PLOS ONE: Src quinasa en el Reglamento Progresivamente invasiva Cancer

Extracto

progresión metastásica es un proceso de múltiples pasos que implica el crecimiento del tumor y la supervivencia, la motilidad y la invasión, y la posterior proliferación en un entorno apropiado. La proteína tirosina quinasa Src se ha implicado en muchas de las vías bioquímicas que conducen a estos comportamientos. Aunque Src en sí está sólo en raras ocasiones mutado en tumores humanos, su actividad aberrante se ha observado en varios tipos de cáncer y sugerido para servir como un barómetro de potencial metastásico. Con estas características en mente, se examinó la regulación de quinasa Src en el estructural, enzimática, y los niveles de expresión como una función de líneas celulares de cáncer de próstata progresivamente invasivas. Sorprendentemente, tanto el contenido como la actividad quinasa Src total de disminución con el aumento de la agresividad línea celular, una observación que parece ser incompatible con el papel bien documentado de Src en las vías de señalización que impulsan el crecimiento y la invasión. Sin embargo, sí observamos una correlación directa entre la quinasa Src
actividad específica gratis (actividad total quinasa Src /contenido total de Src) y la agresividad metastásico, posiblemente, lo que sugiere que en líneas celulares altamente agresivos, enzimas de señalización clave son reclutados en todo el mundo para conducir el fenotipo canceroso. Además, aunque está presente en las líneas celulares de cáncer de próstata más agresivos la fosforilación mejorada esperada de Src en Tyr-416 (sitio de activación), se observan niveles inesperadamente altos de fosforilación en el sitio inhibidor Tyr-527 también. Este último, en lugar de coincidir con la enzima inhibida, es más indicativo de Src cebado sensible a parejas de unión fosforilados locales

Visto:. Xu W, Allbritton N, Lawrence DS (2012) Src quinasa en el Reglamento Progresivamente cáncer invasor. PLoS ONE 7 (11): e48867. doi: 10.1371 /journal.pone.0048867

Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 20 Junio, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012

Derechos de Autor © 2012 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención 5R01CA140173 de DSL. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la proteína quinasa Src es el miembro fundador de la quinasa subfamilia Src de tirosina quinasas de proteínas nonreceptor. La actividad catalítica de estas enzimas está regulada, en parte, a través de la fosforilación de [1]. Específicamente, la activación completa de Src es dependiente de la fosforilación en Tyr-416. Por el contrario, Tyr-527 fosforilación inhibe la actividad catalítica, mediante la promoción de una interacción intramolecular con SH2 de la enzima (y SH3) dominios. De hecho, el nivel de fosforilados Tyr-527, como se revela por análisis de transferencia Western o la inmunotinción, se toma a menudo como una medida de la enzima inactiva. Por ejemplo, se informó de la actividad quinasa Src ser hasta reguladas en el cáncer de próstata hormono-refractario según la evaluación de fosforilada contenido Tyr-416 [2]. Sin embargo, esta interpretación está llena de peligros. Aunque el
in vitro
baja actividad catalítica de Src pTyr-527 es indiscutible, la actividad correspondiente de la misma enzima en un entorno biológico es menos seguro. Tras la interacción de los dominios SH2 o SH3 de la enzima Src con otras proteínas, el residuo pTyr-527 inhibidor se libera, lo que genera completamente activo pTyr-527 Src [3] - [5]. De hecho, este proceso se recapitula mediante péptidos cortos que contiene pTyr-que, tras la unión al dominio SH2 de Src, interrumpen la interacción intramolecular inhibidora pTyr-527 y de ese modo activar la actividad quinasa [6] - [8]. En consecuencia, el estado de pTyr-527 no es necesariamente indicativa de una enzima inhibida
per se
, sino más bien de una enzima que es potencialmente preparado y listo para ser "encendido" por la interacción con una proteína accesoria adecuada. En resumen, los niveles altos pTyr-527 Src podrían representar enzima inhibida, enzima activada, o alguna variante en el medio. Esta incertidumbre pone de relieve la necesidad de probar la quinasa Src
Tarjetas telefónicas directamente a través de su capacidad para fosforilar un sustrato diana. Además de la fosforilación, la quinasa Src está regulada a nivel de proteínas a través de la ubiquitinación y por lo tanto la degradación por la vía del proteasoma mediada [9]. En consecuencia, en la misma forma que el estado de fosforilación es un presagio cuestionable de la actividad quinasa, los niveles de ARNm no son necesariamente indicativos de contenido quinasa Src o actividad.

Src está fuertemente implicado en las vías que controlan muchas de las características comportamientos celulares responsables de la invasión tumoral y la progresión. Por ejemplo, Src media la dinámica de adhesión y del citoesqueleto y de ese modo controla la migración de células [10], [11]. migración invasiva es aumentada por una transición Src dependientes de epitelio-mesenquimal [12] y la activación de las proteasas que degradan la matriz [13] - [16]. Src fosforilación de la caspasa 8 es antiapoptótico [17] mientras que la activación de STAT mediada por Src promueve el crecimiento celular y la supervivencia [9]. En resumen, Src está implicada en una gran cantidad de vías que están regulados hasta en muchas de las formas más agresivas e invasivas de cáncer. Sin embargo, desde Src solamente se muta raramente en los tumores humanos, comportamiento aberrante Src es más a menudo una consecuencia de su regulación anormal. Hemos examinado la regulación quinasa Src en las estructurales, catalíticas, y los niveles de expresión a través de una plataforma de líneas celulares de cáncer de próstata que varían en el comportamiento de no invasiva para invasivo y altamente dependiente de andrógenos al andrógeno-independiente. Sorprendentemente, se encontró que los niveles de actividad catalítica de Src y proteínas se reducen significativamente en las líneas celulares más agresivas. Por el contrario, estas líneas celulares agresivos muestran actividad específica Src alta y mejorar el nivel de fosforilación en Tyr-527 (el llamado sitio de inhibidor) con relación a sus contrapartes menos agresivos. Estos resultados se discuten en el contexto del mecanismo de la actividad Src en entornos altamente proliferativas.

Resultados

Diseño y Síntesis del sensor quinasa Src

Con base, en parte, en una secuencia de sustrato Src identificados a partir de una biblioteca de péptidos orientada [18], se construyó la secuencia marcada con fluoróforo: 5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Orn ( ac) -amida (1), donde Tyr es el sitio de fosforilación. Además, los residuos de ornitina (Orn) se colocaron en cada terminal de la secuencia de péptidos, en el caso de que el péptido resultó mostrar poca selectividad para Src frente a otras proteínas quinasas. Hemos demostrado previamente que la modificación de la cadena lateral de los péptidos dirigidos al sitio activo con sustituyentes no naturales puede mejorar drásticamente la selectividad para la proteína diana quinasa (
vide infra
) [19] - [25]. Tanto el no fosforilado y las formas fosforiladas [5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-Gly-pTyr-Glu-Phe-Orn (Ac) carboxílico (2)] del péptido se prepararon a través de la síntesis de péptidos en fase sólida. 5-FAM (5-carboxifluoresceína) fue elegido como el fluoróforo por el sustrato y la detección de productos por LIF.

La separación del sustrato no fosforilado y el producto fosforilado por CE-LIF se muestra en la Fig. 1A. Una mezcla 01:01 de los péptidos se carga en el capilar. Bajo las condiciones de separación descritas en Materiales y Métodos, sustrato de péptido 1 emerge a 240 segundos, mientras que el producto fosforilado 2 aparece a 290 seg. El crecimiento de este último se controló, como una función del tiempo, mediante la incubación del sustrato (1) con activa Src quinasa. El pico 290 seg se confirmó que era el producto fosforilado por spiking con sintética fosfopéptido 2. La cinética de la fosforilación se obtuvo mediante la evaluación de muestras de punto de tiempo recogidos a través de CE-LIF y cuantificar el grado de fosforilación a través de la integración de los picos individuales. Péptido 1 fosforilación es esencialmente completa dentro de 3 minutos bajo las condiciones de ensayo que emplean enzima Src puro (Fig. 1B). Por el contrario, los experimentos posteriores en lisados ​​celulares (
vide infra
) proceder a un ritmo más pausado. En este último caso, la cinética de velocidad inicial (& lt; 10% de fosforilación del péptido) se han adquirido en 10 min de incubación lisado celular

(a) separación CE-LIF y la visualización del sustrato peptídico Src 1 y su químicamente. sintetizado contrapartida fosforilada 2. (b) Src quinasa fosforilación catalizada de péptido 1 como una función del tiempo según la evaluación de CE-LIF.

Estabilidad de la Src quinasa péptido sustrato 1 en lisados ​​de células de próstata

péptidos comúnmente sufren degradación por proteasas catalizada en células, así como en los lisados ​​celulares. En consecuencia, antes de examinar Src quinasa fosforilación catalizada de péptido 1 con lisados, que supervisó la estabilidad del péptido como una función del tiempo. Las células se lisaron usando tampón de lisis de mamífero M-PER de Pierce y, en ausencia de ATP y Mg
2 + (es decir, sin actividad de cinasa observable), se añadió el lisado al péptido 1. Sólo aproximadamente el 10% del péptido se degrada después de 1 h (Tabla S1). Dado que la tasa de fosforilación se mide dentro de 10 min de incubación (Fig. S1), el péptido es lo suficientemente estable para nuestras necesidades.

Evaluación de la Actividad Src en células de la próstata Línea lisados ​​

Nuestros estudios iniciales centrado en los no invasivos líneas de células epiteliales de próstata normales inmortalizadas PZ-HPV-7 y RWPE1 y las líneas celulares de CaP altamente invasivos DU145 y PC3. También se investigó la actividad de Src en la línea celular CWR22Rv1 no metastásico, que exhibe un crecimiento independiente de los andrógenos, un comportamiento característico de CaP en estadio avanzado [26] correlacionada con la quinasa Src [2]. Se evaluó la cinética de velocidad inicial (es decir, & lt; 10% de la formación del producto) de la fosforilación de péptido (Fig. S1) y nos sorprendió encontrar que la actividad quinasa Src (en función de la cantidad total de extracto de proteína) es significativamente menor en el cáncer de próstata agresivo líneas celulares (CWR22Rv1, DU145 y PC3) que las líneas celulares no cancerosas de próstata (PZ-HPV-7 y RWPE1) (Fig 2;. barras grises; P & lt; 0,001). Esta tendencia general está en desacuerdo con la noción general de que la alta actividad de Src se correlaciona con la agresividad de próstata línea celular (es decir, un comportamiento invasor y el crecimiento independiente de andrógenos). Los informes anteriores han señalado que los altos niveles de pTyr-416 están presentes en las capas más agresivos y se ha supuesto, en toda la literatura, que la actividad Src pTyr-416 y se correlacionan directamente entre sí. Una posible conclusión derivada de nuestros datos es que la idea generalmente aceptada de que los niveles de pTyr-416 sirven como un barómetro de la actividad Src es defectuoso. Sin embargo, se investigó si podría haber otras explicaciones para la relación inesperada entre la actividad Src y agresividad línea celular. Una posibilidad es que el sustrato 1 Src es fosforilada por otras proteínas tirosina quinasas de representación de este modo la relación inversa entre la actividad aparente Src y agresividad de células engañosa.

Grey barras están tasas de fosforilación de péptido 1 de lisados ​​de células enteras (por normalizaron cantidad de extracto de proteína total). Las barras blancas son las tasas de fosforilación de lisados ​​celulares debido a Src quinasa Src solo después de restar no fosforilación de fondo 1. Comparación entre las líneas celulares de cáncer agresivos no oncológico (PZ-HPV-7, RPWE1) y (CWR22Rv1, DU145, PC3) mostró importantes niveles bajos de actividad de la quinasa Src asociados con el más tarde (p & lt; 0,001). Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Las barras de error son SEM.

Evaluación de la selectividad del péptido 1 de Src en la próstata líneas celulares

Hemos examinado la Src-selectividad del 1 utilizando lisados ​​de células de CaP agotadas de Src (Fig . S2). Aunque los lisados ​​celulares Src-libres son capaces de fosforilar el péptido 1, lo hacen en un grado mucho menor (& lt; 30%) que con lisados ​​de células enteras que contienen Src (Fig 2, barras blancas.). Las tirosina quinasas contaminantes que pueden ser responsables por el bajo nivel de fosforilación del péptido 1 en ausencia de Src podrían ser uno o más de los otros ocho miembros de las quinasas de la familia Src (SFK). De hecho, varios miembros de la familia SFK, como Fyn, Brk, Lyn y Lck Sí se sabe que presentar en líneas celulares de próstata [27]. No obstante, dado el nivel relativamente modesto de péptido 1 fosforilación por Src sin lisados, se decidió que el péptido 1 es, para nuestras necesidades actuales, lo suficientemente selectiva Src.

También se evaluó la capacidad del péptido Src 1 /método CE-LIF para detectar la actividad Src mediante el uso de una combinación de dos inhibidores de Src conocidos. Imatinib (comercializado como Gleevec), que se utiliza para tratar la leucemia mielógena crónica y otros tipos de cáncer, es un inhibidor de Abl-selectivo con una débil actividad anti-Src demostrado. bloques de Imatinib actividad quinasa al servir como un inhibidor competitivo de ATP. Como imatinib, saracatinib (AZD0530) es un inhibidor competitivo de ATP, pero muestra una alta selectividad y potencia robusta para Src. Por ejemplo, el
IC

50 valores de imatinib y saracatinib con aisladas enzima Src son 24,4 M [28] y 2,7 ​​nM [29], respectivamente. El uso de lisados ​​de células DU145, se encontró que los bloques saracatinib potentes inhibidores de Src péptido 1 fosforilación con un submicromolar
IC

50 (0,35 ± 0,08 M), mientras que el correspondiente pobre inhibidor imatinib Src muestra un
IC

50 que es de más de 100 mu M (Fig. S3). Estos resultados son consistentes con la noción, ejemplificado por los experimentos de reducción de Src que el método /CE-LIF péptido Src 1 sirve como una modalidad de detección de actividad eficiente y selectiva Src. actividad de la quinasa Src también se evaluó en células individuales en vivo, tanto en la ausencia y presencia de imatinib y saracatinib (Fig. S3).

Src niveles de expresión y estado de fosforilación en la próstata líneas celulares

Src la actividad es mayor en las líneas celulares no agresivos e inferior en las líneas celulares agresivos (Fig. 2), que es incompatible con la noción general de que Src juega un papel clave en la carcinogénesis, metástasis, y la transición al estado independiente de andrógenos. Sin embargo, se nos ocurrió que el contenido total de Src puede variar de una línea celular a la siguiente, lo cual podría la aparente (pero engañosa) relación inversa entre la actividad Src y la agresividad del CaP.

Contenido de Src se cuantificó mediante western blot análisis (Fig. 3A) y relativa normalizada para alfa-tubulina. Se encontró que las líneas celulares invasivos, así como la línea celular independiente de los andrógenos, muestran menos Src que el correspondiente no invasiva, las líneas celulares dependientes de andrógenos (Fig 3B, p & lt;. 0.001). Con estos datos en la mano, que posteriormente se trazan Src actividad específica (es decir, la actividad total de Src /contenido total Src) frente a la agresividad línea celular. Este último revela actividad específica Src es significativamente mayor en las líneas de células agresivas (CWR22Rv1, DU145, PC3) que en líneas no agresivos /normal de células (PZ-HPV-7, RWPE1) (Fig. 4, p = 0,0015).

(a) de lisados ​​de células de próstata se probaron para el total de Src, pY416 Src y pY527 Src, donde se utilizó α-tubulina como control de carga. (B) Las intensidades de cada banda de las transferencias Western se midieron y se normalizó en el correspondiente control de α-tubulina, y luego en comparación con la línea celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Comparación entre no-cáncer (PZ-HPV-7, RPWE1) y líneas celulares de cáncer agresivos (CWR22Rv1, DU145, PC3) mostró niveles reducidos significativa de la expresión de Src en el segundo (p & lt; 0,001). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y son la media con SEM.

Src quinasa actividad específica se calculó dividiendo la actividad Src (Fig. 2) por el contenido total de proteínas Src (Fig. 3). actividad específica Src es significativamente mayor en agresivo que en líneas celulares no cancerosas (P & lt; 0,0001). Las barras de error son SEM.

También examinamos qué relación, si la hay, existe entre los niveles de pTyr-416 y pTyr-527 Src y la actividad específica Src. La fosforilación en 416 se requiere para la activación completa de la actividad de Src mientras que la fosforilación en Tyr-527 es inhibitorio debido a la formación de una interacción intramolecular que bloquea la actividad de Src quinasa [1]. pTyr-416 niveles fraccionales (pTyr-416 /contenido total Src) (Fig. 5A) está altamente correlacionada con la actividad específica Src (Fig. 4) (r = 0,89), lo que sugiere que el contenido pTyr-416 es un buen barómetro de la actividad Src y la línea celular de la agresividad (Fig. 5A). Sin embargo, como se señala más adelante, esta correlación no se extiende a todas las líneas celulares. Por el contrario, el contenido de pTyr-527, un indicador presunto de inhibió Src, es más pronunciado en líneas celulares agresivos (Fig. 5B). Esta observación es incompatible con la noción general de que activa Src se correlaciona con la agresividad línea celular. En resumen, el estado de fosforilación de Tyr-Tyr-416 y 527, en su conjunto, no proporcionan una imagen coherente de la actividad Src través de una serie de líneas de células de CaP.

(a) los niveles pY416 se derivaron de la intensidades de las bandas en las transferencias Western (Fig. 3A), normalizados al correspondiente control de α-tubulina, y luego en comparación con la línea celular RWPE1 (RWPE1 como 1). niveles (b) pY527 se derivaron de las intensidades de banda en las transferencias Western (Fig. 3A), normalizado en el correspondiente control de α-tubulina, y a continuación, en comparación con la línea celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se muestran como media con SEM. los valores p se indican.

Src actividad, niveles de expresión, y la fosforilación de estado en las líneas celulares derivados de la próstata-RWPE1

Además de las líneas celulares de próstata estándar evaluados en la Fig. 2, 3, 4, y 5, se evaluaron una serie de líneas celulares que se obtuvieron por la exposición de RWPE1 a N-metil-N-nitrosourea. Las líneas celulares de aumentar la capacidad de invasión se han identificado a través de una serie de
in vitro
y
in vivo
experimentos de selección: RWPE1, WPE1-NA22, WPE1-NB14, WPE1-NB11 y NB26-WPE1 [ ,,,0],30]. Esta serie muestra actividad de la quinasa Src y las correlaciones agresividad análogo a los descritos anteriormente para las líneas de células de próstata normales. En primer lugar, la actividad total de Src muestra una tendencia significativa disminución (p = 0,018) como una función del aumento de la agresividad línea celular (Fig. 6A). En segundo lugar, con la excepción de WPE1-NB26, contenido total de Src también disminuye linealmente (p = 0,01) como una función de la línea celular agresividad (Fig. 6B y la Fig. S5). En tercer lugar, otra vez con la excepción de WPE1-NB26, actividad específica quinasa Src (actividad de la quinasa Src /contenido total de Src) muestra una tendencia creciente significativa lineal (p & lt; 0,001) como una función del aumento de la línea celular agresividad (Fig 6C.). Por último, en marcado contraste con los resultados mostrados en la Fig. 5A, la correlación entre pTyr-416 niveles fraccionales (pTyr-416 /contenido total de Src) y Src actividad específica es débil (r = 0,58), lo que sugiere que es peligroso confiar únicamente en pTyr-416 contenido como un barómetro de la actividad Src (Fig. 6D). Curiosamente, nosotros observamos una correlación muy fuerte con respecto al contenido pTyr527 fraccional y la actividad específica Src en serie RWPE1 de líneas de células (Fig. S6, r = 0,99), similar al de la Fig. 5B (r = 0,88).

El aumento de la capacidad invasiva se representa a lo largo del eje x. (A) Las barras grises son las tasas de fosforilación de péptido 1 de lisados ​​de células enteras (normalizados por contenido de proteína total). Las barras blancas son las tasas de fosforilación por lisados ​​de células debido a la Src quinasa solo después de restar Src no fosforilación fondo de 1. (b) El contenido total de Src como se determina por análisis de transferencia Western (Fig. S5) (c) Src quinasa actividad específica según la evaluación de Src actividad medido (Fig. 6A) divide contenido total de proteínas Src (Fig. 6B). (D) los niveles pY416 se derivaron de las intensidades de banda en las transferencias Western (Fig. S4), normalizados para el control α-tubulina correspondiente y, a continuación en comparación con la línea celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se muestran como media con SEM.

Discusión

y-32P ATP basa ELISA- genérica [31] γ-
[32] los métodos son dos de las estrategias más comunes que se utilizan para evaluar la actividad de la enzima pura bajo
in vitro
condiciones. Además, los péptidos marcados con fluoróforo [33] - [37], así como las proteínas de origen GFP [38], [39], se han descrito que muestran una respuesta fluorescente a la fosforilación, lo que permite la actividad de quinasa Src a muestrear continuamente en células vivas mediante microscopía de fluorescencia. Aunque estas tecnologías proporcionan una ventana a la base bioquímica de comportamiento de las células, que se traducen menos fácilmente en una, la metodología de plataforma cruzada de rutina (enzima pura, lisados ​​de células, y las células intactas), que también se puede aplicar a la cantidad limitada de células primarias disponible en muestras de pacientes. En este sentido, CE es un método ultrasensible por el cual se separan pequeñas cantidades de analitos y cuantificados, a través de la aplicación de un campo eléctrico y posterior detección de los analitos [40]. Desde la quinasa Src cataliza la transferencia del grupo γ-fosforilo desde ATP al residuo de tirosina del sustrato, la diferencia de carga entre el sustrato y el producto debería permitir a estas especies a separar, visualiza, y se cuantifica por medio de un desplazamiento en la movilidad electroforética [41 ] - [43]. De hecho, la Src sustrato fluoresceína sustituidos con 1 y su contrapartida fosforilada se diferencian fácilmente tras la exposición a tanto pura Src quinasa (Fig. 1) y lisados ​​de células de próstata (Fig. 2). En este último caso, en casi todas las líneas celulares, la gran mayoría de la actividad observada fosfotransferasa (& gt; 70%) se debe a la Src quinasa (Fig. 2). El ensayo de CE fue validado mediante el examen de la potencia inhibidora de Src saracatinib e imatinib, cuando éste sea cuatro órdenes de magnitud más débil (
IC

50 = 24,4 M) que el anterior (
IC

50 = 2,7 nM) frente a la enzima pura [28], [29]. De acuerdo con estos resultados, se observó una diferencia en la potencia inhibidora entre saracatinib (
IC

50 = 0,35 ± 0,08 M) e imatinib (& gt; 100 mM) para Src en DU145 lisados ​​celulares análogos a los reportados diferencia bajo condiciones de tampón simples. Finalmente, se investigó si la estrategia CE podría ser utilizado para observar la actividad Src y la inhibición en células individuales (Fig. S4). células DU145 se microinyectaron con Src sustrato 1, las células se incubaron a continuación durante 2 min, se lisaron individualmente utilizando un centrado láser de Nd: YAG, y luego el lisado de cada célula a electroforesis por separado. La formación del producto de fosfopéptido se observó a partir de células que no habían sido preincubadas con inhibidor (14 ± 2% del contenido total de péptido) o en células preincubadas con 1 M de los débiles imatinib inhibidor (
IC

50 & gt; 100 mM; 15 ± 3% del contenido total de péptido). Por el contrario, no se observó la fosforilación de péptido en células que habían sido preincubadas con 1 M de la saracatinib inhibidor potente (
IC

50 = 0,35 ± 0,08 M).

Con la capacidad para probar la actividad de Src utilizando la enzima purificada, en los lisados ​​celulares, y en las células individuales, se examinó la actividad de Src de las líneas celulares de próstata no invasivos, invasivos, y independientes de andrógenos (Fig. 2). Inesperadamente, se encontró que la actividad fosfotransferasa Src es más alta en las líneas celulares no invasivos, lo que parece ser contrario a la noción general de que Src juega un papel importante en la potenciación de potencial metastásico y la transición hacia y el mantenimiento de un crecimiento independiente de los andrógenos en el cáncer de próstata. Sin embargo, se nos ocurrió que los niveles de quinasa Src podrían diferir a través de las líneas celulares. Una vez más, de forma inesperada, se encontró que las líneas de células invasivas y independientes de andrógenos muestran significativamente menos Src que sus contrapartes dependientes de andrógenos no invasiva (Fig. 3). Por otra parte, la relación de la actividad de Src a contenido Src (actividad específica) reveló que las líneas de células agresivas y independientes de andrógenos muestran una actividad específica más alta Src que las líneas no agresivos andrógeno-dependientes de células (Fig. 4). Además, esta tendencia se mantiene para la serie de líneas celulares de N-metil-N-nitrosourea derivados de RWPE1 (de la zona periférica de una próstata humana normal). Específicamente, se observó disminución de la actividad total de Src y el contenido de Src, y aumento de la actividad específica Src como una función del aumento de la invasividad línea celular (RWPE1 & lt; WPE1-NA22 & lt; WPE1-NB14 & lt; WPE1-B11) (Fig 6A-B.). Hacemos notar una excepción a esta correlación, a saber, la línea celular derivada de RWPE1 más agresivo, WPE1-NB26. Este último ha recibido mucha atención debido a su fenotipo altamente invasivo [30], [44] - [53]. Recurrir a un contenido total de Src y la actividad específica como medidas de agresividad, hubiéramos asignado un fenotipo no invasivo para WPE1-NB26 (es decir, similar a la de la línea de célula madre RWPE1). Sin embargo, ya que este es claramente incorrecta, la agresividad asociada con esta línea celular N-metil-N-nitrosourea puede ser debido, al menos en parte, a los mecanismos que son independientes de la señalización de Src.

¿Por qué es el total de contenido src disminuyó en las líneas celulares más agresivas? Una posible explicación es la conocida sensibilidad de Src activado, con respecto a su homólogo no activado, para ubiquitina mediada por la degradación de [54], [55]. En consecuencia, las líneas celulares que se encuentran bajo una intensa presión Src activada podría, irónicamente, mostrar un menor contenido de Src que las células menos agresivos. Además, dos estudios recientes sugieren un mecanismo dependiente de micro ARN (MIR) por el que se regulan los niveles de Src. Bhatnagar
et al
han demostrado que cuanto más invasivo de la línea celular de próstata cuanto mayor sea el nivel de miR-205 [48]. miR-205 se conoce regular a la baja la expresión de Src [56]. Nuestra observación de que los niveles de Src son más bajos en las líneas celulares de próstata agresivos es consistente tanto con ubiquitina y mecanismos miARN. Además, la actividad específica más alta en las líneas celulares más agresivas indica que, en estas células, aunque hay menos Src presente, una mayor fracción de la misma reside en la forma activa.

estado de fosforilación Src se ha supuesto que se correlaciona con la actividad donde pTyr-416 se toma como formas como inactivos activos y pTyr-527 de la enzima. Con esto en mente, hemos medido los niveles de pTyr-416 a través de Western blot y trazó pTyr-Src 416 /Src total de (fraccionada pTyr-416) frente a la agresividad línea celular. Como es evidente en la figura. 5A y 6D, las líneas celulares altamente agresivos muestran una mayor proporción de pTyr-416 a un total de Src que sus contrapartes no agresivos. Esto es consistente con un informe reciente de Evans y colegas que demuestra que el inhibidor de Src saracatinib es más efectivo contra las líneas celulares de próstata que tienen la mayor proporción de Src-activo total [57]. En este último estudio, "Src activa" se tomó como pTyr-416 Src. Estos investigadores también informaron que las células con los índices más bajos (pTyr-Src 416 /total de Src) expresan el más Src.

Un alto pTyr-527 /Src relación total debe ser, de acuerdo con el modelo convencional, indicativo de una fracción total más bajo de la enzima activa. Sin embargo, hemos encontrado que esta relación es más alta en las líneas agresivas, así (Fig. 5B y la Fig. S5). Una posible explicación de este resultado inesperado es la conocida capacidad de la enzima Src pTyr-527 para ser activado por péptidos fosforilados y las proteínas. En síntesis, si bien pTyr-527 Src es inactivo en su forma aislada, purificada, lo contrario puede ser cierto cuando compañeros de unión potenciales fosforilados están presentes. En consecuencia, se concluye que los niveles de pTyr-527 Src no son un barómetro útil de inactivo Src y, más bien, puede realmente ser un pronosticador más apropiado de la actividad Src. Como acotación al margen, observamos que las transferencias de Western empleadas en este estudio para detectar el estado de fosforilación de Src utilizan poblaciones de células grandes. Sin embargo, los recientes avances, impulsados ​​por la tecnología de la CE, permiten que el estado de fosforilación de las proteínas que hay que resolver y detectar a partir de tan sólo 25 células [58]. De hecho, CE como un sistema de transferencia de Western de microescala ha recibido considerable atención [59]. En consecuencia, puede ser factible en última instancia a la muestra simultáneamente los niveles de la enzima fosfo-isoformas específicas, así como la actividad enzimática en unas pocas células usando la tecnología de la CE.

No ha sido y continúa siendo un esfuerzo hercúleo para identificar CaP marcadores que se correlacionan con la heredabilidad, así como mutaciones somáticas adquiridas. Por ejemplo, más de 40 loci de susceptibilidad han sido asignados a aproximadamente 25% del riesgo hereditario. [60] Además, se han llevado a cabo tanto en la región de codificación y análisis de todo el genoma para identificar aberraciones genéticas que se correlacionan con CaP somáticamente adquiridas. Por ejemplo, un estudio reciente todo el genoma se realizó utilizando muestras de tumores de pacientes con CaP agresivo. Estos investigadores identificaron casi 4.000 mutaciones somáticas de base y 90 reordenamientos cromosómicos por tumor, así como las correlaciones entre una gran variedad de puntos de interrupción de reordenamiento y varias marcas epigenéticas. [61] Los autores señalan que un "espectro de mecanismos de génesis del cáncer de próstata y la progresión directa" [61] y por lo tanto no hay cambio en la única actividad enzimática es responsable de la aparición, progresión y /o agresividad de la enfermedad. Por ejemplo, se cree que los reordenamientos genómicos complejos prevalentes en cáncer de próstata para incidir sobre la eliminación y la amplificación de un conjunto de genes que codifican los supresores de tumores y oncogenes conocidos, respectivamente. Sin embargo, nuestros datos sugiere que la actividad específica de Src puede servir como un barómetro de la tapa agresividad. Esto es probablemente una consecuencia del hecho de que la propia Src es un participante clave en las vías que median el crecimiento celular y la motilidad, que a su vez puede reflejar los cambios estructurales genómicos grandes y complejos que prevalecen en CaP. Además, aunque hemos encontrado que pTyr-Src 416 /Src total es un indicador fiable de la actividad específica Src, los resultados con pTyr-527 son, a primera vista, inesperado. Fosforilada Tyr-527 se considera generalmente que es un reflejo de la enzima inactiva. Sin embargo, hemos encontrado que la relación de pTyr-527 /total de Src es un mal indicador de
en
Src activa en las líneas celulares de CaP. Por el contrario, este último ratio parece ser un mejor predictor de Src activa. Desde un punto de vista mecanicista, esto podría reflejar la presencia de proteínas fosforiladas que puede asociarse con (a través de dominio SH2 de Src) y de ese modo activar rápidamente la enzima inhibida. En consecuencia, el estado de actividad de pTyr-Src 527 debe ser visto como "preparado para la actividad" en lugar de estáticamente inactivo.

En resumen, hemos desarrollado un sistema de detección de actividad de la quinasa Src sensible y selectiva. Utilizando una serie de líneas celulares de próstata agresivos, agresivos, y andrógeno-independientes, hemos encontrado que la actividad total Src disminuye en función del aumento de la próstata línea celular agresividad. Fmoc-Orn(Aloc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Tyr(PO(OBzl)OH)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Orn(Aloc)-amide-Resin