Extracto
Introducción
expresados diferencialmente (DE) genes previamente identificados comunes en el cáncer de vejiga (BC). En el presente estudio hemos analizado en profundidad, la expresión de varios grupos de estos genes DE.
Materiales y Métodos
Las muestras de 30 chalecos humanos y sus tejidos normales adyacentes fueron analizados por ADNc del genoma completo microarrays, QRT-PCR y Western Blot. Nuestra atención se centra en el control del ciclo celular y genes de reparación del ADN daños, los genes relacionados con la apoptosis, transducción de señales, la angiogénesis, así como la proliferación celular, invasión y metástasis. Cuatro conjuntos de datos disponibles al público GEO fueron analizados y los datos de expresión de los genes de interés (Góis) se compararon con los del presente estudio. También se investigó la relación entre el Gobierno de la India. IR y se realizó un análisis vía molecular para identificar KEGG posible el enriquecimiento de los genes con temas biológicos específicos.
Resultados
análisis de agrupamiento no supervisado de los datos de microarrays de ADN reveló una clara distinción en BC vs muestras de control y tumores de alto grado bajo en comparación. Los genes con expresión de al menos 2 veces diferencial en BC vs. controles, así como en no músculo invasivo vs. tumores invasivos del músculo y en tumores de bajo vs. alto grado, se identificaron y calificados. Se prestó especial atención a los cambios en la osteopontina (OPN, SPP1) expresión, debido a sus múltiples funciones biológicas. Del mismo modo, los genes que presentan igual o baja expresión en BC vs los controles fueron anotados. Significativas correlaciones por pares en la expresión génica fueron anotados. IR análisis reveló el carácter multi-faceta de la GOIS, puesto que participan en una variedad de mecanismos, incluyendo la proliferación celular, la muerte celular, el metabolismo, la forma celular, y citoesqueleto reorganización. KEGG análisis reveló que la vía más importante fue la de cáncer de vejiga (p = 1,5 × 10
-31).
Conclusiones
En el presente trabajo se suma al conocimiento actual sobre la firma molecular identificación de BC. Estas obras deben progresar con el fin de obtener más información sobre los mecanismos moleculares de la enfermedad
Visto:. Zaravinos A, Lambrou GI, Volanis D, D Delakas, Spandidos DA (2011) Primer plano de genes expresados diferencialmente en urinaria cáncer de vejiga. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10.1371 /journal.pone.0018255
Editor: I. King Jordan, Instituto de Tecnología de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Octubre, 2010; Aceptado: March 1, 2011; Publicado: 5 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Zaravinos et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de vejiga urinaria (BC) es la más común. malignidad del tracto urinario, responsables de la mortalidad y morbilidad significativa en todo el mundo. En Europa, se estima que 105.000 nuevos casos de cáncer de vejiga se diagnostican cada año, mientras que aproximadamente 30.000 pacientes mueren de cáncer de vejiga cada año [1]. Su incidencia aumenta directamente con la edad, siendo rara antes de los 50 años, y es de tres a cuatro veces más común en hombres que en mujeres. Casi todos los cánceres de vejiga son carcinomas, derivada de epitelio transicional. El comportamiento de carcinoma de células transicionales (TCC) es muy diversa y está definida por dos procesos distintos, pero relacionados entre sí: de recurrencia y progresión tumoral. En la presentación, el 75-85% de los tumores se limita a la mucosa, o invaden el
de la lámina propia de la mucosa
. El resto presentes con invasión de la capa muscular de la pared de la vejiga o se extienden al tejido perivesical, órganos adyacentes y la pared pélvica. Más del 60% de los tumores superficiales se repetirá al menos una vez y el progreso de los tumores menos diferenciados o invasivos con un peor pronóstico en un porcentaje significativo de los pacientes [2]. Los parámetros de pronóstico más útiles son el grado del tumor, el estadio, el tamaño, la tasa de recurrencia antes y la presencia sincrónica de CIS [3]. Sin embargo, una mejor comprensión de la historia natural de la CTP se puede esperar en la elucidación de los mecanismos moleculares de la CTP.
expresados diferencialmente (DE) genes previamente identificados comunes en BC urinaria [4]. En el presente estudio, nuestro interés se centra en el análisis de los diversos grupos de genes DE, como los genes implicados en el control del ciclo celular, reparación del ADN daños, apoptosis, transducción de señales, factores de transcripción, la angiogénesis, la proliferación celular, la invasión y metástasis. Exploramos el perfil de expresión en BC vs tejido sano, en no músculo-invasivo (estadio T1) frente a los tumores del músculo invasiva (estadio T2-T4), y en tumores de alto grado bajas vs. mediante el análisis de microarrays. Nuestros resultados fueron validados por inmunohistoquímica, qPCR y Western Blot. Por otra parte, se realizó un análisis computacional GEO en microarrays de datos extraídos de otras bases de datos disponibles públicamente, y los comparamos con nuestros resultados.
Nuestros resultados se centró en los genes que desempeñan un papel importante en los procesos celulares más importantes y demostró una gran diferencia en sus patrones de expresión entre las muestras de BC y de control. Los genes con expresión diferencial de al menos 2 veces en BC frente a los controles, así como en la no-invasivo del músculo frente a los tumores del músculo invasivo, y en tumores de bajo grado versus alta, fueron identificados y calificados.
Materiales y Métodos
diseño del estudio y los datos clínico-patológicos
en combinación del tumor y muestras de tejido normal a partir de una serie consecutiva de 30 pacientes con diagnóstico reciente de chalecos sometidos a resección transuretral de la vejiga en el Departamento de Urología, " Asklipieio "general hospital, Atenas, fueron adquiridos después de la cantidad de tejido necesaria para un examen rutinario de patología habían sido retirados (Tabla 1). Todas las muestras tumorales fueron clasificados y clasificados por el mismo patólogo. Los pacientes de cáncer se clasificaron en consecuencia en el músculo invasivo (T2, T3 o T4) y los tumores no invasivos (Ta, T1, y de la CEI). En forma comparativa con los informes anteriores, se utilizó la Organización Mundial de la Salud 1973 (OMS) sistema de clasificación [de bajo grado (grados 1-2) y alto grado (grado 3)] en este estudio que sigue siendo el sistema más utilizado a pesar de ser sustituida por la Sociedad de la OMS 2004 /Internacional de Patología urológica (ISUP) las clasificaciones [5]. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes incluidos en este estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Creta. Los criterios de elegibilidad utilizados fueron resecados de forma electiva chalecos primarios y la disponibilidad de ADN a partir de tejido normal y tumoral para el análisis biomoleculares. Los criterios de exclusión fueron los antecedentes de neoplasias previas y la quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía
Se obtuvieron muestras de tejido durante la cirugía del tumor y los siguientes tres sitios seleccionados macroscópicamente normal (biopsia con pinza fría):. posterior pared, trígono, y la zona adyacente al tumor. Partes de las muestras normales resecados fueron enviados para su análisis histopatológico. Tejidos tumorales y normales se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, transportados y almacenados a -80 ° C hasta la extracción de ADN.
Los pacientes con BC no músculo invasivo fueron seguidos con exámenes periódicos y cistoscópicas tratamiento intravesical como se indica. Los pacientes con BC invasivas se les ofreció la cistectomía radical con o sin quimioterapia sistémica. Después de un seguimiento medio de 24 ± 3 meses 8 (26,6%) pacientes tenían tumores recurrentes. En Ta /T1 tumores de la frecuencia de recurrencia fue del 29,4% (5/17) en comparación con el 23% (3/13) de los tumores T2-T3. En los pacientes con BC no músculo invasivo, la tasa de progresión fue de 11,1% y 22,2% para el grado 2 y tumores de grado 3, respectivamente. Todas las recurrencias fueron probados por biopsia.
La inmunohistoquímica
Secciones, de 3 mm de espesor, de fijado en formol, se cortaron tejido incluido en parafina y se coloca en portaobjetos recubiertos con 3-aminopropyltriethoxysilone. Los portaobjetos se seca a 56 ° C durante 1 h antes de la tinción inmunohistoquímica. Las secciones de tejido se desparafinaron en xileno antes de la rehidratación en alcoholes graduados, y la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó por tratamiento con 3% de H
2O
2 a temperatura ambiente durante 15 min. desenmascaramiento de antígenos se realizó por 30 min de incubación a 80 ° C en 10 mM citrato trisódico (pH 6,1). La inmunotinción y la revelación se realizaron en un automatice Dako. Los portaobjetos se incubó a temperatura ambiente con anticuerpos de cabra policlonales primarios contra anti-ErbB2 (1:800; Dako), ciclina D1 (1:100; SP4; Epitomics), anticuerpo monoclonal contra anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) y el anticuerpo monoclonal contra el anti-Ki-67 (1:100; SP6; Epitomics). Los epítopos del anticuerpo primario se localizaron por la técnica de inmunoperoxidasa usando el kit de sustrato secundario anticuerpo complejo avidina-biotina y peroxidasa (kit 5001, Dako), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones fueron tratados con Chromagen tetrahidrocloruro 30-30 diaminobencideno para identificar los sitios de inmunoprecipitación con el microscopio óptico. Por último, las secciones se lavaron, por contraste con hematoxilina y se montaron bajo cubreobjetos. No se observó tinción específica cuando el anticuerpo primario se omitió el protocolo (control negativo). La especificidad de la inmunotinción fue controlado adicionalmente por tinción simultánea de muestras de cáncer de mama con ErbB2 conocida, ciclina D1, p53 y los patrones de expresión de Ki67. Un patólogo experimentado anotó la intensidad de la tinción en cuatro niveles (negativos, débiles, moderadas y fuertes), teniendo en cuenta tanto la intensidad del color y el número de células teñidas. En breve, la puntuación proporción representó el porcentaje estimado de células tumorales positivas de colores (0 = 0%; 1 = 1%; 2 = 1 a 10%; 3 = 10 a 33%; 4 = 33-66%; 5≥ 67%), y la puntuación de intensidad representadas las profundidades de la tinción de las células tumorales (1 = débilmente positivas; 2 = moderadamente positivos;. 3 = fuertemente positiva) guía
purificación de ARN y preparación de ADNc
Se aislaron ARN total de muestras de biopsias tumorales en bruto usando un homogeneizador de potencia y el reactivo TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA), como se describe anteriormente [6], [7]. Se utilizó 2 g RNA total como material de partida para la preparación de ADNc. Se llevó a cabo el primer y segundo capítulo de síntesis de cDNA utilizando el primer capítulo de síntesis del sistema StrataScript, tal como se describe anteriormente [8].
Microarray análisis
oligos chips de micromatriz (genes) eran ~57K obtenido de GE Healthcare (IL) y AppliedMicroarrays (MA) (57K CodeLink Plenario del Genoma humano). La hibridación se realizó con el kit de amplificación de RNA y Etiquetado CodeLink, utilizando el colorante fluorescente Cy5. Las láminas fueron escaneados con un escáner de microarrays (ScanArray 4000XL). Las imágenes fueron generadas con el software de adquisición de ScanArray microarrays (GSI Lumonics, EE.UU.). ARNc de tres montajes experimentales se utilizaron en los experimentos individuales con picos internos como controles. Los montajes experimentales consistían en 10 muestras de BC urinarios de diferentes histologías (T1 /2 de grado 3, T1 de grado medio, T3 grado 3) y 5 muestras de control. Las imágenes escaneadas se procesaron con el software de Análisis de Expresión v5.0 CodeLink de Amersham Biosciences. El montaje experimental se analizó basa en el diseño de referencia como se describe anteriormente [9], [10], [11]. Todas las muestras tumorales fueron comparados contra el valor medio de las muestras de control. Corrección de fondo se realizó restando el fondo mundial mediano desde el fondo local de la mediana de la intensidad de la señal. Un umbral de 2 se estableció como de corte, lo que significa que la intensidad lugar para al menos un canal debe ser el doble que la del fondo. los datos de microarrays se normalizaron dividiendo intensidades de terreno por la mediana global. Se extrajeron los datos normalizados, pre-procesados y ordenados con Microsoft Excel®. están disponibles en la Expresión Génica Omnibus (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con los números de acceso a través GSM678186 GSM678385 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448 datos de la matriz). Además, cada gen se ensayó para determinar su importancia en la expresión diferencial usando una prueba z. Los genes fueron considerados para ser significativamente expresados diferencialmente si obtuvieron un valor de p & lt; 0,05. La Tasa de Falso Descubrimiento se calculó como se describe anteriormente [12], [13], [14]. Los genes se clasifican además siguiendo dos vías (genes, en contra de las muestras), el promedio de vinculación agrupación jerárquica con la distancia euclidiana usando el software 1.7.2 Génesis (Universidad Técnica-Graz, Austria) [15].
En tiempo real PCR validación
productos transcritos fueron sometidos a ensayo de PCR en tiempo real con SYBR Green I en un aparato controlador térmico programable Mx3000P (Stratagene, La Jolla, CA). Los pares de cebadores fueron diseñados para abarcar al menos un intrón con el fin de evitar la amplificación del ADN genómico contaminante junto con cDNA. Su secuencia y los correspondientes tamaños de los productos de PCR se listan en la Tabla S1. genes GAPDH y ACTB se utilizaron como controles internos [16].
Un microlitro de cDNA a partir de muestras normales o de TCC, respectivamente, se amplificó en una reacción de PCR con 2x Brilliant SYBR® verde QPCR Master Mix (que contiene 2,5 mM MgCl
2), 300 nM de cada cebador y 30 mM Rox colorante de referencia pasiva en un volumen final de 20 l. Después de la desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, las muestras se sometieron a 40 ciclos de amplificación que comprenden desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 60 ° C durante 30 segundos, y elongación a 72 ° C durante 30 seg. La amplificación y la elongación pasos fueron seguidos por un análisis de la curva de fusión en el que se aumentó la temperatura de 55 ° C a 95 ° C a una velocidad lineal de 0,2 ° C /seg. La recolección de datos se llevó a cabo durante tanto hibridación y extensión, con dos mediciones en cada paso y en todo momento durante el análisis de curva de fusión. Para verificar los resultados del análisis de la curva de fusión, los productos de qPCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y se fotografió en un transiluminador de luz UV (Figura S1). En cada reacción qPCR se incluyeron dos controles negativos, uno sin molde de ADNc y el otro con ningún tratamiento transcripción inversa. Todas las muestras fueron tratadas por duplicado. los niveles de transcripción de genes se calcularon utilizando el método ΔΔCt, tal como se describe anteriormente [17], [18].
Total de la extracción de proteínas y Western blot
Después de la adición de 250 l de GST enfriado con hielo tampón de lisis de pescado (10% de glicerol, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, 1% (v /v) de Nonidet P-40, MgCl 2 mM
2, y un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), las muestras de tejido homogeneizadas se centrifugaron a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C, para eliminar el material insoluble, y se recogió y se almacenó a -80 ° C. la concentración de proteína de cada muestra se determinó por el método de Bradford el sobrenadante usando un reactivo de colorante de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). las muestras se disolvieron en tampón de muestra LDS (Invitrogen) y se calentó a 70 ° C durante 7 min. cantidades iguales de las muestras (20 a 30 g) se sometieron a electroforesis en NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras (Bio-Rad Laboratories, Inc.). La membrana se sumergió en 5% de leche sin grasa o BSA, 0,1% de Tween 20 y se disolvió en solución salina para bloquear la unión no específica con Tris. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-ratón policlonal HRAS (diluido 1:1,000; Abnova, CA), monoclonal de ratón anti-CDKN2A (diluido 1:500; Abnova, CA), anti monoclonal de ratón -p53 (diluido 1:500; clon DO-7; BD Transduction Laboratories), monoclonal de ratón anti-VEGFA (diluido 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA), policlonal de conejo anti-TGFß1 (diluido 1:1000; Novus Biológicas, CO) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-OPN (diluido 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA). A continuación, las membranas se lavaron y se incubaron durante 90 min. a TA con un anticuerpo secundario que incluía de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante-anti-conejo o anti-IgG de ratón (diluido 1:1,500; Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias Western se normalizaron utilizando un anticuerpo monoclonal anti-
anticuerpo β-actina (diluido 1:5,000; Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Las señales específicas se visualizaron mediante reactivo ECL (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) después de la exposición a una película ECL. La densidad relativa de las bandas de polipéptidos detectados en la película ECL se determinó utilizando la herramienta de punto denso del software AlphaEaseFC.
GEO conjunto de datos análisis computacional
Se realizó un análisis computacional para investigar más a fondo las diferencias en la OPN, VEGFA, TGFß1, FGF2, EGFR, EGF, p14
ARF, p16
INK4A, p53, KRAS, HRAS, las ANR, ARAF, BRAF, RAF1, RKIP, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 y CyclinD1 los niveles de transcripción entre los diferentes tipos de cáncer de vejiga de la orina, su contraparte metastásico y el tejido normal relativa. Cuatro Omnibus (GEO) de datos a disposición del público la expresión génica se analizaron por esta razón, con los números de serie GEO adhesión GSE89, GSE7476, GSE3167 y GSE12630 [19], [20], [21]. Los patrones de expresión de los genes se extrajeron de los conjuntos de datos normalizados y se expresaron como valores medios del registro
2 intensidad (Tabla S2).
Gene ontología (GO) y Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG ) análisis
gene ontología (GO) y Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) análisis de vías moleculares se lleva a cabo para identificar la posible enriquecimiento de genes con temas biológicos específicos (http://www.genome.jp/kegg /pathway.html).
el análisis estadístico
Microarray datos se normalizaron por la mediana mundial de las intensidades de terreno. Cada gen se ensayó para determinar su importancia en la expresión diferencial usando una prueba z. los niveles de expresión GOI fueron evaluados por primera vez por la prueba de bondad de ajuste de una sola muestra de Kolmogorov-Smirnov, con el fin de determinar si seguían un patrón de distribución normal. La correlación de Spearman no paramétrico se utilizó para examinar par-sabia correlaciones entre los niveles de ARNm y su asociación con variables continuas (edad, el tabaquismo, tumor en estadio /grado). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para examinar el estado de la expresión de los genes con los diferentes parámetros clínico después de la estratificación. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia global como una función del tiempo. diferencias en la supervivencia se evaluaron mediante log-rank (Mantel Cox) y las pruebas de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Los valores numéricos se expresan como la media ± desviación estándar (SD), y las medianas. Los datos extraídos de las bases de datos GEO se compararon estadísticamente mediante la prueba de Mann-Whitney. La significación estadística se fijó en el nivel del 95% (p & lt; 0,05). Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).
Resultados
resultados inmunohistoquímicos
Las muestras tumorales fueron teñidas con anticuerpos para ErbB2, ciclina D1, p53 y Ki-67 (Figura 1). Si está presente, la tinción anti-ErbB2 en muestras de tumores es una tinción de membrana, difusa en el urotelio. Todas las muestras de BC (100%) mostraron inmunotinción moderada /fuerte (++, +++), mientras que no muestra BC no mostró la inmunotinción /débil (0, +) para ErbB2. Los umbrales para los altos índices de etiquetado se establecieron para Ki-67 en núcleos tumorales positivas ≥10% y para p53 en el 10 y el 20%. T1 de grado 1/2 tumores mostraron tinción débil para anti-Ki-67 (7,5% y 40%, respectivamente), mientras que T1 /2 de grado 3 tumores exhibieron la inmunotinción más fuerte (+++, & gt; 70%). Del mismo modo, T1-grado 1/2 tumores mostraron tinción débil para anti-p53 (10% y 35%, respectivamente), mientras que T1 /2 de grado 3 tumores exhibieron la inmunotinción más fuerte (53-70%). En cuanto a la ciclina D1, todos los tumores mostraron una intensa tinción de anti-ciclina D1, mientras que las de un grado superior exhibieron inmunotinción comparativamente más bajos. Para 1/2 tumores T1-grado, la tinción de anti-ciclina D1 fue del 80%; mientras que para T1 /2-tumores de grado 3 inmunotinción fue 50%.
Los tumores fueron teñidas con anti-cerbB2, anti-Ki67, anti-p53 y anti-ciclina D1. H & amp;. E, representativos diapositivas hematoxilina-eosina
microarrays de expresión y la agrupación en un 22-conjunto de genes
Hemos identificado previamente 831 genes que son expresados diferencialmente en las 10 muestras de BC, simultaneamente. De estos, 33 genes fueron regulados hacia arriba y 85 genes fueron regulados hacia abajo en todas las muestras de cáncer de vejiga en comparación con los 5 tejidos normales, al mismo tiempo (datos no mostrados). En el presente estudio, hemos realizado bidireccional-vinculación media de la agrupación jerárquica con la distancia euclidiana para un conjunto de 22 genes que incluía los siguientes genes: VEGFa, Araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, las ANR, TGFß1, AKT1 , HRAS, TIMP1, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A (p14
ARF /p16
INK4A), MMP9 y MKI67, en 10 muestras de BC vs 5 controles. Una vista detallada del dendrograma agrupación de la muestra se muestra en la Figura 2A. Se analizaron el registro
2 transformado patrón de plegado expresión del GOI y se repartió los tumores en 3 grupos principales en base a la expresión diferencial de estos 22 genes: La primera rama principio contenido T1 de grado 3, T2 de grado 3, T1 grado 2 y T3-tumores de grado 3. La segunda rama consistía en T1-T2 grado 2 y grado 3 tumores. La tercera rama consistía en tumores con carcinoma in situ, 3 T2-grado (CIS). El conjunto de 22 genes se dividió en dos grupos principales. El primer grupo estaba compuesto por genes que estaban sobreexpresados (VEGFA, ARAF, BRAF, OPN, MMP2, KRAS, las ANR, TGFß1, AKT1, HRAS y TIMP1) y el segundo grupo contenían genes que estaban igual o insuficientemente expresada (EGF , RKIP /PBP, FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A, MMP9 y MKI67) en TCC versus el tejido normal. Los niveles de expresión relativos de la GOIS en cada grupo de tumor se expresaron como una relación de los niveles de expresión normalizados del grupo de tumor a los niveles medios de los tejidos normales, que se ajustó a 1,0 (Figura 2B y en la Tabla S2).
cada fila en el diagrama representa un gen y cada columna una muestra de tumor. La saturación de color representa diferencias en la expresión génica a través de las muestras de tumor; roja indica la expresión más alta que la mediana (negro), y el verde indica la expresión más baja que la mediana. La intensidad del color indica el grado de regulación de genes (A). Doblar la expresión del Gois con respecto a la histología del tumor, como se detecta por análisis de microarrays (B).
La expresión veces (media ± DE) del Gois en cada uno de los tres grupos de tumores en comparación con el tejido normal, ya adquirido por nuestro análisis de microarrays, se muestra en la (Figura S2)
Verificación de la expresión de mRNA y proteína en relación con las características clínico-patológicas
la expresión de mRNA de los genes:. VEGFA, ARAF, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, las ANR, TGFß1, AKT1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (p14
ARF /p16
INK4A) , MMP9 se determinó mediante qPCR tanto en el cáncer de vejiga y el tejido normal (Tabla S3). Los diagramas de dispersión se construyeron para una mejor visualización de los genes que son regulados hasta (& gt; 2 veces), el regulado (& lt; 2 veces) o igualmente expresado (umbral de 2 veces la diferencia) entre AC y controles. parcelas volcán representación gráfica del log
2 del factor de cambio en la expresión de cada gen entre las muestras antes de Cristo frente a su valor p de la prueba t, también se construyeron (Figura 3).
El negro línea indica doblar cambios 1. las líneas de color rosa indican el umbral de la expresión del gen factor de cambio (2 veces la diferencia). qPCR reveló arriba y genes en el cáncer de vejiga urinaria baja regulado. El ARN total de tejidos y el cáncer de vejiga urinaria normal adyacente se caracterizaron por triplicado técnicos, y los niveles relativos de expresión de cada gen en los dos tipos de tejidos se representaron frente a la otra en el gráfico de dispersión. VEGFA, OPN, p14
INK4A, p6
CDKN2A, ANR y TGFß1 fueron reguladas, mientras que FGF2 y EGF se redujeron regulado por al menos dos veces (fuera de las líneas de color púrpura). Los genes KRAS, MMP2, AKT1, p53, EGFR, MMP9 y HRAS exhiben igual expresión entre el cáncer de vejiga y el tejido normal (A). El volcán parcela representa gráficamente el registro
2 del factor de cambio en la expresión de cada gen entre las muestras antes de Cristo frente a su valor p de la prueba t. La línea de color negro indica doblar cambios 1. Las líneas de color rosa indican el umbral de la expresión del gen factor de cambio (2 veces la diferencia). La línea azul indica el umbral para el valor p de la prueba t (0.01) (B).
Los genes de OPN, VEGFA, TGFß1, p16
INK4A, p53, y RKIP ANR fueron significativamente sobreexpresado en BC vs tejido normal (p & lt; 0,001; t-test) (Figura S3 a). Los valores de expresión de ARNm de media entre BC y el tejido normal para cada gen se muestran en la Tabla 2.
Los niveles de mRNA expresión de la p14 genes
ARF, AKT1, HRAS, ARAF, BRAF, RAF1 , MMP9, EGFR y KRAS, no difirieron significativamente entre aC y tejido de control (p & gt; 0,01; t-test). Los valores de expresión de ARNm de media entre BC y el tejido normal de cada gen, fueron los siguientes: p14
ARF, 0,0325 ± 0,0488 frente a 0,0100 ± 0,0118 (p = 0,1087); AKT1, 0,0321 ± 0,0230 frente a 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632); HRAS, 0,0015 ± 0,0021 frente a 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752); ARAF, 0.9931 ± 0.0047 vs 0.9942 ± 0.0040 (p = 0,5201); BRAF, 0,8933 ± 0,0657 frente a 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999); RAF1, 0,9348 ± 0,0527 frente a 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681); MMP9, 0,0014 ± 0,0015 frente a 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265); EGFR, 0,0078 ± 0,0073 0,0049 ± 0,0048 vs. (p = 0,0948); . KRAS, 0,0876 ± 0,0997 frente a 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035; Mann-Whitney U test) (Figura S3 B)
EGF, FGF2 y la MMP-2 exhibió significativa bajo-expresión en el tejido normal BC vs.: EGF , 0,00004 ± 0.000047 0.000151 vs. ± 0,000235 (p = 0,0017); FGF2, 0,0003 ± 0,0004 0,0023 ± 0,0019 vs. (p & lt; 0,0001); MMP2, 0,0752 ± 0,0858 frente a 0,1341 ± 0,0834 (p = 0,0007; Mann-Whitney U test) (Figura S3C)
La expresión de mRNA de los genes que exhibió excesiva, iguales o menores de expresión de acuerdo con. nuestro análisis qPCR también se investigó con relación a la etapa /grado de los tumores. Todas las diferencias estadísticamente significativas en la expresión de cada gen entre los grupos de tumores T2 /T3-grado 3, T1-T1 de grado 3 y grado 2, se representan en la Figura 4.
Grupos pares se compararon estadísticamente mediante la prueba de Mann -Whitney U test. Las barras representan los valores medios (A). Diagrama de dispersión que representa los niveles de mRNA de los genes que se expresan en partes iguales entre los cánceres de vejiga urinaria de varias etapas /grado, y el tejido normal. Grupos pares se compararon estadísticamente mediante la prueba de Mann-Whitney. Las barras representan los valores de la mediana (B). Diagrama de dispersión que representa los niveles de mRNA de los genes que estaban bajo-se expresa en varios tipos de cáncer de vejiga urinaria de diferentes etapas /grado, en comparación con el tejido normal. pares de grupos se compararon estadísticamente mediante la prueba de Mann-Whitney. Las barras representan los valores de la mediana (C).
La expresión de OPN (SPP1), TGFß1, VEGFA, CDKN2A (p14
ARF /p16
INK4A), HRA y los TP53, era también verificada a nivel de proteínas, por análisis densitométrico de las transferencias de Western (Figura 5). Los niveles de proteína normalizado en BC vs. el tejido normal fueron las siguientes: OPN, 0,645 ± 0,287 vs. 0,261 ± 0,020 (p = 0,0286); TGFß1, 0,837 ± 0,114 frente a 0,300 ± 0,195 (p = 0,0286); VEGFA, 0,678 ± 0,183 frente a 0,295 ± 0,133 (p = 0,05); CDKN2A, 0,687 ± 0,157 frente a 0,429 ± 0,088 (p = 0,0286); HRAS, 0,663 ± 0,258 frente a 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143); p53, 0,760 ± 0,167 frente a 0,448 ± 0,295 (p = 0,2000; Mann-Whitney U test)..
β-actina (43 kDa) se utilizó como control de carga
correlación entre la expresión de ARNm /proteína del Gois y las tasas de supervivencia de los pacientes con cáncer de vejiga
Un total de 30 casos de cáncer de vejiga urinaria fueron investigados por tasas de supervivencia global. Los pacientes con tumores de etapa 1 presentan una mejor supervivencia global en comparación con las de la etapa 2 o 3 [p = 0,0008, χ
2 = 14.32, Log-rank test (Mantel Cox); p = 0,0041, χ
2 = 8.260, prueba de Gehan-Wilcoxon Breslow-]. Por otra parte, los pacientes con tumores de grado 2 mostraron una mejor supervivencia global frente a las de los tumores de grado 3 [p = 0,0475, χ
2 = 6.094, (Mantel Cox) prueba de log-rank].
La mediana valor de la expresión de ARNm MMP-2 en las muestras de cáncer de vejiga fue 0,038. Los casos se dividieron en dos grupos con la expresión arriba y por debajo de este valor de la mediana. Del mismo modo, se dividió a los casos en grupos basados en los valores de la mediana para MMP9 (0,0007), OPN (0.031), VEGFA (0.141), TGFß1 (0,0001), FGF2 (0,0002), p14
ARF (0.011), p16
INK4A (0.013), p53 (0.013), AKT1 (0.025), EGFR (0.005), EGF (0,00002), HRAS (0,0011), KRAS (0.051), las ANR (0.024), ARAF (0.994), BRAF (0,916 ), RAF1 (0.956), RKIP (0,764) la expresión de ARNm (Tabla 2)
Los casos cuyos tumores presentaban menor grado de VEGFA (. & lt; valor de la mediana, 0.141) y EGFR (& lt; valor de la mediana, 0,0051 ) la expresión del ARNm exhibido tasas de supervivencia general peores que los casos que codifica una mayor VEGFA (& gt; valor de la mediana, 0.141) y EGFR (& gt; valor de la mediana, 0,0051), respectivamente, los niveles de ARNm [para VEGFA, p = 0,04; para EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) prueba]. Los pacientes con alta TGFß1, FGF2, p14
ARF, los niveles de AKT1, RKIP, KRAS y de ARNm de p53 también mostraron un mejor patrón de la supervivencia global, sin embargo, la correlación no fue estadísticamente significativa. Las curvas de Kaplan-Meier para todos los Gois se representan en la Figura 6.
Los casos cuyos tumores presentaban menor grado de VEGFA (& lt; valor de la mediana, 0.141) y EGFR (& lt; valor de la mediana, 0,0051) de expresión de ARNm, exhibieron tasas de supervivencia global peor, que los casos que codifica una mayor VEGFA (& gt; valor de la mediana, 0.141) y EGFR (& gt; valor de la mediana, 0,0051) para los niveles de ARNm [VEGFA, p = 0,04; para EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) prueba]. Las diferencias en la supervivencia se utilizó el test de Log-rank (Mantel Cox). La significación estadística se fijó en el nivel del 95% (p & lt; 0,05) guía empresas
Comparación de los conjuntos de datos GEO
Asimismo, comparó los resultados qPCR a disposición del público antes de Cristo 4 de microarrays conjuntos de datos GEO:. GSE89 por Dyrskjot et al. (2003) [19]; GSE7476 por Mengual et al. (2009) [21]; GSE3167 por Dyrskjot et al. (2004) [20] y GSE12630 por Monzon et al. (2009) [22]. Toda la media logarítmica
2 ratios transformadas de muestras en comparación con los controles antes de Cristo se representan en la Tabla S2.
Conjunto de datos GSE12630 contenía datos únicamente de carcinoma de células transicionales de la vejiga urinaria y el carcinoma urotelial metastásico. Dado que no se disponía de datos en el tejido normal para este conjunto de datos, se extrajeron los datos de tejido normal de conjunto de datos GSE89, y calculamos la media logarítmica
2 proporciones transformadas de AC frente a estos datos extraídos, que utilizamos como controles (Tabla S2) .
análisis de correlación
Hemos estudiado la correlación de los niveles de mRNA de la Gois en BC, así como en el tejido normal, la realización de la prueba de rangos de Spearman (Tabla S4).