Extracto
El cáncer de ovario es la causa principal de muerte entre los cánceres ginecológicos y es la quinta causa principal de las muertes por cáncer entre las mujeres. El desarrollo de nuevas dianas moleculares tanto, es importante para muchos pacientes. Recientemente, el SOX2 factor de transcripción relacionados con SRY Se ha informado ampliamente de participar en múltiples enfermedades patofisiológicas, incluyendo el mantenimiento de las características de células madre y la carcinogénesis. Hasta ahora, SOX2 ha demostrado principalmente para promover el desarrollo de cáncer, aunque también se ha informado de sus funciones inhibidoras en el cáncer. Sin embargo, el papel de SOX2 en cáncer de ovario es en gran parte desconocida. En el presente estudio, se detectó la expresión de Sox2 en 64 tejidos humanos serosas carcinoma de ovario (SOC) y par de especímenes correspondientes metastásicos mediante inmunohistoquímica. Los resultados mostraron que la expresión de Sox2 en tumores primarios es mucho menor que la de las lesiones metastásicas correspondientes. Hemos encontrado además que la sobreexpresión SOX2 promueve la proliferación, la migración y la invasión, mientras que la inhibición capacidades de adherencia de células COS. Finalmente, encontramos que SOX2 se dirige a Src quinasa, una tirosina quinasa no receptor que regula la migración celular, la invasión y la adherencia en las células COS. En conjunto, estos resultados sugieren que la Src quinasa es una molécula clave en la migración SOX2 mediada e invasión de células SOC
Visto:. Wang X, Ji X, Chen J, Yan D, Zhang Z, Wang Q, et Alabama. (2014) Sox2 Mejora la migración y la invasión de las células del cáncer de ovario a través de la quinasa Src. PLoS ONE 9 (6): e99594. doi: 10.1371 /journal.pone.0099594
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Febrero 2014; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 17 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF Nº 81272883, Nº 81020108027 y Nº 81172478). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ováricos cuentas de cáncer epitelial de 80-90% de todos los cánceres de ovario y es la principal causa de muerte entre los tumores malignos ginecológicos [1]. Debido a la falta de síntomas tempranos, carcinoma de ovario se diagnostica normalmente en una fase metastásica avanzada. metástasis generalizadas son las principales causas de mal pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario. Aunque la supervivencia ha aumentado ligeramente en los últimos 25 años, las tasas de supervivencia a cinco años se mantienen por debajo del 50% [1]. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos de metástasis de cáncer de ovario ha sido un foco de todo el mundo.
Sox2, un miembro de la familia de la alta movilidad de grupo relacionadas con el SRY, se encontró inicialmente para mantener la pluripotencia de células madre embrionarias [2] . Más recientemente, se demostró SOX2 estar involucrado en una serie de tumores malignos. Numerosos estudios han demostrado que SOX2 promueve la proliferación celular, la migración, invasión y metástasis de tumores en varios tipos de tumores tales como glioblastomas [3], el cáncer colorrectal [4], cáncer de próstata [5], cáncer de mama [6], [7] y osteosarcomas [8]. Por otra parte, los altos niveles de expresión de Sox2 se correlacionan con la progresión del tumor o mal pronóstico de varios cánceres. En contraste, se informó también el papel de tumor supresor de Sox2 en el cáncer gástrico [9], y el cáncer de pulmón de células escamosas [10]
.
Recientemente, varios estudios han encontrado que la expresión de Sox2 es significativamente mayor en el cáncer de ovario tejidos en comparación con los tejidos normales de ovario mediante inmunohistoquímica [11], [12]. El análisis multivariado demostró además que la sobreexpresión Sox2 es un factor de mal pronóstico en el cáncer de ovario [13], [14]. Estos resultados sugirieron que SOX2 podría actuar como un gen promotor de tumores en el cáncer de ovario. Sin embargo, los roles funcionales y mecanismos precisos son todavía difícil de alcanzar en el cáncer de ovario. Para aclarar el papel y los mecanismos subyacentes de Sox2 en el cáncer epitelial de los ovarios, se analizó la expresión de Sox2 en el carcinoma de ovario seroso (SOC) y tejidos metastásicos emparejados, así como en líneas celulares de COS. Por otra parte, se analizó el efecto del gen Sox2 en las capacidades de proliferación, migración y adhesión de células COS.
Materiales y Métodos
muestras SOC Humanos e información clínica
SOC primarios y metastásicos tejidos emparejados (epiplón) se obtuvieron del Departamento de Anatomía Patológica del hospital de las primeras personas de Shanghai. El uso de las muestras fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Humana del Hospital de la primera gente de Afiliado Universidad de Shanghai Jiao Tong. Todas estas muestras se obtuvieron con consentimiento informado por escrito. Las muestras específicos utilizados en este estudio se han descrito en la publicación anterior [15]. En total 64 cystadenocarcinoma serosa con metástasis en el epiplón (fase III) fueron estudiados. La edad de los pacientes con cáncer de ovario varió de 34 a 81 años (mediana de 61,2). Hay 55 casos con la menopausia. Las muestras de tejido de formaldehído-fijos y embebidos en parafina de 64 casos de SOC se recogieron entre enero de 2003 y diciembre de 2010. Se excluyeron los pacientes con radiación o quimioterapia previa. diagnóstico patológico de las lesiones de ovario fueron realizadas por dos patólogos ginecológicos utilizando la clasificación de la Organización Mundial de la Salud.
inmunohistoquímica (IHC) tinción y evaluación
IHC análisis de expresión de la proteína Sox2 se llevó a cabo como antes descrito. Brevemente, se detectó la expresión de Sox2 usando un SOX2 anti-humano monoclonal de conejo (Cell Signal Technology, Danvers, MA, EE.UU.). Las secciones se incubaron con anti-SOX2 (1:100 de dilución) en una cámara de humedad durante 2 horas seguido de una incubación de 60 min con un anticuerpo secundario biotinilado. El porcentaje de células teñidas positivamente como la intensidad de la tinción en estas diapositivas fueron evaluados en una forma ciega. Las células positivas fueron indicados por la presencia de tinción marrón tanto en el núcleo y el citoplasma. resultados IHC se evaluaron bajo un microscopio de luz y se puntuaron como sigue: 0 & lt; 5% de células positivas; En 5 hasta 25% de células positivas; 2 26-75% de células positivas; y 3 & gt; 76% de células positivas. la intensidad de la mancha se anotó como: 0, sin manchas; 1, leve-amarillo; 2, de color marrón-amarillo; y 3, de color marrón oscuro. El nivel de expresión (además de las dos puntuaciones) fue clasificada como: - (0), + (1-2), ++ (3-4), y +++ (5-6). Las puntuaciones ≥ 3 se definieron como una expresión de alto nivel y anota & lt; 3 se define como la expresión de bajo nivel. Individuales resultados de IHC para cada caso se utilizaron para el análisis estadístico. Todas las diapositivas IHC fueron revisados de forma independiente por dos investigadores.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer de ovario Hey, HO8910 y HO8910-pm se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en base a las directrices del repositorio. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) /F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Las líneas celulares MCV152 y Moody fueron amablemente proporcionados por el Dr. Zheng Wenxin (Universidad de Arizona, Tucson, AZ, EE.UU.). SKOV3 se adquirieron en el Colegio Médico Unión de Beijing (Pekín, China). Las tres líneas celulares de SOC y HEK-293T se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, piruvato de sodio y L-glutamina a 37 ° C con 5% de CO2.
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total se extrajo usando reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad. CA. EE.UU.). ADN complementario (ADNc) se sintetizó con el kit de reactivos Prime-Script RT (Takara, Japón). Plegables inducciones se calcularon utilizando la fórmula 2- (DDCT) usando GAPDH como un gen de control interno. PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Japón). Los pares de cebadores específicos de gen fueron los siguientes: SOX2 (F) 5'-CGG CAA CCA GAA AAA CAG C-3 ', SOX2 (R) 5' TCT CCG TCT CCG ACA AAA GT-3 '; GAPDH (F) 5'-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 ', GAPDH (R) 5'-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3'
transfección transitoria de Sox2 interferente pequeño. células de ARN (siRNA) y Src siRNA
Ho8910-pm y SKOV3 se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 4 × 10
5 células /pocillo. Después de 24 h de cultivo, el medio fue reemplazado por Opti-MEM (Invitrogen) en ausencia de antibióticos y se cultivaron. siRNA correspondiente al gen fue diseñado y sintetizado por Genepharma (Shanghai, China). En total 100 pmol de siRNA se transfectaron usando 5 l de lipofectamina reactivo RNAiMax (Invitrogen). Después de la incubación durante otras 48 h, se utilizaron las células tratadas para investigar el efecto del agotamiento del gen utilizando análisis de transferencia Western o ensayos de transwell y adhesión. Las secuencias de siRNA contra SOX2 incluyen: (1) 5'-CUGCAGUACAACUCCAUGATT-3 '; (2) 5'-GGACAUGAUCAGCAUGUAUTT-3 '; (3) 5'-CCA GUU UGG UGG CGG UCAA TT-3 '. Las secuencias de siRNA contra Src incluyen: (1) 5'-CAG GAG GAG GCU UGG UAU UTT-3 '; (2) 5'-CGC UCA ACG UGA AGC ACU ATT-3 '; (3) 5'-GGC CUC UCA UUG AAG ACA ATT-3 '
Construcción de plásmidos
La secuencia ORF Sox2 se amplificó a partir del vector Sox2, que fue producido por Shanghai R & amp;. S biotecnología Co. Ltd (Shanghai, china). La integridad del ADNc se confirmó por secuenciación. La secuencia ORF SOX2 se insertó en el sitio EcoRI-BamHI del plásmido pWPXL y se ligó en el vector (un regalo de Dr. Didier Trono). La secuencia del cebador de Sox2 incluye: Sox2 (F) 5'-CGC GGA TCC ATG TAC AAC ATG ATG GAG GAG ACG C-3 '; Sox2 (R) 5'-CCG GAA TTC GAT TTA TCG CGT CGA CTC ACA TG-3 '.
Producción de lentivirus y la transducción de células
El embalaje plásmido psPAX2 y el plásmido de la cubierta pMD2.G fueron regalos de Dr. T. Didier Trono. vector pWPXL-SOX2 se cotransfectó con psPAX2 y pMD2.G en células HEK293T usando Lipofectamine2000 (Invitrogen). Los virus se cosecharon 48 h después de la transfección y se determinaron los títulos virales. Ho8910 células se infectaron con 1 x 10
6 unidades de transducción de lentivirus recombinantes en presencia de 6 mg /ml de polibreno (Sigma, MO. EE.UU.).
matriz extracelular Cell- (ECM) ensayo de adhesión
La capacidad de las células de carcinoma de ovario de adherirse a los componentes de ECM se cuantificó tal como se describe anteriormente [16]. placas de 96 pocillos se recubrieron con 1 mg /ml de Matrigel (BD, EE.UU.), fibronectina 10 mg /ml de plasma (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), 10 mg /ml de colágeno tipo I (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) , 10 mg /ml de laminina (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), o con 100 albúmina ug /ml de suero bovino (BSA; Sigma, EE.UU.), y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 4 horas a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C, a continuación, las placas se lavaron por PBS dos veces. Se añadieron las células (4,0 x 10
4cells /100 l) diluidos con DMEM a las placas de 96 pocillos recubiertos y se incubaron a 37 ° C durante 30~60 minitus en una incubadora de CO2. Las células no adherentes se eliminaron por lavado con PBS. Se analizaron las células unidas mediante un Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la densidad óptica se midió a 450 nm. Estos experimentos se realizaron por triplicado y se repitió dos veces.
Ensayos de proliferación celular
Las células se sembraron a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incuba. Se añadió una alícuota de 10 l de CCK-8 a los pocillos y se incubaron durante 2 h. La absorbancia se midió a 450 nm para calcular el número de células viables en cada pocillo. Cada medición se realizó por triplicado y los experimentos se repitió dos veces.
Para los ensayos de formación de colonias, las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 200 células por pocillo y se cultivaron a 37 ° C durante dos semanas. Al final de la incubación, las células se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con 0,1% (w /v) de violeta cristal. megascópica colonias de células se contaron usando Image-Pro Plus software 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EE.UU.). Cada medición se realizó por triplicado y los experimentos se llevó a cabo cada uno de al menos tres veces