como las células más diferenciadas han limitado la capacidad mitogénica y no contribuirá al crecimiento del tumor a largo plazo . Por lo tanto, es imperativo para diseñar nuevas estrategias basadas en una mejor comprensión de las vías de señalización que controlan aspectos de la auto-renovación y la supervivencia en células madre cancerosas con el fin de identificar nuevas dianas terapéuticas en estas células. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas específicamente a células madre cancerosas pancreáticas puede ser eficaz en la erradicación de tumores y en la reducción del riesgo de recidiva y metástasis
.
La regulación positiva de la vía hedgehog sonic ha sido demostrada en células madre cancerosas, que la progresión del tumor efecto incluyendo la migración , invasión y metástasis. actividad inapropiada de la vía de señalización Hh también se ha relacionado con los tipos de tumores que surgen de forma esporádica o en individuos genéticamente predispuestos [8], [9]. La vía de Shh es un mediador temprana y tardía de la tumorigénesis en los cánceres epiteliales. La activación de la señalización de Shh parece preceder transformación de las células madre de tejido pancreático a las células madre cancerosas pancreáticas, con factor de transcripción Gli que funciona como un mediador de señales del medio ambiente y en la progresión de células madre cancerosas pancreáticas en células tumorales metastásicas. la señalización de Shh se inicia mediante la unión del péptido Shh secretada a la proteína transmembrana de 12 lapso de Patched (Ptch), resultando en la pérdida de actividad Ptch y la consiguiente fosforilación y la estabilización postranscripcional de la proteína transmembrana 7 lapso de Smoothened (Smo), un miembro de la receptores de serpentina [10], [11]. Como resultado, la expresión de genes diana Hh se inicializa través de la activación posterior a la traducción de la familia Gli de factores de transcripción de dedos de zinc [12]. La familia Gli es uno del gen diana inducida constantemente siempre que se activa la vía de Shh, haciendo de esta transcripción un marcador fiable de la actividad tanto de señalización fisiológica y patológica Shh. La activación de la vía de señalización de Shh está implicado en la regulación de la proliferación de las células madre cancerosas pancreáticas. Así, mediante la orientación vías de señalización que se activan de manera aberrante y de importancia para el mantenimiento de la célula madre de cáncer puede conducir al desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para el cáncer pancreático por la eliminación de células madre cancerosas de cáncer de páncreas [13], [14].

Los estudios epidemiológicos han sugerido que el aumento de riesgo de cáncer de páncreas están asociados con el tabaco, la obesidad y el alto consumo de grasa, pescado, carne de cerdo o carne de res, y que la disminución de los riesgos están asociados con el consumo de verduras crucíferas. Un grupo importante de agentes que tienen esta propiedad son los compuestos orgánicos de azufre tales como isotiocianatos (ITC), abundantes en los vegetales crucíferos para el que el consumo ha demostrado epidemiológicamente una relación inversa con el cáncer de páncreas. ITC se ha demostrado que exhiben varias actividades quimioprotectores potenciales en modelos celulares y animales [15], [16], [17], [18]. Hemos demostrado anteriormente que la administración oral de sulforafano inhibió el crecimiento de células PC-3 ortotópicamente implantadas en la próstata de ratones desnudos mediante la inducción de la apoptosis y la inhibición de la proliferación de células tumorales, metástasis y la angiogénesis [19]. También hemos demostrado recientemente que SFN solo y en combinación con la quercetina inhibe el crecimiento de las células madre del cáncer de páncreas derivados de las líneas celulares de cáncer pancreático
in vitro
a través de la regulación de las proteínas FOXO [20]. Por lo tanto, SFN es una gran promesa para el desarrollo como un agente quimiopreventivo /terapéutica. A pesar de estos hallazgos, no hay estudios que demuestran la regulación de células madre cancerosas pancreáticas por SFN, y si SFN pueden inhibir la vía de Shh.

Así, el objetivo de este estudio fue investigar el papel de la vía hedgehog Sonic en el páncreas cáncer y para examinar los mecanismos moleculares por los que el sulforafano (SFN), un compuesto activo en las verduras crucíferas, inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas. El mecanismo molecular subrayado en la exhibición de este efecto fue a través de la inhibición de la vía de señalización hedgehog Sonic en el nivel de transcripción Gli, la proliferación, tallo características de las células y la inducción de apoptosis. Estos datos sugieren que SFN puede ser un agente beneficioso para la prevención y el tratamiento de cáncer de páncreas. Dicha información no sólo permitirá el diseño racional de estrategias basadas en la SFN para la prevención y /o tratamiento de cáncer de páncreas, pero también podría facilitar el desarrollo de protocolos mecanismo impulsado por los efectos clínicos óptimos.

Resultados

la expresión de genes de la vía de señalización hedgehog sonic en células madre cancerosas de páncreas

The Hedgehog (Hh) vía de señalización es esencial para el desarrollo de tejidos y órganos [8]. Sin embargo, la activación aberrante de sonic hedgehog (Shh) vía de señalización juega un papel importante en la tumorigénesis y progresión de varios tumores [8], [9]. Para evaluar la posibilidad de que la señalización de Hh es activa en células madre cancerosas pancreáticas humanas se comparó la expresión del ARNm de varios componentes de la vía de Shh en pancreático humano CSC (PanCSC) a las células humanas normales de páncreas ductales epiteliales (HPNE) y las células madre normales de páncreas humanos ( HNPSC), en un
in vitro
modelo de cultivo celular y en que se cuantificó mediante qRT-PCR. Como se muestra en la Fig. 1.A-C, se observó una sólida expresión de los componentes clave de la vía Shh-Gli en el CSC de páncreas en comparación con sus partes normales de venta libre. La expresión de la proteína de estos componentes se confirmó por transferencia de Western como se muestra en la Fig. 1.D Curiosamente, se demuestra aquí que la vía hedgehog sonic es muy activa en células madre cancerosas pancreáticas que sugieren que la señalización de Shh-Gli hiperactivo puede regular la expresión de genes en células madre cancerosas pancreáticas stemness y desempeñar un papel en la proliferación celular y la progresión de las células madre cancerosas pancreáticas.

(a-C), la expresión relativa de los diversos componentes de la vía de Shh se cuantificó en las células humanas pancreáticas madre del cáncer (PanCSC), células madre normales pancreáticos humanos (HNPSC) y células humanas normales de páncreas ductales epiteliales (HPNE). La expresión de genes Shh se cuantificó usando un ensayo en tiempo real reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (Q-RT-PCR), y se normalizó a la expresión de GAPDH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. %, Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (D), inmunotransferencia de Gli1 /2, Smo y β-actina de las células humanas pancreáticas madre del cáncer (PanCSC), células madre normales pancreáticos humanos (HNPSC) y células ductales pancreáticas humanas normales epiteliales (HPNE).

el sulforafano inhibe la vía de señalización hedgehog en células madre cancerosas pancreáticas
in vitro

por lo tanto, tratamos de examinar los efectos de la SFN sobre la expresión del receptor de Shh (Smothened) y efectores (Gli1 y gli2) por QRT-PCR en células madre cancerosas pancreáticas humanas. Como se ve en la (Fig. 2.A-C), SFN inhibió la expresión de Smo, Gli1 y Gli2. Dado que ya hemos demostrado la activación de la vía Shh en un panel de líneas de células pancreáticas humanas [21], también tratamos de examinar los efectos de la SFN en la expresión del receptor de Shh (Smothened) y efectores (Gli1 y gli2) por QRT-PCR en células de cáncer pancreático ASPC y PANC-1. Como se muestra en la Fig. 3, SFN inhibió la expresión de Smo, Gli1 y Gli2 en estas líneas celulares, así, lo que sugiere que SFN puede inhibir la activación de la señalización de Shh en el cáncer de páncreas.

(A-C), la inhibición de componentes de sonic vía hedgehog. CSC pancreáticas fueron tratados con sulforafano (0-20 mM) durante 24 h. La expresión de Gli1, Gli2 y Smo se midió mediante qRT-PCR y se normalizó a la expresión de GAPDH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. *, @, Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05; (D), inmunotransferencia de Gli1 /2, SMO y β-actina de las células madre del cáncer de páncreas humano (PanCSC) tratados con sulforafano (0-20 mM).

(A-B), Inhibición de componentes de la vía hedgehog sónica. AsPC1 y Panc1 fueron tratados con sulforafano (0-20 mM) durante 24 h. La expresión de Gli1, Gli2 y Smo se midió mediante qRT-PCR y se normalizó a la expresión de GAPDH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. $, @ Y & amp; = Significativamente diferente de control, P & lt; 0.05.

Además, puesto que la presencia de la expresión de Gli nuclear es indicativa de la señalización de Hh activa, se examinaron los efectos de la SFN en la translocación nuclear de factores de transcripción Gli utilizando inmunocitoquímica (CPI). CSC pancreáticas fueron tratados con SFN (0-20 mM) durante 24 h. Las células fueron teñidas con anti-Gli y el anticuerpo Gli2 (fluorescencia verde) y DAPI (fluorescencia roja). imágenes fusionadas se muestran, los cuales indican la tinción de color amarillo-naranja de Gli 1 y Gli2 situada en el núcleo debido a la fusión de la fluorescencia verde y roja. Como se muestra en la Fig. 4A, SFN inhibe la translocación nuclear de Gli1 y Gli2, según lo medido por la CCI. Estos datos, por lo tanto, sugieren que SFN inhibe la vía hedgehog sonic a nivel de la activación de Gli.

(A), la translocación nuclear de Gli1 y Gli2, se midió mediante inmunocitoquímica. CSC pancreáticas fueron tratados con sulforafano (0-20 mM) durante 24 h. Las células fueron teñidas con anti-Gli y el anticuerpo Gli2 (fluorescencia verde) y DAPI (fluorescencia roja). imágenes fusionadas se muestran, que indican la tinción de color amarillo-naranja de Gli 1 y Gli2 situada en el núcleo debido a la co-localización de fluorescencia verde y rojo. (B), la inhibición de la transcripción Gli. Células madre cancerosas pancreáticas fueron transducidas con partículas virales GFP Gli-sensible /luciferasa de luciérnaga (pGreen Fire1-Gli con EF1, Sistema Biosciences). Después de la transducción, el medio de cultivo se reemplazó y células madre cancerosas fueron tratados con sulforafano (0-20 mM) durante 24 h. actividad de reportero Gli-sensible se midió usando un ensayo de luciferasa (Promega Corporation). Los datos representan la media ± SD. @,%, Y * = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05.

La interrupción de la señalización de Shh por sulforafano inhibe la actividad de reportero Gli en células madre cancerosas de páncreas

Desde factor de transcripción Gli media los efectos de Shh que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de troncalidad y la tumorigénesis, hemos siguiente medido la actividad transcripcional Gli (Fig. 4B). Células madre cancerosas pancreáticas fueron transducidas con partículas virales GFP Gli-sensible /luciferasa de luciérnaga (pGreen Fire1-Gli con EF1, Sistema Biosciences). SFN inhibe la actividad transcripcional Gli en una forma dependiente de la dosis. Estos datos sugieren que SFN puede regular la carcinogénesis pancreática que está mediada a través de la inhibición de la señalización de Shh.

Inhibición de Gli aumenta los efectos de sulforafano sobre la formación de esferoides en pancreático CSC

Además, para determinar la efecto de NFS en la inhibición de la señal Shh sobre la proliferación de páncreas CSC y autorrenovación, se realizó ensayo de formación de esferas. Células madre cancerosas pancreáticas fueron tratados con SFN (0-20 mM) durante 1 semana y evaluados por su capacidad intrínseca para formar esferas primarias en cultivo. Al final de una semana, se midieron el número total de esferas y la capacidad para formar esferas secundarias fue evaluado por otra semana. CSC pancreático humano esferas derivados se inhibieron significativamente por tratamiento con SFN, lo que sugiere el agotamiento clonogénico de la CSC (Fig. 5A).

(A), los efectos inhibitorios de SFN sobre la viabilidad esferoide de CSC. CSC pancreáticos se sembraron como se describió anteriormente y se trataron con SFN (0 y 20 mM). Después de 7 y 14 días, esferoides primarias y secundarias se disociaron y las células viables se contaron mediante el ensayo de azul de tripano. Los datos representan la media ± SD. @, Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (B), de páncreas CSC se transdujeron con cualquiera revueltos shRNA o Gli1 y Gli2 shRNA expresar vectores lentivirales (pLKO.1), y se recogieron los lisados ​​celulares y análisis de transferencia Western se realizó con anti-Gli1 o anticuerpo Gli2. (C), CSC /revueltos y CSC /Gli shRNA se sembraron como se describió anteriormente y se trataron con SFN (0-20 mM). Después de 7 días, se recogieron esferoides y suspensiones celulares se prepararon y las células viables se contaron mediante el ensayo de azul de tripano. Los datos representan la media ± SD. @,%, Y * = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (D), Gli shRNA mejora los efectos inhibidores de SFN sobre la viabilidad esferoide de CSC. CSC /revueltos y CSC /Gli shRNA se sembraron como se describió anteriormente y se trataron con SFN (0 y 20 mM). Después de 7 días, se photomicrographed esferoides.

Teniendo en cuenta el requisito de la señalización de Hedgehog en el cáncer de páncreas, se investigó si erizo bloqueo por parte de sulforafano podría tener como objetivo la población de células madre en el cáncer de páncreas. Para entender el papel de la señalización de Shh en la inhibición de la proliferación inducida por el SFN CSC de páncreas, hemos tratado de inhibir la señalización de Shh en células madre cancerosas pancreáticas derribando el factor de transcripción Gli utilizando lentiviral transducción mediada por la inhibición de Gli shRNA tanto Gli1 y 2 de expresión. La expresión de Gli en el CSC de páncreas fue suprimida en casi un 100% el uso de los shRNAs dirigidos Gli1 y gli2 tal como se cuantifica por Western Blot (Fig. 5B). Como se muestra en la (Fig. 5C-D), el porcentaje de esfera capacidad de células madre cancerosas pancreáticas que forma se redujo significativamente en células Gli ronda hacia abajo con respecto a las células control. Además, la interferencia de Shh- Gli señalización a través de lentiviral - mediada por el silenciamiento efectos inhibidores significativamente bloqueado SFN inducida que demuestran la exigencia de una vía activa para el crecimiento de las células madre de cáncer de páncreas

SFN inhibe la expresión de pluripotencia mantenimiento de los factores de transcripción.

Hemos demostrado recientemente que expresan las células madre pancreáticas de CSC marcadores CD133, CD44, CD24, eSA, expresan altos niveles de factores de pluripotencia mantenimiento, y los genes de resistencia a fármacos MDR1 y ABCG2 en comparación con las células pancreáticas normales y las células de cáncer de páncreas [22]. Por lo tanto, se caracterizaron los aislados a partir de células madre cancerosas de los tumores pancreáticos humanos por citometría de flujo utilizado en el presente estudio. Como se muestra en la (Fig. 6A-D), de páncreas células madre cancerosas expresan marcadores de células madre CD44, ESA, CD133 y CD24. Curiosamente, pancreático CD44
+ ESA
+ CD133
+ CD24
+ células madre cancerosas también expresó CK19 (cáncer de páncreas específica marcador epitelial) y los genes de resistencia a fármacos ABCG2 (Fig. 6E-F).

(A-D), la expresión de marcadores de células madre pancreáticas. Análisis citométrico de flujo de páncreas células madre cancerosas que expresan se ha realizado mediante marcadores de células madre CD44 -PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC y controles apropiados. (E-F), la expresión de marcadores epiteliales pancreáticas y genes de resistencia a fármacos. Análisis de citometría de flujo de páncreas CD44
+ ESA
+ CD133
+ CD24
+ células madre cancerosas también expresó CK19-PE y ABCG2-PE, respectivamente.

Nanog es esencial para pluripotencia, junto con otros factores como la eS de firma, tales como Oct4 también son críticos para los CAC de páncreas y otros tipos de cáncer [23], [24]. Son aceptados Hh genes diana también. De hecho, los niveles de OCT4 pueden inducir displasia epitelial en ratones, y se ha implicado en diversos tumores humanos como también regulados por la señalización de Hh-Gli. Por lo tanto, tratamos de examinar los efectos de la SFN en la expresión de estos factores
in vitro
. Como se muestra en la (Fig. 7A-B), SFN inhibe la expresión de ARNm de Nanog, Oct-4 y en células madre cancerosas pancreáticas. Además, como se confirmó por Western Blot en la (Fig. 7C), SFN inhibe la expresión de la proteína de Nanog, Oct-4 y en células madre cancerosas pancreáticas. Estos datos indican que la señalización de Shh puede promover la proliferación de células madre cancerosas de páncreas a través de la auto-renovación celular mejorada.

(A-B), Efectos de la SFN sobre la expresión de Hh genes diana en las células madre cancerosas pancreáticas. PCR en tiempo real (Q-RT-PCR) se realizó para examinar la expresión de Nanog y Oct4 y los datos se normalizaron con GAPDH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. @ Y% = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (C), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SFN (0-20 mM), y se recogieron los lisados ​​celulares y análisis de transferencia Western se realizó con anti-Nanog, Oct4 o anticuerpo β-actina. (D-E), Efectos de la SFN sobre la expresión de Hh genes diana implicados en la proliferación celular en las células madre cancerosas pancreáticas. PCR (Q-RT-PCR) en tiempo real se realizó para examinar la expresión de PDGFR y Ciclina D1, que participan en el mantenimiento de la proliferación se analizó y normalizado con GAPDH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. @,%, Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (F), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SFN (0-20 mM), y se recogieron los lisados ​​celulares y Immunobloted de anti-PDGFR, ciclina D1 o anticuerpo β-actina.

Hedgehog blockadge la señalización por sulforafano inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis en células madre cancerosas de páncreas

a continuación examinó los efectos de la SFN en la expresión de ARNm de genes aguas abajo de Gli transcripción que están implicados en la proliferación celular. Como se muestra en la (Fig. 7D-E), SFN inhibida objetivos de abajo de la transcripción Gli ciclina D1 y PDGFR en células madre cancerosas pancreáticas que son conocidos Hh objetivo genes implicados en la proliferación. Además, la inhibición de la expresión de la proteína de estos objetivos por SFN en células madre cancerosas pancreáticas se confirmó mediante inmunotransferencia de tipo Western en la (Fig. 7F). Estos datos sugieren que SFN puede regular la carcinogénesis pancreática mediante la inhibición de la vía Shh y sus objetivos de abajo.

Además, hemos demostrado que la SFN indujo apoptosis en células madre cancerosas pancreáticas mediante la inhibición de Bcl-2 y la expresión a través de la activación de la caspasa 3 /7 (Fig. 8A-B). La inhibición de la expresión de la proteína de BCL2 y la regulación positiva de la caspasa-3 troceados, se confirmó mediante transferencia Western, como se muestra en la (Fig. 8C). Además, análisis citométrico de flujo con tinción con PI de células tratadas con SFN en la (Fig. 8D), representa que dosis crecientes de SFN aumento de la apoptosis en células madre cancerosas pancreáticas de una manera dependiente de la dosis. Estos datos sugieren que SFN puede inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis en células madre cancerosas pancreáticas por la orientación vía de Shh y sus genes diana.

(A), Efectos de la SFN de Bcl-2expression. Q-RT-PCR se realizó para examinar la expresión de Bcl-2. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de ΔΔ
C
método t. Los datos representan la media ± SD. @,% Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (B), Efectos de la SFN de la caspasa-3/7 actividad. CSC pancreático tratados con SFN (0-20 mM) durante 24 h, y la actividad de la caspasa-3/7 se midió según las instrucciones del fabricante. Los datos representan la media ± SD. @,%, Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0.05. (C), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SFN (0-20 mM), y se recogieron los lisados ​​celulares y Immunobloted para anti- BCL-2, caspasa 3 escindida o anticuerpo β-actina. (D), Efectos de la SFN sobre la apoptosis. Células madre cancerosas pancreáticas fueron tratados con SFN (0-20 mM) durante 48 h, y la apoptosis se midió mediante tinción PI mediante citometría de flujo.

Discusión

El cáncer de páncreas se vuelve clínicamente evidente a finales etapas y que resiste todas las formas de quimioterapia convencional y la radioterapia [1], [2]. Recientemente hemos demostrado que los CAC comparten características moleculares con células madre normales (SCS) y juega un papel crítico en resistencia a los medicamentos y la metástasis del cáncer. Células madre cancerosas pancreáticas también demuestran la regulación positiva de moléculas importantes en las vías de señalización del desarrollo, incluyendo la vía Sonic hedgehog (Shh). activación incontrolada de la vía de Shh se ha implicado en la progresión y el mantenimiento de los adenocarcinomas de páncreas [25], [26]. activación de la vía a través de Smo por lo tanto puede ocurrir ya sea por la estimulación de proteína Hh oa través de la pérdida de actividad Ptch, como se ve en cánceres esporádicos o aquellos que surgen en el síndrome de predisposición al cáncer familiar, BCNS (síndrome del nevo de células basales, asociado con la mutación heterocigota del Ptch humano gene). La activación de la vía de señalización de Shh está implicado en la regulación de la proliferación de las células madre cancerosas pancreáticas [27]. Por lo tanto, los agentes que inhiben la vía de Shh tienen el potencial de prevenir la progresión de la enfermedad y la diseminación metastásica [28]. Así como fármacos que se dirigen selectivamente células madre cancerosas ofrecen una mayor promesa para la prevención y el tratamiento del cáncer. Este proyecto se basa en la premisa de que SFN, un compuesto natural de los vegetales crucíferos, se puede utilizar para la prevención y /o tratamiento de cáncer de páncreas humano. Por lo tanto, el principal objetivo del presente estudio fue investigar el papel de la vía hedgehog sónica en el cáncer de páncreas y examinar los mecanismos moleculares por los que el sulforafano inhibe características pancreáticas CSC, y evaluar su quimiopreventivo /potencial terapéutico contra el cáncer de páncreas en la orientación células madre cancerosas.

SFN es un isotiocianato de origen natural con actividad quimiopreventivo prometedor [29]. Los estudios epidemiológicos han demostrado que las personas que comen vegetales crucíferos han reducido la incidencia de cáncer de páncreas y otros tipos de cáncer. De prueba con animales han demostrado que la alimentación de SFN redujo la frecuencia, el tamaño y número de tumores de diversos orígenes. Estaba bien y se absorbe rápidamente y se muestra una biodisponibilidad absoluta del 82% [30]. Es una enzima inductor de fase 2 [31], e inhibe la benzo [a] pireno-formación de ADN y aductos de 1,6-dinitropyrene-ADN. Actúa como un antioxidante, antiproliferativo, antitumoral, y el agente anti-angiogénico, y por lo tanto un nuevo candidato para la quimioprevención [19], [32], [33], [34]. Se han notificado algunos estudios recientes sobre las células madre del cáncer de páncreas derivados de líneas celulares humanas, donde han demostrado que SFN puede inhibir su crecimiento a través de la inhibición de NFKB [35]. Estos estudios sugieren fuertemente que la SFN se puede modular la expresión de genes que se sabe que juegan un papel en el proceso de la carcinogénesis y, por lo tanto, puede ser un agente potencial para la quimioprevención contra el cáncer de páncreas. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que muestra que el sulforafano puede inhibir el crecimiento de células madre cancerosas pancreáticas primarios derivados de tumores humanos
in vitro
a través de la inhibición de la vía Hedgehog Sonic y por lo tanto son considerados como muy novedoso.

en el presente estudio hemos demostrado por primera vez, que el agente preventivo del cáncer SFN inhibe la expresión de los componentes de la vía de Shh en células madre cancerosas pancreáticas humanas. SFN inhibió la expresión de la molécula de receptor Smo, así como efectores Gli 1 y 2, lo que sugiere la importancia clínica de la vía de Shh en la progresión del cáncer de páncreas. La activación forzada de expresión Shh o la inhibición de Gli1 más Gli2 por shRNA bloqueó los efectos inhibidores de la SFN, lo que sugiere los efectos de la SFN están mediadas a través de la inhibición de la vía de Shh. SFN inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas humanas mediante la inhibición de los factores de pluripotencia y el mantenimiento de la vía Shh. Específicamente, SFN inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas mediante la inhibición de la expresión de pluripotencia mantenimiento de factores de transcripción (Nanog Octubre-4), los componentes de la vía de Shh, e induce la apoptosis mediante la inhibición de Bcl-2, ciclina D2, y la caspasa activación -3 y 7. en conjunto nuestros estudios actuales sugieren fuertemente que la SFN es un inhibidor potente biológica de la carcinogénesis pancreática humana, reduciendo su proliferación y las actividades invasivas. Estos estudios eleva el punto de vista que el sulforafano puede ser un agente beneficioso para la prevención y /o tratamiento de cáncer de páncreas en las CSC de orientación.

Dado que las células CSC /progenitoras juegan un papel importante en la iniciación del cáncer, la progresión, recurrencia y resistencia a los medicamentos , la inhibición del crecimiento de CSC y su capacidad de auto-renovación por el sulforafano podría ser importante para el tratamiento del cáncer de páncreas y ha sido revisado recientemente en varios trabajos como una estrategia quimiopreventivo de agentes dietéticos para atacar a las células madre del cáncer [36], [37]. La elucidación del mecanismo (s) para la actividad antiproliferativa de SFN es crítica para la evaluación global por su potencial utilidad clínica. Dicha información no sólo permitirá el diseño racional de sulforafano, las estrategias basadas en la prevención y /o tratamiento de cáncer de páncreas, pero también podría facilitar el desarrollo de protocolos mecanismo impulsado por los efectos clínicos óptimos.

Conclusiones

hemos demostrado aquí por primera vez, que SFN inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas aisladas de tumores primarios humanos e inhibe las características de páncreas CSC. Los efectos inhibidores de SFN están mediados por la inhibición de la vía de Shh. SFN inhibió la expresión de factores de transcripción (Nanog y Oct-4) que se requieren para el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre. SFN elimina potentemente las características CSC pancreáticas al afectar clonogenecity, la formación de esferoides junto con la señalización implicadas en la resistencia a la apoptosis y la proliferación. Por lo tanto, la regulación de la vía de señalización de Shh en CSC por agente sulforafano no tóxico, podría considerarse como una estrategia novedosa para el tratamiento y /o prevención de cáncer de páncreas. Dado que la señalización de Shh aberrante se produce en la tumorigénesis pancreática, productos terapéuticos que se dirigen a la vía Shh pueden mejorar los resultados de pacientes con cáncer de páncreas en la orientación células madre cancerosas, además de facilitar el desarrollo de protocolos mecanismo impulsado por los efectos clínicos óptimos.

Materiales y Métodos

Reactivos

Los anticuerpos contra GAPDH y Gli fueron adquiridos de Señalización Cell Technology, Inc. (Danvers, MA). SFN se adquirieron de LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). quimioluminiscencia (ECL) Western blot reactivos de detección fueron de Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). Todos los demás productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cultivo de células

Las células madre pancreáticas normales Humanos (HPSC) y las células madre del cáncer de páncreas humano (CD133
+ /CD44
+ /CD24
+ /ESA
+) se obtuvieron de Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Ellos fueron aisladas de los tumores primarios y se han descrito anteriormente [38]. Estas células madre cancerosas consisten en una población de células madre de cáncer de páncreas mayor, y por lo tanto no pueden ser consideradas como una línea celular. Las células madre cancerosas se cultivaron en DMEM suplementado con 1% Suplemento N2 (Invitrogen), 2% Suplemento B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crecimiento de plaquetas humano (Sigma-Aldrich), 100 ml de factor /ng de crecimiento epidérmico (Invitrogen) y 1 % de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. Se obtuvieron células normales pancreáticos humanos ductales epiteliales (HPNE) de

Lonza, Clontetics y mantenido en DMEM suplementado con factor de crecimiento kit bala.

ensayos Tumor esferoide ensayo

esferoide que forman se realizaron como se describe en otra parte [22], [39].