Extracto
La activación anormal del Sonic hedgehog (Shh) y la vía ha sido descrita en una amplia variedad de cánceres humanos y en las células madre del cáncer (CSC), sin embargo, el papel de la vía SHH en los CAC gástrica tiene no se ha informado. En este estudio, se investigó la posibilidad de que la activación anormal de la vía SHH mantiene las características de células madre cancerosas gástricas. En primer lugar, hemos identificado el cáncer de células madre similares (CSLCs) a partir de líneas celulares de cáncer gástrico humano (HGC-27, MGC-803 y MKN-45) usando tumorsphere cultura. En comparación con las células adherentes, las células flotantes tumorsphere tenían más capacidad de auto-renovación y la quimio-resistencia. Las células que expresan marcadores CSC (CD44, CD24 y CD133) también fueron significativamente más en tumorsphere células que en las células adherentes. Más importante aún, en los estudios in vivo de xenoinjertos mostraron que los tumores podrían ser generados con 2 × 10
4 tumorsphere células, que era 100 veces menos que los requeridos para los tumores de siembra por células adherentes. A continuación, RT-PCR y Western blot mostraron que los niveles de expresión de Ptch y Gli1 (genes diana vía SHH) fueron significativamente mayores en tumorsphere células que en las células adherentes. Los resultados de cuantitativa en tiempo real PCR fueron similares a los de RT-PCR y Western blot. Un análisis más detallado reveló que la vía SHH bloqueados por ciclopamina o 5E1, determinó una mayor reducción de la capacidad de auto-renovación de la HGC-27 tumorsphere células que la de las células adherentes. También se encontró que SHH vía bloquea fuertemente mejorado la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos en HGC-27 tumorsphere células in vitro e in vivo pero no tuvo efecto significativo en las células adherentes. Por último, hemos aislado los tumorspheres a partir de muestras de cáncer gástrico, estas células también tenían la quimio-resistencia y la capacidad tumorigénico, y la vía SHH mantienen las características CSLCs gástricos de tumorsphere células de muestras de tumores primarios. En conclusión, nuestros datos sugieren que la vía SHH era esencial para el mantenimiento de CSLCs en el cáncer gástrico humano
Visto:. Canción Z, W Yue, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog vía es esencial para el mantenimiento de las células de vástago como un cáncer en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687
Editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Noviembre 2010; Aceptado: 10 Febrero 2011; Publicado: 4 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de alta Tecnología de Investigación y Desarrollo de China (# 2006AA402A04,#2006AA02A107), el Programa Estatal Mayor de Investigación básica de China (# 2009CB521704), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 30872468,#30873031). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los CCC desempeñan un papel importante en el desarrollo del cáncer, esta subpoblación dentro del tumor posee las características de la capacidad de auto-renovación, la quimio-resistencia y la capacidad tumorigénico tanto, pueden desempeñar un papel crucial en la iniciación, progresión y recurrencia de cáncer. El examen y la manipulación de las vías bioquímicas involucradas en esas características es una de las mejores maneras de contribuir a las CSC, lo que lleva al desarrollo de nuevos fármacos y procedimientos de tratamiento. vía de SHH desempeña un papel crítico en muchas células madre cancerosas, tales como células madre glioblastoma [1], [2], CD34 + células leucémicas [3], [4] y células madre cancerosas de mama [5], además, que es crucial para el desarrollo y la homeostasis de la glándula gástrica [6], la activación anormal de la vía de SHH podría resultar en cáncer gástrico [7], [8], sin embargo, el papel de la vía de SHH en los CSC gástrico no es claro.
vía de SHH en células de mamíferos está mediada por ligandos Shh [9]. En ausencia de Shh, el receptor transmembrana patched (Ptch) inhibe la actividad de otra proteína transmembrana, smoothened (SMO), lo que resulta en la inactivación de la vía de SHH [9], [10]. La unión de Shh a Ptch abroga el efecto inhibidor de Ptch y Smo se derepressed, activando de esta manera el factor de transcripción Gli (Gli1, Gli2 y Gli3) [9], [10]. Gli1 es un activador positivo fuerte de los genes diana y es en sí misma una diana transcripcional de SHH vía [11]. Por lo tanto, Gli1 se considera un marcador de SHH ruta de activación anormal [10], [12]
Recientemente, se han identificado y aislado a partir de tumores malignos varios tipos de células madre cancerosas o CSLCs [13] - [25].. En el cáncer gástrico, metodológicamente, es difícil de aislar y amplificar células madre cancerosas de líneas celulares o muestras de tejido tumoral. En la actualidad, CD44 parece ser el marcador más útil para la purificación prospectivo de células madre cancerosas gástricas, sin embargo, no es muy específico para células madre cancerosas gástricas [26].
En este estudio, hemos aislado CSLCs de gástrica humana líneas celulares de cáncer (HGC-27, MGC-803 y MKN-45) usando tumorsphere cultivo en un medio libre de suero y se identificaron la capacidad de auto-renovación, la quimio-resistencia y la capacidad de las células tumorigénicas tumorsphere; A continuación, se analizó la expresión de moléculas relacionadas con la vía SHH-Shh, incluyendo, Ptch, SMO, Gli1 y Gli2 en tumorsphere células y las células adherentes, sobre todo la expresión de Ptch y Gli1.Then, bloqueamos la vía SHH mediante ciclopamina o tomatidina de control, 5E1 o controlar PBS para investigar si las características de CSLCs en tumorsphere células se mantuvieron por la activación anormal de la vía de SHH. Finalmente, hemos utilizado muestras de cáncer gástrico primario para analizar los aspectos funcionales de la vía de SHH en CSLCs gástricos.
La ciclopamina es un alcaloide esteroideo de células permeable. Se interrumpe el colesterol bio-síntesis y antagoniza específicamente la vía de señalización de SHH mediante la interacción directa con Smo (suavizado), un pariente lejano de los receptores acoplados a la proteína G. Es una valiosa herramienta para el estudio de la implicación de la señalización de SHH en el desarrollo de diversos tumores. Tomatidina es un alcaloide esteroideo que se asemeja estructuralmente ciclopamina, pero carece de la capacidad para inhibir la señalización de SHH. Se puede utilizar como un control negativo. 5E1 es un anticuerpo monoclonal anti-Hh, que neutraliza la actividad de SHH y IHH.
> 1. Tumorsphere células poseían las características de CSLCs
Hemos crecido HGC-27, MGC-803 y MKN-45 células adherentes en medio libre de suero se describe en la sección de métodos. Después de 7 días, se observaron tumorspheres que consta de aproximadamente 50 a 100 células (Fig. 1A).
(A) Tumorspheres formado después de 14 días. (B) La capacidad de formación de sub-tumorspheres de tumorsphere células (barras blancas) y las células adherentes (barras negras). * = P & lt; 0,05. Bares = 1000μm. (C) La capacidad de formación de colonias de células tumorsphere (barras blancas) y las células adherentes (barras negras) en condiciones independientes de anclaje mediante ensayos de agar blando. * = P & lt; 0,05. (D) Efecto de 48 horas la exposición de las células tumorsphere (barras blancas) y las células adherentes (barras negras) a 1000 fármaco quimioterapéutico M. Ox = oxaliplatino, Mi = mitomysin. * = P. & Lt; 0,05
La capacidad de auto-renovación de estos tumorspheres se evaluó mediante la disociación de ellos en una sola célula, y cultivar a una densidad clonal de 1.000 células por mililitro. Después de 2 semanas, una sola célula deriva de HGC-27 tumorsphere células generadas sub-tumorspheres al 41,83% ± 3,13% en comparación con el 8,17% ± 2.40% de células adherentes, por otra parte, en el MGC-803 y MKN-45, la formación de sub-tumorspheres tasa de tumorsphere células eran también más alta que la de las células adherentes. (Fig. 1B). Estos datos sugirieron que la capacidad de auto-renovación de células tumorsphere fue significativamente mayor que la de las células adherentes. células Tumorsphere también mostraron una mayor capacidad para formar colonias en condiciones independientes de anclaje en un ensayo de agar blando estándar después de 14 días en HGC-27 y MKN-45 (Fig. 1C).
también se realizó una dilución limitante ensayo para la formación de esferoides mediante HGC-27 células tumorsphere y las células adherentes, respectivamente. Como se muestra en la Tabla S1, aproximadamente el 27-35% de las células tumorsphere podría producir esferoides, mientras que menos del 5% de las células adherentes podría generar esferoides después de cultivo de 3 semanas. Por lo tanto, en las células tumorsphere HGC-27, se podría estimar que los esferoides a la conformación de la población de células comprendían un máximo del 35%.
La quimiorresistencia es otra de las características de células madre cancerosas, por lo que investigó si la diferencia en la quimio-resistencia existía entre tumorsphere células y las células adherentes. Los resultados mostraron que, después de 48 horas, las células tumorsphere demostraron significativamente mayor resistencia a las drogas en comparación con las células adherentes en las mismas condiciones (Fig. 1D). También se evaluó la quimiorresistencia de tumorsphere células HGC-27 y las células adherentes a diferentes concentraciones de fármacos, sin embargo, tanto las células tumorsphere y las células adherentes no mostraron significativamente quimiorresistencia a los fármacos de una manera dependiente de la dosis (Fig. S1).
a continuación, se examinó la expresión de CD44 en las células disociadas tumorsphere y las células adherentes utilizando ensayo de inmunofluorescencia y Western blot. Los resultados mostraron que las células que expresan CD44 fueron significativamente más en tumorsphere células que en las células adherentes (Fig. 2A). Además, la expresión de otros marcadores CSC (CD24 y CD133) en tumorsphere células y las células adherentes se examinó por transferencia de Western, en comparación con tumorsphere células, la expresión de CD24 fue significativamente menor en las células adherentes, mientras que la expresión de CD133 fue similar (Fig . 2B). Además, fraccionado HGC-27 células por FACS de clasificación para CD44, se encontró que CD44 fracción de células (+) podría generar más colonias esferoide en comparación con CD44 (-) fracción de células, por otra parte, el tamaño de las colonias de esferoides de CD44 células (+) era más grande que los de CD44 (-). células (Fig. 2C)
(a) La inmunofluorescencia (panel izquierdo) y el Western Blot (panel derecho) análisis de CD44 (color verde) en las células mecánicamente disociadas y tumorsphere las células adherentes. Los núcleos se counterstained por DAPI (color azul). = células tumorsphere CTs, ACS = células adherentes. Bares = 100μm. (B) La expresión de CD24 y CD133 en tumorsphere células y las células adherentes por el Western Blot, β-actina se proporcionan como un control. (C) La capacidad de formación tumorspheres de HGC-27 células CD44 (+) y CD44 - células (). * = P & lt; 0,05. Bares = 1000μm.
2. Tumorsphere células podrían generar tumores sobre los xenotrasplantes
Para los estudios de xenoinjertos, igual número (2 × 10
4, 2 × 10
5, 2 × 10
6, 2 × 10
7) del recién disociada tumorsphere células o células adherentes de control se inyectó sc en cada ratón (6 ratones por grupo). Los resultados mostraron que los tumores se generaron con 2 × 10
4 tumorsphere células, que era 100 veces menos que los requeridos para la siembra tumoral por las células adherentes (Tabla 1). Por otra parte, tumorsphere células generan tumores subcutáneos con volumen más grande y el tiempo más corto en comparación con los generados a partir de células adherentes (Fig. 3A, B). Por lo tanto, la inyección subcutánea de bajo número de células tumorsphere confirmó que las células conservan la capacidad más fuerte esferoide tumorigénico en ratones desnudos que las células adherentes.
(A) el crecimiento del tumor subcutáneo en ratones desnudos después de la inyección de 27-HGC tumorsphere células ( 2 × 10
5) en el flanco trasero izquierdo de cada ratón y el mismo número de células adherentes en el flanco trasero derecho de cada ratón. (B) Tamaño del tumor subcutáneo después de la inyección de 2 × 10
5 HGC-27 tumorsphere células, 2 × 10
5 HGC-27 células adherentes y 2 × 10
6 HGC-27 células adherentes. (C) H & amp; E análisis de tinción de xenoinjertos derivados de HGC-27 tumorsphere células. Bar = 100 micras. (D) Tumorspheres deriva de xenoinjertos. Bar = 1,000 m. (E) el crecimiento del tumor subcutáneo en ratones desnudos después de la inyección de tumorsphere células (2 × 10
5) derivados de xenoinjertos
H & amp;. E examen de xenoinjertos derivados de HGC-27 células tumorsphere mostraron que estos tumores se parecían mucho a la de tumor humano original, que contiene principalmente células diferenciadas (Fig. 3C). Es importante destacar que, tumorspheres podrían ser re-derivan de los tumores xenotransplantados (Fig. 3D), y podrían formar de nuevo tumor (Fig. 3E). Por tanto, estos datos indican que las células tumorsphere representados CSLCs que tenían capacidad tumorigénico.
3. vía SHH se expresa en mayor tumorsphere células que en las células adherentes
Para investigar la relación entre la vía SHH y CSLCs características de tumorsphere células, lo primero que examinó la expresión ARNm de moléculas relacionadas con la vía SHH-Shh, incluyendo, Ptch, smo, Gli1 y Gli2 por RT-PCR. Los resultados mostraron que todos los mRNAs se expresan en alta HGC-27 tumorsphere células. En comparación con tumorsphere células, los niveles de expresión de Shh, Ptch, Smo y Gli1 fueron significativamente menores en las células adherentes, mientras que los niveles de expresión de Gli2 fueron similares a tumorsphere células. En MGC-803 y MKN-45, los niveles de expresión de Shh, Ptch y Gli1 también fueron significativamente más bajos en las células adherentes que en tumorsphere células, mientras que los niveles de expresión de Smo y Gli2 tenían diferencias significativas entre las células adherentes y tumorsphere células (Fig . 4A).
(a) La expresión del ARNm de Shh, Ptch, SMO, Gli1 y Gli2 en tumorsphere células y las células adherentes se analizó por RT-PCR. La expresión de GAPDH se utilizó como control. (B) La expresión de la proteína de Shh genes diana vía (Ptch y Gli1) se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western, β-actina se proporciona como un control. = células tumorsphere CTs, ACS = células adherentes. análisis (C) Cuantitativa en tiempo real RT-PCR de los genes diana SHH (vía ptch y Gli1) mostró los mismos resultados de la semi-cuantitativos de RT-PCR. Los resultados se calcularon como se entiende + S.D.. los valores de las mediciones por triplicado de tres experimentos separados. células de las CT = Tumorsphere, ACS = células adherentes.
En la vía SHH, Ptch y Gli1 son los genes diana, que son considerados como importantes marcadores de activación anormal vía SHH. Por lo tanto, hemos examinado aún más los niveles de expresión de Ptch y Gli1 por Western blot y PCR en tiempo real cuantitativa.
Cuando mediante Western blot, se encontró que los niveles de expresión de Ptch y Gli1 también fueron más altos en las células que tumorsphere en células adherentes (Fig. 4B). El próximo evaluó los niveles de expresión de Ptch y Gli1 en xenoinjertos de HGC-27 por cuantitativos PCR en tiempo real. Análisis cuantitativos PCR en tiempo real de los genes diana SHH (PTCH y GLI1) mostraron los mismos resultados de arriba semi-cuantitativos RT-PCR (Fig. 4C).
4. bloqueo de la vía SHH redujo la capacidad de auto-renovación y la quimio-resistencia de HGC-27 tumorsphere células
Para comprobar si existe un posible papel de la vía SHH en la capacidad de auto-renovación de células tumorsphere, se utilizó la ciclopamina o control tomatidina, o 5E1 control de PBS para bloquear la vía.
los resultados mostraron que el tratamiento con ciclopamina condujo a una significativa reducción de la capacidad para la formación de sub-tumorspheres en 27 HGC-tumorsphere células de una manera dependiente de la dosis, pero no tal efecto se observó en las células adherentes (Fig. 5A). Además, evaluó si el tratamiento con ciclopamina afectaría a la capacidad de formación de colonias de células HGC-27 tumorsphere por ensayo de crecimiento -independiente de anclaje. Del mismo modo, la capacidad para formar colonias se redujo más en las células tumorsphere de una manera dependiente de la dosis en relación con las células adherentes (Fig. 5B).
(A) La capacidad de formación de sub-tumorspheres de HGC-27 tumorsphere células y las células adherentes tratadas con diferentes concentraciones de ciclopamina o control tomatidina (círculo abierto = ciclopamina; círculo cerrado = tomatidina control). Las líneas negras son células tumorsphere, rojo son células adherentes. * = P & lt; 0,05. células de las CT = tumorsphere. Bares = 1000μm. (B) La formación de colonias de HGC-27 tumorsphere células y las células adherentes tratadas con diferentes concentraciones de ciclopamina o control tomatidina en condiciones independientes de anclaje (círculo abierto = ciclopamina; círculo cerrado = tomatidina control). Las líneas negras son células tumorsphere, rojo son células adherentes. * = P & lt; 0,05. células de las CT = tumorsphere. (C) Porcentaje de viabilidad celular se analizó en HGC-27 tumorsphere células y las células adherentes (D) después de la exposición a diferentes concentraciones de ciclopamina o 5 ciclopamina uM con diferentes fármacos durante 48 horas. El grupo de control es tomatidina. Cic = ciclopamina, Ox = oxaliplatino, Mi = mitomysin. * = P. & Lt; 0,05
A continuación, se investigó el efecto de la vía SHH en la quimio-resistencia de 27-HGC tumorsphere células, se trataron las células disociadas con ciclopamina o tomatidina de control durante 48 horas, y después de la droga se evaluó la resistencia de tumorsphere células. Cuando ciclopamina fue seguido por las drogas, el tratamiento resultó en una tasa global de muerte celular significativamente mejorada. Los mejores resultados se obtuvieron cuando se combinó con ciclopamina oxaliplatino más mitomicina (Fig. 5C). No existe el efecto sinérgico se observó en las células adherentes después de la exposición a las drogas con ciclopamina durante 48 horas (Fig. 5D).
También ensayamos el efecto de diferentes concentraciones de ciclopamina (2.5 uM, 5 uM, 10 uM) sobre la muerte celular. Los resultados mostraron que la ciclopamina sola para tumorsphere células podría hacer una pequeña pero constante disminución en el número de células viables. En comparación con 27-HGC tumorsphere células, el efecto de la ciclopamina sobre la muerte celular de las células adherentes fue más importancia (Fig. 5C, D).
Cuando vía SHH fue bloqueado por 5E1 o control de PBS, los resultados de la auto capacidad -renewing y quimiorresistencia de tumorsphere células y las células adherentes fueron similares a los bloqueados por la ciclopamina o tomatidina control (Fig. S2).
5. SHH vía el bloqueo de la respuesta tumoral mejorado para fármacos en vivo
Para probar esta hipótesis in vivo, analizamos si SHH vía el bloqueo de eficacia mejorada de la quimioterapia, la ciclopamina o control tomatidina se utilizó para inhibir las respuestas de la vía SHH. HGC-27 tumorsphere células se dejaron crecer en ambos flancos traseros de ratones desnudos hasta que el diámetro más grande de tumor alcanzó aproximadamente 2 mm. Los ratones se trataron a continuación, dos veces a la semana durante 3 semanas con ciclopamina o control tomatidina 24 horas antes de la entrega oxaliplatino. En todos los ratones tratados, los tumores tratados con oxaliplatino fueron significativamente más pequeños que los no tratados con oxaliplatino. Por otra parte, los tumores mostraron significativamente mayor inhibición del crecimiento tumoral cuando fueron tratados con oxaliplatino en combinación con ciclopamina, la respuesta del tumor a fármaco quimioterapéutico se ve reforzada por la ciclopamina (6A. Fig, B). También se investigó si la vía SHH bloqueado por 5E1 o control PBS eficacia mejorada quimioterapia in vivo, los resultados mostraron que 10 mg de tratamiento /ml 5E1 condujo a una inhibición del crecimiento del tumor significativamente mayor que los tratados sólo con oxaliplatino (Fig. 6A, B).
(a), los tumores subcutáneos derivados de 2 × 10
27 5-HGC tumorsphere células cultivadas en ratones desnudos 4 semanas después de ip el tratamiento con PBS o oxaliplatino en combinación con 10 mM tomatidina control en el flanco trasero izquierdo alrededor del tumor, u oxaliplatino en combinación con 10μM ciclopamina en el flanco trasero derecho alrededor del tumor, u oxaliplatino en combinación con 10 ug /ml de 5E1 a la derecha flanco trasero. Tom = tomatidina, Cic = ciclopamina, Ox = oxaliplatino. células de las CT = tumorsphere. tamaño (B) Tumor derivado como en (A) después de 20 días. Tom = tomatidina, Cic = ciclopamina, Ox = oxaliplatino.
Estos datos sugieren que aunque los fármacos quimioterapéuticos estándar retraso excrecencia tumoral durante el tratamiento, cuando se combinaron con ciclopamina o 5E1, la eficacia de la quimioterapia era significativamente mejorada y también más sostenida después de la interrupción del tratamiento.
a continuación, para investigar si el bloqueo de la vía SHH in vivo tuvo un efecto específico sobre HGC-27 tumorsphere células. Los ratones fueron solamente ciclopamina tratados en el flanco trasero derecho o tomatidina control en el flanco trasero izquierdo (dos veces por semana durante 3 semanas) cuando los tumores de 27-HGC tumorsphere células alcanzaron aproximadamente 2 mm, después de 3 semanas, se realizó un ensayo de dilución limitante para esferoides formación utilizando células tumorales tratadas con ciclopamina y tratados con tomatidina, respectivamente. Como se muestra en la Tabla S2, aproximadamente el 9-15% de las células de tumor xenotransplantado tratados con tomatidina podría producir esferoides, mientras que menos del 2,5% de las células de tumor xenotransplantado tratado con ciclopamina podría generar esferoides. Por lo tanto, el bloqueo de la vía SHH in vivo podría reducir el número de CSLCs gástricos.
6. vía SHH mantiene las características CSLCs gástricos de tumorsphere células de muestras de tumores primarios
Para determinar si la vía SHH podrían estar involucrados en las características CSC gástricos de tumorsphere células de tejido de cáncer gástrico, hemos utilizado muestras de cáncer gástrico primario para analizar el aspectos funcionales de la vía SHH en CSLCs gástrico.
células granel en primer lugar, creció recién disociada de especímenes de cáncer gástrico en medio libre de suero se describe en la sección de métodos, después de 10 días, se observaron tumorspheres (Fig. 7A, SEGUNDO). A continuación, se investigó la quimio-resistencia y la capacidad de las células tumorigénicas tumorsphere de tejido de cáncer gástrico. Los resultados mostraron que las células de tejido tumorsphere cáncer gástrico demostraron significativamente mayor resistencia a los fármacos que las células a granel en las mismas condiciones (Fig. 7C). Por otra parte, las células granel recién disociadas a partir de muestras de cáncer gástrico inyectados a 2 × 10
7 células por ratón fueron capaces de establecer tumores subcutáneos, mientras que tan sólo podían formar 2 × 10
4 de las células tumorsphere de especímenes de cáncer gástrico tumores (Tabla 1), los tumores xenoinjertos resultantes de la inyección de células tumorsphere presentan las mismas características de histopatología como sus respectivos tumor humano (Fig. 7F). Estos resultados mostraron que tumorsphere células de tejido de cáncer gástrico poseían las características de CSLCs. A continuación, se observó el efecto de bloqueo de vía de SHH en la quimiorresistencia de tumorsphere células en respuesta vitro y tumor a los fármacos in vivo. Los resultados mostraron que la ciclopamina o 5E1 pudo dieron como resultado una tasa global de muerte celular mejorado significativamente (Fig. 7D) y la respuesta del tumor a la droga (Fig. 7E).
(A, B) Tumorspheres de espécimen de cáncer gástrico formado después de 2 semanas más tarde. Bares = 1000 m. (C) Efecto de las 48 horas de exposición de las células tumorsphere (barras blancas) y células granel (barras negras) a 1000 fármaco quimioterapéutico M. Ox = oxaliplatino, Mi = mitomysin. * = P & lt; 0,05. viabilidad (D) de la célula se analizó en tumorsphere células de la muestra de cáncer gástrico después de la exposición a la ciclopamina o 5E1 con diferentes fármacos durante 48 horas. El grupo de control es PBS. Cic = ciclopamina, Ox = oxaliplatino, Mi = mitomysin. (E) Los tumores subcutáneos derivados de 2 × 10
5 tumorsphere células procedentes de muestras de cáncer gástrico después de administración i.p. el tratamiento con PBS o el oxaliplatino en combinación con 10μM tomatidina control en el flanco trasero izquierdo alrededor del tumor, o el oxaliplatino en combinación con 10μM ciclopamina en el flanco trasero derecho alrededor del tumor. Tom = tomatidina, Cic = ciclopamina, Ox = oxaliplatino. células de las CT = tumorsphere. (F) H & amp; E análisis de tinción de tumor humano y xenoinjertos derivados de tumorsphere células. Barra = 100 micras.
Discusión
Los CCC comparten muchas características con las células madre de tejido, tales como la auto-renovación, la proliferación, la quimio-resistencia, y son los principales responsables de mantener el crecimiento de los tumores [27], [28]. Muchos investigadores han utilizado fluorescencia de células activadas por la clasificación para identificar y aislar células madre cancerosas y determinado que estas células pueden formar esferas en medio libre de suero especializada. En este estudio, tomamos el enfoque opuesto mediante el desarrollo de las células tumorsphere y luego determinar si estas células adquieren características CSC.
Se utilizó un medio libre de suero definido que consiste en EGF, FGF-2, B-27 y complemento N-2 suplemento para mantener líneas celulares de cáncer gástrico. Estas condiciones se habían utilizado antes para mantener endógenos madre /progenitoras neurales y células madre tumorales de tumores humanos y líneas de células tumorales. Por ejemplo, Kondo et al. [24] caracteriza la línea celular de tumor C6 de rata in vitro e in vivo y observó una pequeña población de células madre como derivados de la población lado bien caracterizado. Setoguchi et al. [29] demostraron el potencial de células madre, como el cáncer en otras líneas celulares de cáncer, incluyendo la línea MCF7 cáncer de mama, neuroblastoma B104, y adenocarcinoma HeLa.
En nuestro experimento, se utilizaron tres líneas celulares de cáncer gástrico (HGC- 27, MKN-45 y MGC-803) para tumorspheres de cultivo. HGC-27 línea celular se estableció por cultivo del ganglio linfático metastásico de un paciente diagnosticado histológico de cáncer gástrico como carcinoma indiferenciado. MKN-45 se estableció a partir del adenocarcinoma pobremente diferenciado del estómago de una mujer de 62 años de edad. MGC-803 es una línea de epitelio gástrico humano pobremente diferenciado de células muco-adenocarcinoma de un hombre de 74 años de edad.
Dos enfoques diferentes han sido normalmente utilizado para identificar células madre cancerosas en los estudios publicados [30], [31] . Uno de ellos es un método in vitro denominado "formación de colonias esferoide", y otro es el método vivo que implica la implantación de células madre cancerosas candidatos bajo la piel de ratones inmunodeficientes en.
El primer método consiste en el cultivo de células madre cancerosas candidatos en placas de cultivo con un recubrimiento especial para fijación noncell con medio libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de fibroblastos básico. El crecimiento de las colonias esféricas después de unas semanas se considera indicativo de la capacidad de auto-renovación, y sería coherente con un fenotipo CSC. Este último método de crecimiento de células en ratones inmunodeficientes-es necesaria para demostrar la verdadera tumorigenicidad y generalmente es considerado como el estándar de oro para probar la existencia de células madre cancerosas. Un número de estudios han sugerido que estos dos enfoques generalmente proporcionan resultados similares en la evaluación de los CAC candidatos para muchos tumores sólidos.
En la actualidad, células madre cancerosas gástricas tienen los fabricantes de superficie no específicos, por lo que, desarrollamos tumorsphere células y luego determinar si estas células adquiridas características CSC, incluyendo la capacidad de auto-renovación, la quimio-resistencia y la capacidad tumorigénico.
Nuestros datos muestran que las líneas celulares de cáncer gástrico (HGC-27, MGC-803, MKN-45) obtenidas en un suero definido medio libre podría formar tumorspheres que contenían células que se comportan como CSLCs. In vitro, tumorsphere células mostraron una mayor capacidad para formar colonias en agar suave en condiciones independientes de anclaje y una mayor capacidad para formar sub-tumorspheres. También puso de manifiesto que la capacidad de auto-renovación para formar sub-tumorspheres de 27-HGC tumorsphere células tenido un aumento en los pasajes 2 al 8 (de 44,5% a 70,5%), y luego se mantiene una proporción relativamente estable después de 8 o más pasajes cuando cultivan a una densidad clonal (Fig. S3). Estos datos sugirieron que el potencial proliferativo de células tumorsphere se mantuvo después de pasajes extendidos. Además, tumorsphere células in vitro eran más resistentes a oxaliplatino y mitomicina en comparación con las células adherentes, estos datos sugieren que las células tumorsphere consisten en números enriquecidas de CSLCs, que potencialmente hacen menos susceptibles a las acciones tanto Oxaliplatino y mitomicina. In vivo, tumorsphere células podrían generar tumores sobre los xenotrasplantes a una velocidad mayor que las células adherentes. Por otra parte, tumorsphere células generan tumores subcutáneos con volumen más grande y el tiempo más corto en comparación con los generados a partir de células adherentes, de manera importante, tumorspheres podrían ser re-derivan de los tumores xenotransplantados, y podrían formar tumor de nuevo, estos datos sugieren que tumorspheres fueron enriquecidos en CSLCs .
En nuestro estudio, las células adherentes presumiblemente contenía un porcentaje relativamente bajo de células madre cancerosas, ya que no se utilizó ningún método para el aislamiento o la eliminación de estas células. Se puede argumentar que es esta pequeña población de células madre cancerosas que se encarga de la formación de tumores. De todos modos, más células madre cancerosas fueron evidentes en las células tumorsphere, lo que puede explicar su comportamiento más agresivo.
A continuación, se investigó si las características de CSLCs en tumorspheres fueron mantenidos por la activación anormal de la vía SHH. En primer lugar, hemos demostrado que los niveles de expresión de ARNm de moléculas relacionadas con la vía de SHH-(Shh, Ptch y Gli1) fueron significativamente mayores en tumorsphere células que en las células adherentes, mientras que Gli2 se expresó tanto en las células de alta. Además, examinó los niveles de expresión de Shh genes diana vía (Ptch y Gli1) por Western blot y cuantitativa en tiempo real PCR, los resultados fueron similares a los de RT-PCR. En segundo lugar, la inhibición de la actividad de la vía SHH mediante ciclopamina o 5E1 llevó a la disminución de la capacidad de auto-renovación y aumento de la sensibilidad a los medicamentos en HGC-27 tumorsphere células, pero estos efectos no fueron declarados en las células adherentes. In vivo, en todos los ratones tratados, los tumores tratados con oxaliplatino fueron significativamente más pequeños que los no tratados con oxaliplatino, después del tratamiento con ciclopamina o 5E1, se mejoró la respuesta del tumor a los fármacos quimioterapéuticos. Estos datos sugirieron que aunque los fármacos quimioterapéuticos estándar retraso consecuencia tumor durante el tratamiento, cuando se combinaron con ciclopamina, la eficacia de la quimioterapia fue significativamente mayor y más sostenida también después de la interrupción del tratamiento.
Finalmente, hemos utilizado el cáncer gástrico primario muestras para analizar los aspectos funcionales de la vía SHH en CSLCs gástricos. Los resultados mostraron que las células de la muestra tumorsphere cáncer gástrico también tuvieron la quimio-resistencia y la capacidad tumorigénico, por otra parte bloqueo vía SHH reducido la quimio-resistencia de tumorsphere células y la respuesta del tumor a los fármacos mejorada in vivo.
En cuanto a la quimio-resistencia, varias características de células madre cancerosas puede que sean difíciles de eliminar. Los CSC son relativamente quiescente y esto les permite escapar de regímenes quimioterapéuticos que por lo general se dirigen a las células activamente en bicicleta. Por otra parte, como se muestra por su contraparte normal, se han propuesto los CAC para exhibir la expresión de alto nivel de genes de la familia a múltiples fármacos transportador, probablemente como resultado de flujo de salida más eficiente de los fármacos quimioterapéuticos y de la resistencia a múltiples fármacos innata, además, vías de señalización, tales como Wnt, Hedgehog o Notch, se desregula en células madre cancerosas que conducen al desarrollo de tumores. El desarrollo de un enfoque terapéutico eficaz sería por lo tanto requieren la identificación de las vías moleculares distintivas activos en células madre cancerosas y la identificación de agentes que pueden bloquear la proliferación CSC o inducir la diferenciación de CSC, mejorando así la sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos. Por lo tanto, los factores importantes que afectan a la quimio-resistencia de las células madre cancerosas son factores intrínsecos.