Extracto
Estudios recientes demostraron que las células madre del cáncer (CSC) tienen mayores propiedades tumorigénesis que los de las células cancerosas diferenciadas y que el factor de transcripción
Sox2
juega un papel vital en el mantenimiento de la única propiedades de las células madre cancerosas; sin embargo, la función y el mecanismo subyacente de SOX2 en la carcinogénesis del cáncer de pulmón son todavía difícil de alcanzar. Este estudio aplica inmunohistoquímica para analizar la expresión de Sox2 en tejidos pulmonares humanos de individuos normales, así como los pacientes con adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y de células grandes y carcinoma de células pequeñas y demostró la sobreexpresión específica de SOX2 en todo tipo de tejidos de cáncer de pulmón. Este hallazgo apoya la noción de que SOX2 contribuye a la tumorigénesis de las células de cáncer de pulmón y se puede utilizar como una sonda de diagnóstico. Además, obviamente, una mayor expresión de los oncogenes c-myc
, WNT1, WNT2
, y
NOTCH1
se detectó en la población lateral (SP) células que en la población no-lateral (NSP) de las células de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549-line, dejando al descubierto un posible mecanismo para el potencial tumorigénico tenaz de los CAC. Para aclarar aún más la función de
SOX2
en la tumorigénesis de las células cancerosas, se establecieron las células A549 con la expresión de la luciferasa y la doxiciclina-inducible shRNA orientación
SOX2
. Encontramos silenciamiento de
SOX2
gen reduce la propiedad tumorigénico de las células A549 con la expresión atenuada de c-MYC, WNT1, WNT2, y NOTCH1 en ratones NOD /SCID xenoinjertados. Al utilizar el método de RNA-Seq, se revelaron un adicional de 246 genes de cáncer objetivo de SOX2. Estos resultados presentan evidencia de que Sox2 puede regular la expresión de oncogenes en células madre cancerosas para promover el desarrollo de cáncer de pulmón humano
Visto:. Chen S, Xu Y, Chen Y, Li X, W Mou, Wang L, et Alabama. (2012)
Sox2
gen regula la Red transcripcional de oncogenes y afecta Tumorigénesis de células cancerosas de pulmón humano. PLoS ONE 7 (5): e36326. doi: 10.1371 /journal.pone.0036326
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 20 Septiembre, 2011; Aceptado: March 30, 2012; Publicado: 15 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de China, conceder 31000616 (NL), China profesorado novel fondos de la subvención 20090031120044 (a NL) de China Fondos de investigación fundamental para las Universidades central de conceder 65011241 (NL), la Fundación Nacional de Ciencias de China, subvención 30830096 (de RX ), Programa de Desarrollo de la Investigación básica del Estado Mayor de China (China, 973 de programa) 2007CB914804 (a RX), Proyecto de Apoyo de Tianjin Ciencia & amp; Comisión tecnológica para 973 Programa 08QTPTJC28700 (a RX), y el Proyecto Clave de Tianjin Ciencia & amp; Comisión tecnológica para China-Suecia Cooperación en Investigación Programa 09ZCZDSF04000 (a RX). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células madre del cáncer (CSC) representan una población muy pequeña de las células cancerosas de la que se origina tumores. Ellos poseen el mismo carácter único como las células madre embrionarias (ES), como clonogenicidad, pluripotencia y auto-renovación y por lo tanto tienen la capacidad de iniciar un tumor, mantener su crecimiento y ser responsable de la recurrencia del cáncer [1]. Estudios recientes han demostrado que los CAC como las subpoblaciones de células podrían ser aislados de diversas líneas de células tumorales cultivadas o tejidos utilizando el método de tinte de flujo de salida Hoechst33342 para separar población lateral (SP) células [2] o por clasificación de células que expresan marcadores de superficie de células madre específicas, tales como CD133 (+), CD44 (+), CD34 (+) y CD38 (+) [3] - [5] et al
el cáncer de pulmón representa la causa más común de la letalidad relacionada con el cáncer en ambos. hombres y mujeres en todo el mundo, con tasas de supervivencia muy bajo en cinco años, incluso después de la terapia clínica [6], [7]. Este tumor maligno se suele dividir en diferentes tipos histológicos de acuerdo con los fenotipos de las células de los que deriva el tumor, incluyendo carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma y carcinoma neuroendocrino, como el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), así como el cáncer de pulmón de células grandes [8]. Adenocarcinoma, SCC y el cáncer de pulmón de células grandes también se denominan colectivamente el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representa a los tipos más comunes de cáncer de pulmón con una velocidad más baja tasa de crecimiento y la propagación de las de SCLC. Entre NSCLC, adenocarcinoma periférica es el subtipo principal que representa aproximadamente el 80% de los casos en pacientes con cáncer de pulmón [9]. Varios estudios mostraron que CD133 (+), CD44 (+) y CD87 (+) se pueden utilizar como marcadores de superficie para identificar células madre cancerosas en el cáncer de pulmón [10] - [12]. Estudios recientes informaron SP aislado tanto de un modelo de tumor de ratón [13] y una variedad de líneas celulares de cáncer de pulmón mediante el método de Hoechst tinte de flujo de salida [14] - [16]. Se encontró que las células SP aisladas muestran mayores niveles de expresión de genes de células madre, como
Sox2
y
Oct4
y la tumorigénesis propiedades que las células NSP [2].
La importante función del factor de transcripción
SOX2
en el mantenimiento de las propiedades únicas de las células ES y células madre cancerosas ha sido ampliamente investigado. También se estableció que células madre pluripotentes inducidas (iPS) o cáncer pluripotentes (IPC) de las células podría ser generada por la co-transfección de
Sox2
ADNc con otros factores de transcripción como
Oct4
,
Klf4
y
c-Myc
en células de fibroblastos o de cáncer [17] - [20]. De hecho, Sox2 fue altamente expresado en células madre cancerosas aisladas, como las células, tanto en los niveles de proteína y ARNm. Amplios estudios revelaron que Sox2 regula la red transcripcional complejo para mantener las características únicas de las células madre [21] y la propiedad anti-apoptosis de las células madre cancerosas [15], [22]. En consecuencia, la orientación de SOX2 es una estrategia prometedora para la terapia de tumores. A pesar de numerosas investigaciones de los tejidos tumorales clínicamente derivados reportaron la sobreexpresión específica de Sox2 en ciertos tipos de tejidos tumorales, como los cánceres de próstata y de mama [22], [23] y se indica su importancia para la tumorigénesis, el mecanismo subyacente de la propiedad tumorigénico de
Sox2
gen sigue siendo en gran parte desconocido.
los oncogenes juegan un papel importante en el desarrollo del carcinoma. Entre ellos,
NOTCH
,
WNT
y
c-MYC ¿Cuáles son los oncogenes bien establecidos en la iniciación y progresión de las células de cáncer de pulmón. Se informó de que las proteínas de la familia WNT-WNT1, WNT2 y proteínas NOTCH -NOTCH1, NOTCH3 así como su proteína de aguas abajo HES-1 se sobreexpresa en líneas celulares de NSCLC o tejidos [24] - [31]. La sobreexpresión de estos oncogenes o la activación de sus vías de señal inducida por carcinoma de pulmón [32], [33]. Como tal, la orientación de estos genes mediante el uso de siRNA /shRNA, mutación, inhibidores específicos o anticuerpos monoclonales podrían inhibir el crecimiento del tumor e inducir la apoptosis en líneas celulares de cáncer de pulmón en modelos experimentales de ratón [4], [34] - [36]. Aparte de su importante papel en la tumorigénesis del cáncer de pulmón, estos oncogenes también formaron una red de interacción funcional. También se informó de que NOTCH1 induce la expresión de c-MYC, además, ambas proteínas regulan la expresión de genes diana mismos que participan en la regulación del crecimiento celular [37]. c-MYC también se reveló ser el blanco de abajo /β-catenina señalización y otros estudios mostraron WNT el promotor de
c-MYC
para alinearse con Wnt /β-catenina potenciadores de respuesta [38], que revela una posible mecanismo de regulación de la señalización de WNT en c-myc.
a la vista de las importantes contribuciones de Sox2 en el mantenimiento de la propiedad stemness de células madre cancerosas, que postula que Sox2 podría gobernar la red transcripcional de oncogenes que afectan a la tumorigénesis de pulmón carcinoma. Nuestros resultados demuestran que hasta el momento Sox2 regula la red transcripcional de oncogenes, incluyendo
WNT1, WNT2, NOTCH1 y c-MYC
y promueve el proceso tumoral de las células cancerosas de pulmón humano. Este estudio también apoya la noción de que la orientación de Sox2 es una estrategia eficaz para el tratamiento del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo estrictamente bajo la directrices sobre animales de laboratorio de la Universidad de Nankai y fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Instituto de la Universidad de Nankai (número de permiso: 10011). Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de oxígeno /isoflurano antes de cada experimento y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar su sufrimiento. Para las muestras de humanos, los microarrays de tejidos de alta densidad comercializados fueron comprados y el uso de tejido humano en este estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la Universidad de Nankai.
Construcción del vector
secuencia de shRNA para silenciar humana
Sox2
gen fue registrado y abatidas utilizando RNAi diseñador del sitio web de Invitrogen (https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp). Una shRNA orientación SOX2 humano fue diseñado y sintetizado químicamente como shRNA-SOX2 (AAAAGGGACATGAT CAGCATGTATTGGATCCAATACATGCTGATCATGTCCC), y se utilizó una secuencia revueltos (AAAAGCTACACTATCGAGCAATTTTGGATCCAAAATTGCTCGATAGTGTAGC) como control para el análisis de caída. Los oligonucleótidos de ADN palindromic fueron recocidos entre sí para formar un oligo de doble cadena y se ligaron a la linealizado PLV-H1TetO-GFP-BSD (Cat#ORDENAR-C03, Biosettia Inc., San Diego, CA) y PLV-H1-EF1α -puro (Cat#ORDENAR-B19, Biosettia Inc., San Diego, CA) de vectores que generan un círculo pLV-H1TetO-shRNA-Sox2-GFP-BSD y el plásmido pLV-H1-EF1α-shRNA-Sox2-puro separado. El ADNc resistentes a la puromicina a partir del plásmido PLV-H1-EF1α-shRNA-Sox2-puro fue cortado por la enzima Nhe Ι Ι y Sal para reemplazar el fragmento GFP-BSD en PLV-H1TetO-shRNA-Sox2-GFP-BSD para generar el pLV- H1TetO-shRNA-Sox2-puro plásmido.
Cell Cultura y
tipos salvaje (WT) de las células A549 y H460 se obtuvieron a partir de ATCC. células A549-WT fueron infectadas con lentivirus que codifica la luciferasa de luciérnaga (FL) gen (Cat.#GlowCell-14b-1, Biosettia, SanDiego, CA) y seleccionados por 10 mg /ml Blasticidin (BSD) para generar células A549 con sobreexpresión estable de FL (A549-FL). A549-WT, H460-WT y A549-FL células fueron infectadas con lentivirus que lleva PLV-H1TetO-shRNA-SOX2-puro plásmido (Biosettia, SanDiego, CA), seguido de la selección clonal utilizando puromicina (10 mg /ml para A549 y 2 g /ml de H460) para generar una polyclone de A549, H460 o células A549-FL con expresión estable de Dox inducible shRNA-Sox2 (A549-H1tetO-shRNA-Sox2, H460-H1tetO-shRNA-Sox2 o A549-FL /H1tetO -shRNA-SOX2). células A549 y H460 se mantuvieron en F12K y medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% en presencia de 100 u /ml de penicilina y 0,1 mg /ml de estreptomicina por separado. A efectos de control, A549-WT, H460-Wt y A549-FL fueron infectadas con lentivirus que lleva revueltos shRNA y se somete a procedimientos de selección de clon idénticos para generar las líneas celulares de control estable A549-H1tetO-shRNA-Con, H460-H1tetO-shRNA- con y A549-FL /H1tetO-shRNA-con.
inmunohistoquímica y del tejido microarrays
La expresión de Sox2 en microarrays de tejidos de alta densidad (Cat.#BC04119b, LC727, LC2085b , LC2161, Alenabio, Xian, china PR) se detectó por el método de biotina-avidina-compleja serie con anticuerpo monoclonal de ratón contra Sox2 (Cat.#ab75485, Abcam Inc, Cambridge, Reino Unido) a una dilución 1:200. Las imágenes fueron grabadas por Olympus BX51 microscopía de epi-fluorescencia bajo un objetivo × 10 o 40 × (Olympus Co. Tokio, Japón).
Análisis y citometría de flujo Ordenando
A549- se recogieron las células WT y se resuspendieron en DMEM precalentado + tampón (DMEM con 2% de FBS y tampón HEPES 10 mM) a una densidad de 1,0 x 10
6 células /ml. Hoechst 33342 tinte se añadió a una concentración final de 10 g /ml en la presencia o ausencia de 10 mM Fumitremorgina C (FTC). Las muestras de células se colocaron en un baño de agua C 37 ° durante 60 minutos (min) y se mezclaron cada 10 min. Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón frío HBSS + (solución salina equilibrada de Hanks con 2% de FBS y tampón HEPES 10 mM). Al final del periodo de tinción, las células se resuspendieron en tampón frío HBSS + que contiene 2 mg /ml de yoduro de propidio (PI) para la discriminación de células muertas. El colorante Hoechst se entusiasma con un láser UV a 355 nm, y su fluorescencia se mide con un filtro de 460/50 BP (Hoechst azul) y un filtro de 670/30 BP (Hoechst rojo).
RT -PCR y en tiempo real RT-PCR
total ARNm a partir de células A549 fueron aislados por el reactivo TRIzol (Cat.#15596-018, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) y transcrito de forma inversa en ADNc con transcriptasa inversa MMLV (Promega, Madison, MI). Después de esto, semi-cuantitativo de RT-PCR se realizó para detectar los niveles de expresión de ARNm de
NOTCH1
,
WNT1
,
WNT2
,
c-myc
,
Sox2
,
Oct4
,
NANOG
,
ABCB1
y
ABCG2
. Para un control de carga igual, el ARNm de humano
β-actina
se puso a prueba al mismo tiempo. Los cebadores usados para ambos experimentos se resumen en la Tabla 1. El tiempo real RT-PCR se realizó en Opticon (Bio-Rad, Hercules, CA) en 25 volúmenes de reacción l utilizando el kit TransStart Verde qPCR Supermix (TRANSGEN Biotech, Beijing, China, PR ). Se utilizó el método 2
-ΔΔCt para determinar los cambios de ARNm de plegado relativos. Los resultados estadísticos fueron en promedio de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
La tinción representativa de Sox2 en estos tejidos se sometieron por separado a la microscopía imágenes bajo 10 × (A) y 40 × objetivo (B).
Western Blotting
lisados celulares de A549 y líneas de células H460 se prepararon con tampón de RIPA, en presencia de un cóctel de inhibidor de proteasa como se describe anteriormente [22]. Proteínas (20 g) se cargó en 5-12% de geles de Tris-acrilamida y borró con anticuerpos que incluían: policlonal anti-Sox2, WNT2 (Cat#sc-20088, sc-50361, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz. , CA), WNT1 (Cat.#ab85060, Abcam Inc, Cambridge, Reino Unido), monoclonal anti-NOTCH1 (Cat.#3608, señal celular Technology Inc, Danvers, MA), c-myc, β-actina (Cat.#SC-40, SC-47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA), y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. resultados blotting se detectaron mediante un kit de quimioluminiscencia ECL (Millipore, Billerica, MA).
A. Se detectaron células SP en A549 y se separaron por FACS utilizando el método del colorante flujo de salida Hoechst33342 (izquierda) y verificados por su falta de flujo de salida este tinte después de la incubación con la FTC, un inhibidor específico de múltiples fármacos transportador ABCG2-(derecha). Esta cifra representa 1 de 3 experimentos. Los niveles de mRNA expresión de oncogenes y genes de células de tallo se compararon entre el SP y células NSP mediante el uso de semi-cuantitativa de RT-PCR en tiempo real RT-PCR en B y C por separado, n = 3. Los resultados de transferencia Western de D. WNT1 , WNT2, NOTCH1, c-myc y SOX2 proteínas en SP y NSP de las células A549.
xenoinjertos de tumores
NOD Hombre /ratones SCID a las 6-8 semanas de edad fueron separados al azar en dos grupos (n = 5 para cada grupo). 1 × 10
6 A549-FL /células /H1tetO-shRNA-SOX2 A549-FL-H1tetO shRNA-Con o se xenoinjertado en cada ratón mediante inyección en vena de cola. Todos los ratones fueron alimentados con 0,2 mg /ml de Dox más 0,05% de sacarosa en el agua de bebida desde el primer día después de la inoculación.
A. Las células A549-H1tetO-shRNA-SOX2 y de control se incubaron con Dox durante 4 días y silenciamiento de
Sox2
gen fue confirmada por Western Blot. B. Análisis FACS de la SP en células A549 con o sin
Sox2
silenciamiento. Las células SP en A549 fueron confirmados por su capacidad de flujo de salida Hoechst 33342 en ausencia de FTC (hasta el panel, FTC), pero no para el tinte flujo de salida después de la incubación con FTC (bajo el panel, FTC +). C. El porcentaje de SP en células A549 de cada grupo de experimento se promedió a partir de tres experimentos independientes y se representó gráficamente. D. Real-time RT-PCR se utilizó para comparar los niveles de expresión de mRNA de los oncogenes en la línea celular A549 con o sin baja regulación de Sox2, n = 3. E. niveles de expresión de proteínas de
WNT1
,
WNT2
,
NOTCH1
y
c-MYC
genes fueron detectados en las células A549 y H460 con
Sox2
silenciamiento por Western Blot.
imagen bioluminiscente
Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de oxígeno /isoflurano y recibieron luciferina (Cat.#119222, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) ip a /g de peso corporal de 150 g. señales bioluminiscentes se midieron 10 minutos más tarde con un sistema de imágenes IVIS 100 y cuantificados con el software de imagen viva (Xenogen, Alameda, CA).
A. Se inyectaron células A549 a través de la vena de la cola en ratones NOD /SCID y se tomaron las imágenes de bioluminiscencia de tumor xenoinjertado en los tiempos indicados. B. La bioluminiscencia intensidad se mide y se representa, n = 5. tinción HE C se utilizó para detectar tumores xenoinjertados en los tejidos pulmonares de los ratones NOD /SCID xenoinjerto. D. La inmunohistoquímica tinción de SOX2, c-MYC, NOTCH1 y WNT1 (todo se muestra en color marrón) de los tejidos pulmonares de los ratones NOD /SCID xenoinjertado en situ. E. La inmunofluorescencia de WNT2 (verde) en los tejidos del pulmón murino xenotransplantes. Todas las imágenes de microscopía se registraron en un objetivo de 40 aumentos. Las cifras en C, D y E representan 1 de 5 experimentos. Las regiones del tumor en C, D y E fueron distribuidas por líneas de trazos.
RNA-Seq
El A549-H1tetO-shRNA-Sox2 y sus células de control se recogieron después de estar se incubaron con Dox durante 4 días. 4 g de ARN total de cada muestra se extrajo por el reactivo TRIzol. Oligo (dT) perlas magnéticas método de adsorción se utiliza para purificar ARNm, sus datos transcriptoma se perfila y se compara siguiendo protocolos estándar (expresión génica digital, DGE, de 3 millones de lecturas, Instituto de Genómica de Beijing en Shenzhen, China). Los genes del cáncer han sido seleccionados a partir de 7 bases de datos que se resumen en el sitio web: http://microb230.med.upenn.edu/protocols/cancergenes.html y los genes con tasa de falso descubrimiento (FDR) & lt; 0,001 fueron seleccionados como los genes diana de Sox2. los datos de RNA-Seq que se reúnan para Omnibus base de datos NCBI de la Expresión Génica (GEO) (GSE36597; revisor enlace de acceso: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=druvhickewcwcvy&acc=GSE36597).
Standardized Valores de TPM (transcripciones por millón etiquetas limpias) se aplicaron para comparar los niveles de otros genes del cáncer de destino de expresión entre las células A549 con
Sox2
silenciamiento (shRNA-Sox2) y su control (shRNA-Con). La transcripción de cada gen está representado por un cuadrado con un color que codifica para los valores de LG del TPM. en concreto, de color verde brillante representa una baja expresión, de color rojo brillante representa una fuerte expresión. los genes diana cuyas transcripciones están reguladas con el silenciamiento de
Sox2
se presentan en a y esos genes regulados fueron presentados en B.
Análisis estadístico
los valores se expresan como media ± SEM Importancia se determinó mediante χ
2 prueba en la Tabla 2 y la prueba hipergeométrica en la Tabla 3, los demás se determinaron mediante la prueba t de Student Un valor de
p Hotel & lt;.. 0.05 se utilizó como criterio de significación estadística * indica una diferencia significativa con
p Hotel & lt; 0,05, ** indica una diferencia significativa con
p
. & lt; 0,01
resultados
Sox2 se expresa específicamente en el cáncer de pulmón humano tejidos
para determinar si SOX2 contribuye a la tumorigénesis del cáncer de pulmón, se utilizó un método de inmunohistoquímica para detectar la expresión de Sox2 en tejidos pulmonares humanos de normal /paracarcinoma (n = 38), adenocarcinoma (n = 200), SCC (n = 150 ), SCLC (n = 36) y grandes cáncer de pulmón de células (n = 31). La correlación de SOX2 con el estado clínico de los pacientes con cáncer de pulmón se resumen en la Tabla 2. mayor parte superior expresión de Sox2 se encuentra tanto en NSCLC y SCLC que en los tejidos normales /paracarcinoma (
p
& lt; 0,001), indicando el importante papel de Sox2 en el proceso tumoral en el cáncer de pulmón. Mostraron resultados estadísticamente significativos en el número de células positivas para SOX2 se correlacionó positivamente con la edad al momento del diagnóstico (
p = 0,024
). Por otra parte, los tejidos de SCLC revelaron un mayor nivel de expresión de Sox2 que los tejidos de NSCLC (
p = 0,011
). Hubo una correlación positiva entre SOX2 y el grado patológico de adenocarcinoma humano (
p
= 0,002), indicando que SOX2 puede inhibir la diferenciación de células de adenocarcinoma. De los resultados de la tinción inmunohistoquímica (Fig. 1), se encuentra ya sea citosol o ambos núcleos y localización citosol de SOX2 en las células cancerosas, lo que era consistente con nuestros hallazgos anteriores en células de cáncer de próstata humano [22]. Además, la mayoría de los tejidos tumorales con alto nivel de expresión de Sox2 mostraron localización tanto nuclear y citosol de SOX2; Por el contrario, los tejidos con menor nivel de expresión de Sox2 siempre revela sólo la localización citosol. La correlación entre el nivel de la expresión de Sox2 y su localización fue significativa (
p Hotel & lt; 0,001); Sin embargo, no hubo una relación estadísticamente significativa entre el recuento de células cancerosas positivas Sox2 y estadios TNM o de género.
Los oncogenes WNT1, WNT2, NOTCH1 y c-MYC se sobreexpresan en ambos niveles de mRNA y proteína en las células SP del A549 Línea celular
Después de la identificación de la sobreexpresión específica de SOX2 en los tejidos tumorales de pulmón humano, la expresión de oncogenes y SOX2 bien establecidos se compararon entre SP y la población ninguno lateral (NSP) en células A549. SP células son células CSC-como que muestran propiedades tumorigénesis y quimio-resistentes más altos que los de las células NSP [39], [40]. Puesto que expresan altos niveles de expresión de miembros de la familia del transportador de unión a ATP de cassette (ABC), que ayudan a extruir el colorante Hoechst 33342 y algunos medicamentos de manera más eficaz, las células SP podrían ser aislados por el método de flujo de salida de Hoechst 33342 usando FACS. Como se muestra en la Fig. 2A, aproximadamente, 13% de las células podría ser aislado como SP por el método del colorante de flujo de salida Hoechst. Stemness de células SP aisladas fue probada por su sobreexpresión específica de
Sox2
,
Oct4, Nanog, ABCB1 Opiniones y
ABCG2
genes. Significativamente más altos niveles de expresión de
WNT1
,
WNT2
,
NOTCH1
y
c-MYC
se detectó en las células SP que los observados en las células de NSP en tanto ARNm (Fig. 2B, Fig. 2C) y los niveles de proteína (Fig. 2D), lo que sugiere el mecanismo molecular subyacente a la propiedad de alta tumorigénico de células madre cancerosas.
Sox2 regula la expresión de oncogenes en células A549 y H460
Desde
Sox2
es un importante factor de transcripción que mantiene la función de células madre cancerosas, la hipótesis de que Sox2 podría regular la transcripción de ciertos oncogenes en las células tumorales. Para probar esta afirmación, se establecieron las células A549 con la expresión estable de doxiciclina (Dox) inducible shRNA Sox2 focalización (A549-H1tetO-shRNA-Sox2). La caída inducible de SOX2 se confirmó mediante transferencia Western después de 4 días de incubación de las células A549 con Dox, y 70% de silenciamiento eficiencia de shRNA se demostró en la expresión de
SOX2
gen (Fig. 3A). Al mismo tiempo, significativo porcentaje reducido de SP en células A549 con
SOX2
silenciamiento génico fue revelado (Fig. 3B y 3C), lo que demuestra la importante función de SOX2 en el mantenimiento de las propiedades de CSC de células A549. Además, este hallazgo apoya también la contribución de SOX2 a la capacidad de la tumorigénesis de las células de cáncer de pulmón, ya que estaba bien establecido que la SP tiene mayor propiedad tumorigénesis de NSP en diversos tipos de células de cáncer de pulmón [16]. Mediante el uso de tiempo real RT-PCR y Western Blot, significativas expresiones reducidas de
WNT1
,
NOTCH1
y
c-MYC
por lo tanto mRNA y los niveles de proteína fueron mostrados en el A549 Sox2 células con baja regulación (Fig. 3D y 3E). Un fenómeno interesante observado fue que, aunque la expresión del ARNm de
WNT2
estaba ligeramente elevada sobre el silenciamiento de
Sox2
, su nivel de expresión de proteínas disminuyó, lo que indica una inhibición de la traducción de
Hoteles en WNT2 Las células A549 con
Sox2
silenciamiento. Los mismos efectos reguladores de Sox2 en la expresión de
WNT1
,
WNT2, NOTCH1
y
c-MYC
también se observó en el pulmón de células línea celular de carcinoma humano grande H460 con
Sox2
silenciamiento (fig. 3E) .Este hallazgo indica un mecanismo regulador universal de Sox2 en la red oncogén de ambas líneas de células de pulmón humano. Estos hallazgos apoyan la idea de que Sox2 puede regular la transcripción de oncogenes clave en el cáncer de pulmón para promover la tumorigénesis.
El silenciamiento de Sox2 Atenúa Tumorigénesis de células cancerosas de pulmón humano en xenotransplantes de NOD /SCID
Siguiendo la identificación de la función de SOX2 en la tumorigénesis y su efecto regulador sobre la expresión de oncogenes en células de cáncer de pulmón humano, el próximo exploró su función in vivo. Para este propósito, las células A549-FL /H1tetO-shRNA-SOX2 y de control fueron inoculadas en el ratones NOD /SCID mediante inyección en vena de cola. La presencia de células A549-FL se controló por imágenes de bioluminiscencia no invasivo. Los ratones xenoinjertados con A549-FL /H1tetO-shRNA-Sox2 y células /H1tetO-shRNA-Con A549-FL fueron alimentados con Dox través del agua potable desde el primer día después de la inoculación para inducir la expresión de shRNA. Como se observa en la Fig. 4A y 4B, la misma cantidad de señales de bioluminiscencia se pudo detectar en los ratones 1 día después de la inyección, lo que indica que el mismo número de células tumorales de pulmón quedó atrapada en los capilares pulmonares en los dos grupos experimentales. se detectó disminución posterior en señales de bioluminiscencia en los 7 días siguientes debido a un defecto en la supervivencia de células de cáncer de pulmón xenoinjertados [41]. Progresivamente crecientes señales podían ser observados en ratones xenoinjertados con células A549-FL /H1tetO-shRNA-Con después de 14 días de tratamiento, lo que indica que estas células habían tenido éxito en la vivienda y la proliferación. Veintiún días después de la exposición de las células tumorales, 5 de /H1tetO-shRNA-Con ratones xenoinjertados 5 A549-FL desarrollaron tumor, pero /ratones xenoinjertados H1tetO-shRNA-SOX2 sólo 2 de 5 A549-FL desarrollaron tumor 42 días después de la célula tumoral inicial reto. tumores de pulmón xenoinjertado en ratones NOD /SCID se confirmaron mediante tinciones eosina (HE) hematoxilina y como se muestra en la Fig. 4C. Los niveles de expresión de proteínas de
Sox2
y oncogenes en los tejidos del pulmón murino se analizaron por métodos de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Encontramos un potencial reducido la tumorigénesis de las células A549 in vivo, así como una expresión significativamente atenuada de WNT1, WNT2, NOTCH1 y c-MYC después de silenciamiento de la
SOX2
gen (Fig. 4D y la Fig. 4E). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan la propiedad tumorigénico de Sox2 y su efecto regulador sobre los oncogenes in vivo.
Sox2 Regula la red transcripcional de oncogenes
Después de haber identificado la función de Sox2 en la propiedad de la tumorigénesis las células de cáncer de pulmón y sus oncogenes diana, que después se ensayaron todos los otros genes dirigidos por la RNA-Seq y encontraron 246 genes del cáncer. Entre ellos, 74 genes (30%) fueron hasta reguladas (Fig. 5A) y 172 genes (70%) se redujeron reguladas (Fig. 5B) en las células A549 con
Sox2
silenciamiento. Nos dimos cuenta de los niveles de transcripción de
NOTCH3
y
WNT 7B ¿Cuáles son significativamente reducida, dejando al descubierto los efectos completos de Sox2 en la transcripción de
WNT
y
NOTCH
familias de genes. Además, los niveles de mRNA expresión de los oncogenes bien establecidos, tales como
KLF4
,
EGFR
,
BCL10
,
junio
,
YAP1 Opiniones y
JAK1
et al. se redujeron significativamente en comparación con las células control, pero las transcripciones de
EGF
,
RHOC
et al. se incrementaron en gran medida, lo que demuestra el mecanismo molecular complicado en el proceso de tumorigénesis de SOX2. Además, nuestro resultado RNA-Seq reveló 840 genes expresados diferencialmente (DEG) con la anotación de la vía después de
Sox2
silenciamiento en células A549. A través del análisis de enriquecimiento de los genes diana de Sox2 en la base de datos vía de señalización celular de Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG), encontramos la vía en el cáncer es una de las más enriquecido significativamente los (Tabla 3 y Fig. S1). Este resultado apoya la importante función de Sox2 en el desarrollo del tumor.
Discusión
En este estudio, hemos utilizado la inmunohistoquímica para analizar sistemáticamente la expresión de Sox2 en varios tipos de cánceres de pulmón y encontró que SOX2 se sobreexpresa predominantemente en el adenocarcinoma, SCC, carcinomas de células grandes y los tejidos de SCLC, lo que indica que SOX2 se puede utilizar como un marcador universal para el diagnóstico de cáncer de pulmón humano. Aquí también presentan evidencia que indica que Sox2 juega un papel importante en la carcinogénesis del cáncer de pulmón.
Dado que se ha establecido el concepto de CSC, muchos estudios apoyados por este concepto demostrando que células madre cancerosas o células madre cancerosas, como las células son altamente tumorigénicos [ ,,,0],dieciséis]; Sin embargo, pocos estudios se han realizado para investigar el mecanismo molecular de este fenómeno. Aquí hemos demostrado una mayor expresión de
Sox2 Opiniones y oncogenes-
NOTCH1, WNT1
,
WNT2
, así como
c-MYC Hoteles en células SP que los de las células del NSP, apoyando así una posible contribución de estos oncogenes a la propiedad stemness de células madre cancerosas.
estudios recientes han puesto de manifiesto la compleja interacción entre Sox2 y WNT vía de señalización. Por ejemplo, se informó de que SOX2 antagoniza la señalización de Wnt para inhibir la diferenciación de células madre adultas (ASC) [42] y de osteoblastos linaje [43] y mejorar la propiedad tumorigénesis y autorrenovación de osteosarcomas [44] mediante la promoción de la transcripción de regulador negativo de la señalización de WNT, como DKK1, APC y GSK3. También se informó de SOX2 a interactuado sinérgicamente con β-catenina, la molécula de aguas abajo de la vía de señalización WNT, para regular la transcripción de un gen diana para promover la proliferación celular y la tumorigénesis del cáncer de mama humano [23]. Sin embargo, como un gen de células madre importante, el mecanismo molecular subyacente de la función de Sox2 en la tumorigénesis es amplio y aún debe ser investigado intensamente. En este sentido, nuestros resultados demuestran que el silenciamiento de
Sox2 de
reduce significativamente el nivel de expresión de la proteína de oncogenes-
WNT1
,
WNT2
,
c-myc
y
NOTCH1
en el cáncer de pulmón humano y más detallado reveló otros genes del cáncer de destino de Sox2. Así, es posible que SOX2 puede cooperar con estos oncogenes importantes para promover la aparición de tumores. Un estudio reciente mostró baja regulación de
Sox2
gen inhibe la proliferación e induce la apoptosis en las células tumorales [15], [45], [46], se observó el mismo fenómeno en líneas celulares de cáncer de pulmón humano (datos no mostrados ), los que también pueden ser factores importantes que finalmente conducen al crecimiento del tumor suprimida en las células A549;