Extracto
En este estudio, un nuevo alcaloide indol apoptótica monoterpenoide, subditine (1), y cuatro compuestos conocidos fueron aislados de la corteza de los
Nauclea súbdita
. Completa
1H- y
se informaron los datos de RMN 13C del nuevo compuesto. Las estructuras de los compuestos aislados se aclararán con varios métodos espectroscópicos tales como 1D y 2D NMR, IR, UV y LCMS. Los cinco compuestos fueron seleccionados para la actividad citotóxica en LNCaP y PC-3 con cáncer de próstata líneas celulares humanas. Entre los cinco compuestos, el nuevo alcaloide, subditine (1), demostró la actividad de inhibición del crecimiento celular más potente y selectiva contra LNCaP con una CI
50 de 12.24 ± 0.19 micras y PC-3 con un IC
50 de 13,97 ± 0,32 M, en comparación con RWPE línea de células epiteliales humanas normales (IC
50 = 30,48 ± 0,08 M). Subditine (1) tratamiento indujo apoptosis en LNCaP y PC-3 como se evidencia por el aumento de la permeabilidad celular, la alteración de las estructuras del citoesqueleto y el aumento de la fragmentación nuclear. Además, subditine (1) aumento de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS), como se refleja en el aumento de expresión de la glutatión reductasa (GR) para eliminar los radicales libres dañinos en ambas líneas celulares de cáncer de próstata. El exceso de ROS podría provocar una perturbación del potencial de membrana mitocondrial (MMP), la liberación de citocromo c y la posterior caspasa 9, 3/7 de activación. Además análisis de Western blot subditine mostraron (1) inducida baja regulación de Bcl-2 y Bcl-XL expresión, mientras que p53 fue hasta reguladas en LNCaP (-wild-type p53), pero no en PC-3 (p53-null) . En general, nuestros datos demuestran que el nuevo subditine compuesto (1) ejerce un efecto anti-proliferativo en LNCaP y las células de cáncer de próstata humano PC-3 a través de la inducción de la apoptosis
Visto:. Liew SY, Looi CY, Paydar M, Cheah FK, Leong KH, Wong WF, et al. (2014) Subditine, un nuevo monoterpenoide Indol Alcaloides de la corteza de
Nauclea súbdita gratis (Korth.) Steud. Induce la apoptosis en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (2): e87286. doi: 10.1371 /journal.pone.0087286
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán
Recibido: 16 Agosto, 2013; Aceptado 20 de diciembre de 2013; Publicado: 14 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Liew et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por la Universidad de Malaya Beca de Investigación RP001 /2012; Universidad de Malasia de alto impacto Beca de Investigación UM.C /625/1 /HIR /MoHE /SC /37 y HIR: E00002-20001; Centro Nacional francés de Investigación Científica CNRS conceder 57-02-03-1007; y Fondos de Investigación de Postgrado de la Universidad de Malaya (PV050 /2012A). Este trabajo se llevó a cabo en el marco de un acuerdo oficial entre el CNRS y la Universidad de Malasia (Malasia). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la familia Rubiaceae (familia de Madder) es uno de los más grandes de las angiospermas con más de 637 géneros y cerca de 10.700 especies [1]. El género
Nauclea
que pertenece a esta familia, se compone de unas 35 especies en todo el mundo [2] y en Malasia, hay dos
Nauclea
especies;
N. officinalis
y
N. súbdita
[3].
Nauclea súbdita gratis (Korth.) Steud. es una planta tropical que crece en las tierras bajas hasta los bosques de colinas, en lugares pantanosos y con frecuencia a lo largo de los arroyos y ríos [4]. Es un árbol pequeño o mediano de la circunferencia de 25 m de altura y 60 cm [3]. Las plantas de este género son conocidos por producir interesantes alcaloides monoterpenoides con alta diversidad estructural como naucline [5], nauclealines B [6] y naufoline [7]. Muchos de ellos exhiben actividades biológicas significativas; anticonvulsiva [8], anti-proliferativa [9] y las actividades vasodilatadores [5].
El cáncer de próstata es el cáncer más frecuentemente diagnosticado entre los hombres en el mundo desarrollado. Se estima que 238,590 nuevos casos serán diagnosticados y 29.720 muertes resultarán de cáncer de próstata en los Estados Unidos en 2013 (Cancer Facts y las figuras de 2013, la Sociedad Americana del Cáncer, 2013). Aunque los mecanismos que conducen a cáncer de próstata no han sido completamente entendida, la edad, la historia raza, y familiares de los pacientes con cáncer de próstata han demostrado ser los factores potenciales estrechamente asociados a esta enfermedad mortal [10].
nuestro continuo esfuerzo para buscar nuevos y bioactivos constituyentes químicos de la flora Malasia [11] - [15], un nuevo citotóxico y apoptótico alcaloide indol monoterpenoide, subditine (1), se ha aislado de la corteza de los
Nauclea súbdita
junto con los cuatro alcaloides conocidos; angustoline (2) [11], [16], [17], angustidine (3) [18], [19], angustine (4) [20], [21], nauclefine (5) [22], [23 ] (Figura 1). En el presente trabajo, se reporta el aislamiento y caracterización de subditine (1), las actividades citotóxicas de alcaloides 1-5, así como el mecanismo de apoptosis de 1 contra las células cancerosas de próstata humano LNCaP y PC-3.
la estructura del nuevo compuesto, subditine (1) se dilucidan varios métodos espectroscópicos que eran 1D-RMN (
1 H,
13C, DEPT), 2D-RMN (HSQC, HMBC, NOESY), UV, IR y CLEM mientras que la estructura de los otros cuatro compuestos conocidos fueron confirmados a través de la comparación de los datos de RMN con valores de la literatura.
Materiales y Métodos
Procedimientos generales
el 1D - y 2D-RMN se registraron en cloroformo deuterado (CDCl
3) (Merck, grado deuteration min 99,8%.) utilizando JEOL 400 MHz LA FT NMR y el espectrómetro JEOL CEPA 400 MHz FT NMR. Los espectros de masas se obtuvieron en un Shimadzu LCMS-IT-TOF. Los espectros de absorción ultravioleta se obtuvieron utilizando Shimadzu UV-250 Espectrómetro de ultravioleta-visible. disolvente usado fue metanol (CH
3OH). Los espectros IR se obtuvieron en un Perkin Elmer Spectrum 400-FTIR Espectrómetro con CHCl
3 como disolvente. Todos los disolventes, excepto los utilizados para la extracción de mayor calidad AR son. El gel de sílice 60 (Merck, 0,040 a 0,063 mm) se utilizó para cromatografía en columna (CC). Aluminio apoyado gel de sílice 60 F
254 placas se utilizaron 20 x 20 cm para cromatografía en capa fina (TLC) (Merck, Alemania). Cromatografía preparativa en capa fina (PTLC) de gel de sílice 60 F placas
254 de vidrio de 20 x 20 cm (Merck, Alemania) se utilizaron para la separación de compuestos que no pueden ser separados por la columna convencional. manchas de TLC se visualizaron bajo luz UV (254 nm y 365), seguido de pulverización con el reactivo de Dragendorff para la detección de alcaloides. Un resultado positivo de la prueba fue indicada por la formación de manchas de color naranja.
Material Vegetal
La corteza de
Nauclea súbdita
se recogió en Hutan Simpan Bukit Kinta, Chemor, Perak, Malasia por el grupo fitoquímico del Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Malaya. Las muestras de comprobación (KL 5254) de estas plantas fueron depositados en el Herbario del Departamento de Química de la Universidad de Malasia, Kuala Lumpur, Malasia. colección de plantas han sido aprobados por el jefe de Jabatan Perhutanan Negeri Perak (Perak Departamento Forestal del Estado). Los estudios de campo no incluían las especies en peligro de extinción o protegidas.
Extracción y aislamiento
secos, corteza de tierra de la planta (1,7 kg) se desengrasa primero con hexano (17 litros) durante 3 días a temperatura ambiente. El extracto de hexano se filtró y se secó a temperatura ambiente. A continuación, los materiales vegetales secos se humedecen con una solución de amoniaco y se sumergen durante 2 horas. Se volvió a extraer con CH
2Cl
2 (17 litros) dos veces durante un período de 3 días. El sobrenadante obtenido se concentró usando un evaporador rotatorio a presión reducida hasta un volumen de 500 ml y se examinó para su contenido en alcaloides (utilizando TLC y se confirmó por pulverización con reactivo de Dragendorff). El extracto se concentró para dar finalmente extracto crudo diclorometano (5,0 g). El extracto crudo fue sometido a CC sobre gel de sílice usando CH 60
2Cl
2 y solvente MeOH (100:0, 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94 :6, 90:10, 83:17 y 75:25) y finalmente con 100% de MeOH se utilizó como eluyente. Mediante la comparación de los patrones de TLC de estas fracciones, quince fracciones se obtienen finalmente.
Purificación del Compuesto
La purificación adicional de la fracción 5 por PTLC dio alcaloide 1 (10,6 mg, MeOH-CH
2Cl
2; 98:2: saturado con NH
4OH). Ambos compuestos conocidos de 3 (5,5 mg, MeOH-CH
2Cl
2; 98:2: saturado con NH
4OH) y 5 (6,2 mg, MeOH-CH
2Cl
2 ; 98:2: saturado con NH
4OH) se obtuvieron después de la purificación mediante PTLC de la fracción de siete mientras que los compuestos 2 (7,5 mg, MeOH-CH
2Cl
2; 95:5: saturado con NH
4OH) y 4 (12,5 mg, MeOH-CH
2Cl
2; 98:2: saturado con NH
4OH) se obtuvieron de la fracción de doce y seis respectivamente
alcaloide. 1 |
amarillento sólido amorfo; UV (MeOH) λ
max (log ε): 393, 377, 210 nm; IR (CHCl
3) ν
max: 3430, 1640 cm
-1; para
1H- y
datos espectroscópicos de RMN-13C, véase la Tabla 1; CLEM: IT-TOF a
m /z
330.1018 [M + H]
+ para C
20H
15N
3O
2 (Calc. Para C
20H
15N
3O
2:330.1237).
Cell Cultura y
línea de células normales de próstata humano (células de cáncer de RWPE-1) y la próstata humana líneas; LNCaP y PC-3, se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, EE.UU.). células LNCaP y PC-3 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% de penicilina y estreptomicina. células RWPE-1 se mantuvieron en queratinocito medio sin suero (K-SFM, ATCC) suplementado con extracto de pituitaria bovina (BPE) y el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF). Mediums se complementaron con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (Sigma.), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Flowlab, Sydney, Australia). Todas las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C incubadora.
Ensayo de proliferación celular
La actividad anti-proliferativa se evaluó mediante la realización de ensayos de MTT como se ha descrito previamente con modificaciones menores [24]. Brevemente, las células se sembraron 24 horas antes del tratamiento en una placa de 96 pocillos a 5 x 10
4 células /pocillo con el fin de obtener 70% a 80% de cultivos confluentes. Los compuestos se disolvieron en DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EE.UU.), seguido de una dilución en serie 2 × 10 puntos van desde 0,825 M a 100 mM. La placa de 96 pocillos se incubó durante 24 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Al final de la incubación, 50 l de solución de MTT; se añadió a cada pocillo (2 mg /ml Sigma). La placa se incubó durante 4 horas. Todo medio se retiró y el cristal de formazan púrpura formado en el fondo de los pocillos se disolvió con 200 l de DMSO durante 20 minutos. La absorbancia a 570 nm se leyó en un lector de placas espectrofotométrico (Hidex). La proporción de células supervivientes se calculó como:.
Las curvas de dosis-respuesta se construyeron para obtener el IC
50 valores. Los datos experimentales se obtuvieron a partir de 3 experimentos independientes. El índice de selectividad se obtuvo por medio de CI
50 RWPE-1 /IC significa
50 de LNCaP o PC-3.
Celómica multiparámetro Ensayo
3 citotoxicidad kit (Thermo Scientific ) se utilizó como se describe anteriormente [25]. Brevemente, 24 horas después de subditine (1) de tratamiento, tinte MMP y el colorante permeabilidad celular se añadieron a las células vivas y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se fijaron, permeabilizaron, se bloquearon con 1x tampón de bloqueo antes de sondeo con primaria citocromo cy DyLight secundaria 649 anticuerpos IgG anti-ratón de cabra conjugado durante 1 hora cada uno. Hoechst 33342 se añadió a la solución de tinción. Después las placas se analizaron utilizando el sistema de filtrado de contenido de alta ArrayScan (HCS) (Celómica, PA, EE.UU.). Se tomaron los datos, extraídos y analizados con ArrayScan II de adquisición de datos y Visor de datos versión 3.0.
ROS Ensayo
La producción de ROS intracelular se detectó como se describe anteriormente [26]. El reactivo colorante DHE se convierte en etidio fluorescente y se intercala en el ADN en respuesta intracelular de ROS. Brevemente, 10 DHE mM solución madre (en metanol) se diluyó 500 veces en HBSS sin suero u otros aditivos para dar una solución de trabajo 20 mM. Después de la exposición a subditine (1), las células en la placa de 96 pocillos negro se lavó dos veces con HBSS y después se incubaron en 100 l de solución de trabajo DHE a 37 ° C durante 30 minutos. La fluorescencia de DCF en cada célula fue capturado, extraído y analizado con ArrayScan II de adquisición de datos y Visor de datos versión 3.0 (Celómica).
Expresión Génica
de perfiles
LNCaP y PC-3 células fueron tratadas con subditine (1) (12,5 M) durante 18 h. Se extrajo ARN de PC-3 o LNCaP células utilizando RNeasy más mini kit (Qiagen). 1 g de ARN transcrito fue invertir en cDNA utilizando el kit de primeros cadena RT2 (SA Biosciences, Qiagen) .cDNA se mezcló con RT2 Tiempo real ™ SYBR Green /PCR master mix-fluoresceína y se carga en cada uno de los 96 pocillos del estrés oxidativo humano y matriz de la defensa antioxidante qPCR de acuerdo con el protocolo del fabricante (SA Biosciences, Qiagen). En resumen, un volumen total de 25 l de mezcla de PCR, que incluía 12,5 l de mezcla maestra, 11,5 l de agua bidestilada, y 1 l de cDNA se cargó en cada una de las 96wells. qPCR se realizaron utilizando StepOne PLUS máquina de PCR en tiempo real (Applied Biosystems). amplificación por PCR se llevó a cabo a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. La expresión del ARNm de cada gen se normalizó utilizando el medio de expresión de cinco genes de limpieza:
β-actina (ACTB), β-2-microglobulina (β2M), hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1), proteína ribosomal L13a ( RPL13A) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). El método ΔΔCt se utilizó para el análisis de datos. Doblez se calcularon los cambios para cada gen como la diferencia en la expresión de genes entre subditine (1) o control no tratadas usando el software de análisis de datos qPCR-array RT Profiler.
Análisis qPCR en tiempo real
ARN total fue extraído de las células PC-3 o LNCaP utilizando el RNeasy más mini kit (Qiagen). ARN (1 g) se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad). QPCR se llevó a cabo en la máquina en tiempo real PCR StepOne PLUS (Applied Biosystems) utilizando SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los cebadores se sintetizaron comercialmente mediante tecnologías de ADN integrados (IDT). valores de ARNm diana se normalizaron usando ARNm β-actina y los datos se expresaron en relación a los valores normalizados de los controles correspondientes. Las muestras fueron analizadas en tres experimentos independientes por triplicado. Los cebadores usados se enumeran a continuación, España
GR cebador directo, AACATCCCAACTGTGGTCTTCAGC
GR Cebador inverso, TTGGTAACTGCGTGATACATCGGG
β-actina cebador directo, GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC
β-actina cebador inverso, AGTCCATCACGATGCCAGTGGT
bioluminiscentes Los ensayos de caspasa-3/7, -8 y -9
Un estudio en función del tiempo de la caspasa-3/7, -8, -9 y actividades era realizado por triplicado utilizando kits de ensayo de caspasa-Glo 3/7, 8, y 9 (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.) en blanco microplaca de 96 pocillos como se describe anteriormente [27]. Un total de 10.000 células por pocillo se sembró y se trató con 12,25 M de subditine (1) por 6, 12, 18, 24 y 30 horas. Después, se añadieron 100 l de reactivo de la caspasa-Glo, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se mide usando Tecan Infinito 200 Pro (Tecan, Mannedorf, Swizerland) lector de microplacas.
Western Blotting
para determinar la expresión de proteínas, 1
×
10
6 células /ml Se sembraron y se trató con subditine (1) o paclitaxel durante 24 h. Extractos de células enteras se prepararon como se describe anteriormente [28]. En resumen, se recogieron las células, se lisaron y se resolvieron en 10% de geles de SDS-poliacrilamida. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore), se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% en PBS-T (0,05% de Tween 20) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se sondearon con primario de conejo anti-Bcl-2, Bcl-XL anticuerpos o p53 seguido de peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario anti-conejo (Cell Signaling Technology Inc., CA, EE.UU.). Las membranas fueron despojados y se volvieron a sondar con anti-ratón
β-actina
anticuerpo como control de carga (Santa Cruz Biotechnology Inc.). complejos de proteína-anticuerpo se detectaron con Amersham ECL Western Blot reactivo de detección primario (GE Healthcare, EE.UU.).
Análisis estadístico
Todos los valores se expresaron como media ± S. D. Los análisis estadísticos se evaluaron mediante la prueba t de Student. Los valores de probabilidad * p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados y Discusión
El extracto de diclorometano de la corteza de los
Nauclea súbdita
se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice 60. con el sistema de gradiente de elución de diclorometano (CH
2Cl
2) y metanol (MeOH), dando 15 fracciones. La purificación adicional de las fracciones usando cromatografía de capa fina preparativa dio subditine (1) y cuatro alcaloides conocidos; angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5). Identificación estructural de 1 hecho por 1D, 2D-RMN, UV, IR y LCMS mientras que la estructura de compuestos conocidos (2-5) se identificó mediante la comparación de los datos de RMN con valores de la literatura.
Caracterización de Subditine (1)
Subditine (1) se aisló como un sólido amorfo amarillento. El espectro LCMS-IT-TOF reveló un pico de ion pseudomolecular [M + H]
+ a
m /z 330,1018
, correspondiente a la fórmula molecular de C
20H
15N
3O
2 (calc. 330.1237). El espectro IR de 1 mostró una banda de absorción a 1645 cm
-1, indicativo de una funcionalidad carbonilo conjugado lactámicos [18].
En el
espectro de 1H-RMN, la presencia de dos dobletes en δ
H 7,62 (1H,
d
,
J
= 7,8 Hz, H-9) y δ
H 7,47 (1H,
d
,
J
= 8,2 Hz, H-12), dos doblete de dobletes a δ
H 7,34 (1H,
dd
,
J
= 8,2, 7,1 Hz, H-11) y δ
H 7,19 (1H,
dd
,
J
= 7,8, 7,1 Hz, H-10), dos metilenos en δ
H 4,51 (1H,
m
, H-5) y δ
H 3,16 (1H,
m
, H-6), lo que sugiere un derivado naucleamide con el patrón de sustitución en el anillo a y C [29]. Además, este tetrahidro-
β
carbolina esqueleto (anillo A, B, y C) se indica con las correlaciones HMBC de H-5 a C-3 (δ
C 139.4) y C-7 ( δ
C 117.1), H-6 a C-2 (δ
C 127.3) y C-7, H-9 y H-11 a C-13 (δ
C 138,7) (Figura 2 ). Una amplia singlete a δ
H 8,94 implicaba la presencia de una unidad de NH. La
13C-RMN y espectros DEPT de 1 indica un total de veinte señales de carbono; uno metilo, dos de metileno, seis metano, nueve de carbono cuaternario y dos carbonilo (Tabla 1). El carbonilo del anillo de lactama resonó en δ
C 161.7. Además, el espectro de HMBC mostró correlación entre H-14 (δ
H 7,97) y C-3, H-14 y C-16 (δ
C 119.3), H-5 (δ
H 4,51) y C-20 (δ
C 161.7), apoyando así la presencia de un anillo de lactama δ. Por otra parte, las correlaciones HMBC de H-14 a C-16 y C-21 (δ
C 127.6), H-17 (δ
H 9.57) a C-15 (δ
C 141.1) y C -16, H-18 (δ
H 2.98) a C-22 (δ
C 165.9), H-19 (δ
H 10.72) a C-21 (δ
C 127.6) indicó que el anillo D está conectado a un anillo nicotinaldehido (anillo E) con un grupo metilo que forma una unidad de 2-methylnicotinaldehyde. Subditine (1), tiene un tipo de nauclefine del esqueleto [30], y es muy similar al compuesto conocido, angustidine (3), excepto que el primero tiene un grupo carbonilo adicional en C-21.
1 H y
13C valores para ambos compuestos están listados en la Tabla 1. Completar
1H y 13C-RMN asignaciones fueron establecidos por el análisis exhaustivo de los datos COSY, HMBC, HSQC y NOESY.
Ensayo biológico
Subditine (1) inhibió el crecimiento celular de LNCaP y PC-3 células de cáncer de próstata.
El efecto anticancerígeno del crudo diclorometano, subditine ( 1), angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) y se evaluaron en las células de cáncer de próstata humano LNCaP y PC-3 por ensayos de MTT. IC
50 valores (dosis requerida para inhibir la respuesta proliferativa por 50%) para cada compuesto se muestra en la Tabla 2. Subditine (1) mostró un gran efecto inhibidor frente a las células LNCaP en IC
50 12,24 ± 0,19 M mientras IC
50 para angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) fueron 58,09 ± 0,05 M, 140,27 ± 0,10 M, 149.16 ± 0.09 M y 86,35 ± 0,09 mM, respectivamente. Resultados similares se obtuvieron en las células PC-3, donde subditine (1) mostró la mayor actividad (IC
50 = 13,97 ± 0,32 M) en comparación con los otros compuestos. Estos resultados apoyan que subditine (1) es el compuesto citotóxico más potente entre los cinco probado.
A continuación, probamos el efecto de citotoxicidad subditine (1) en RWPE-1 (células epiteliales normales de la próstata humanos ). MTT ensayo mostró un mayor IC
50 valor a 30,48 ± 0,08 M, lo que indica que subditine (1) es de 2,5 y 2,2 pliegues más potente contra LNCaP y PC-3 (índice de selectividad (SI): [LNCaP /PC-3] = 2.49 /2.18) las células de cáncer de próstata que los de las células normales de la próstata; RWPE-1. Por el contrario, el paclitaxel medicamento estándar mostraron una menor selectividad (SI: [LNCaP /PC-3] = 1,24 /1,19) mediante la exhibición IC valores
50 de 1,27 ± 0,04 m, 1,33 ± 0,02 M y 1,58 ± 0,06 M contra LNCaP, PC-3 y RWPE-1, respectivamente.
Subditine (1) inducida por el reordenamiento del citoesqueleto y la fragmentación nuclear.
Desde subditine (1) inhibió significativamente el crecimiento de LNCaP y PC-3 células, este compuesto era seleccionado para realizar nuevos estudios mecanicistas. células del citoesqueleto y los cambios morfológicos nucleares de LNCaP y PC-3 fueron examinados por faloidina (detecta F-actina) y Hoechst 33342 tinción. Los resultados mostraron que algunos subditine (1) células tratadas muestra encogimiento celular con la tinción de punctuate de F-actina en la membrana periférica (Figura 3). A una concentración de 12,5 mM y 25 mM, se detectaron condensación nuclear y la fragmentación a las 24 horas después de subditine (1) de tratamiento (Figura 4). La intensidad nuclear, que corresponde a cambios en la cromatina apoptóticas se incrementó significativamente después de subditine (1) tratamiento en LNCaP y PC-3 células (Figura 4,
P & lt; 0,05
). Estos resultados sugieren que la apoptosis inducida subditine (1) de tratamiento en LNCaP y PC-3 células de cáncer de próstata.
LNCaP y células PC-3 fueron tratados con subditine (1) a diversas concentraciones durante 24 horas. Las células se fijaron y se tiñeron con Hoechst (azul) y faloidina colorante (rojo) que tiñe el núcleo y la actina polimerizada (F-actina), respectivamente. gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia media de faloidina (media ± S.D. .; * p & lt; 0,05). Dependiente de la dosis el aumento de la intensidad de faloidina en las células LNCaP se observaron después del tratamiento subditine.
LNCaP y PC-3 células fueron tratadas con subditine (1) (12,5 M y 25 M) durante 24 h. Las células fueron fijadas y teñidas con Hoescht 33342 (azul). Los círculos rojos indican la contracción de ADN o fragmentación. Las imágenes fueron capturadas utilizando el sistema ArrayScan Cellomic.
Subditine (1) promovidas especies reactivas del oxígeno (ROS).
Las ERO son subproductos naturales del metabolismo normal de oxígeno. Sin embargo, el nivel de ROS puede aumentar dramáticamente al estrés ambiental o químicos (por ejemplo, la presencia de un agente citotóxico). Para examinar si la exposición de subditine (1) promueve la producción de ROS, teñidas con colorante de células vivas DHE, 24 horas después de subditine (1) tratamiento. DHE se oxida rápidamente al DCF por ROS y la intensidad de fluorescencia se cuantificó con Celómica alta Content Screening. Como se muestra en la Figura 5, los niveles de fluorescencia DCF en LNCaP y células tratadas con subditine 3 PC-(1) se incrementaron significativamente en una manera dependiente de la dosis.
LNCaP y células PC-3 fueron tratados con subditine (1) (12,5 M, 25 mM, 50 mM) durante 24 h. Las células fueron fijadas y teñidas con colorante DHE. los niveles de ROS se determinaron indirectamente midiendo la incorporación de DHE colorante en la nuclear utilizando Cellomic HCS ArrayScan. se detectó aumento de la intensidad colorante DHE en el núcleo tras el tratamiento de subditine. Hoechst (azul) y el tinte DHE (verde). gráfico de barras que muestra la intensidad de fluorescencia media de DHE mancha (media ± S.D. .; * p & lt; 0,05) guía empresas
asociación entre el riesgo de cáncer de próstata y el estrés oxidativo ha sido bien reconocido.. Hay evidencias considerables que sugieren el estrés oxidativo contribuye a la etiología y la patogénesis del cáncer de próstata. Dado que las mitocondrias son una fuente importante de ROS, alterados bioenergética mitocondrial podrían ser la base del desarrollo del cáncer de próstata. Además, los altos niveles de ROS se han detectado en varias líneas de células humanas, así como en diferentes tejidos humanos. Algunas evidencias que apoyan sugieren que el aumento de generación de ROS podría ser el resultado de la transformación oncogénica. estrés oxidativo inherente puede afectar a varias funciones en las células de cáncer o tejido tumoral, tales como la proliferación celular, la promoción de las mutaciones y la inestabilidad genética, las alteraciones en la sensibilidad celular a agentes contra el cáncer, invasión y metástasis. Orientación de la producción de ROS ROS en lugar de neutralización podría ofrecer un nuevo mecanismo en la lucha contra el cáncer de próstata y quizás otros tumores malignos.
Subditine (1) la expresión génica inducida glutatión reductasa.
Como demostramos que subditine (1 ) ha demostrado que podría inducir ROS en las células, se decidió utilizar el estrés oxidativo humana y la defensa antioxidante en tiempo real qPCR perfilador-array para cuantificar los cambios de expresión génica en PC-3 o células LNCaP tratadas con subditine (1). Este qPCR-matriz contiene 84 genes implicados en la respuesta al estrés celular y el control redox e incluye todos los seis miembros de la familia peroxiredoxin antioxidante (PRDX).
El estrés oxidativo y los genes relacionados con antioxidantes se expresan diferencialmente en PC-3 o células LNCaP en respuesta a subditine (1). Curiosamente, hemos observado que la glutatión reductasa (GR) fue significativamente hasta reguladas (
P Hotel & lt; 0,05) en ambos cáncer de próstata líneas celulares relativos al control de las células (Fig. 6A). El factor de cambio es más drástico en LNCaP (& gt; 100 veces) en comparación con PC-3 (& gt; 20 veces) células. qPCR análisis independiente posterior también mostró que este gen está regulado en subditine (1) células tratadas, en consonancia con nuestros resultados de la matriz qPCR (Fig. 6B).
LNCaP y PC-3 células fueron tratadas con subditine (1) (12,5 M) durante 18 h. se utilizó (A) el estrés oxidativo y la defensa antioxidante humano qPCR-matriz para identificar los genes arriba o hacia abajo significativamente reguladas en subditine (1) tratados con células LNCaP o PC-3. Los análisis de perfiles de genes se realizaron tres veces en experimentos independientes. (La flecha indica la ubicación de los recursos genéticos en los gráficos de dispersión) (B) cambios transcripcional de GR se evaluaron utilizando cuantitativa en tiempo real de PCR. Los niveles de mRNA de GR se normalizaron mediante limpieza de genes β-actina y se expresaron como factor de cambio en comparación con el control sin tratar.
GR es una importante enzima implicada en la compactación de especies de oxígeno activo. Nuestros resultados sugieren que el aumento de la producción de ROS por subditine (1) podría estimular GR
de novo síntesis. GR es bien conocida por su función antioxidante y utiliza generalmente como un indicador de estrés oxidativo. Upregulation de GR podría ser uno de los mecanismos de defensa antioxidante celular en respuesta al aumento de ROS. Sin embargo, la generación de superfluo de especies reactivas de oxígeno podría sobrecargar el sistema antioxidante, que desencadena una cascada de eventos que conduce a un daño de lípido-proteína, desacoplar la fosforilación oxidativa y, finalmente, resulta en apoptosis.
Subditine (1) aumento de la membrana la permeabilidad, la reducción mitocondrial potencial de membrana (MMP) y el aumento de la liberación del citocromo c.
Para obtener una mejor información sobre el mecanismo de subditine (1) citotoxicidad inducida, los cambios en la permeabilidad de la membrana, potencial de membrana mitocondrial (MMP) y el citocromo c de localización después de subditine se midieron (1) tratamientos. Como era de esperar, subditine (1) tratado con células LNCaP y PC-3 demostrado mayor permeabilidad de la membrana en comparación con las células control como la mayoría tratados se someten a apoptosis debido a la actividad citotóxica del compuesto (Figura 7A y 7B). Además, los resultados mostraron que subditine (1) de tratamiento causó la pérdida de MMP, lo que sugiere un mecanismo plausible para la muerte celular. Como se muestra en la Figura 6A, tinte MMP teñidas fuertemente en el citoplasma de las células de control en comparación con subditine (1) células tratadas. LNCaP y células PC-3 tratados con subditine (1) durante 24 horas mostraron una reducción dependiente de la dosis de intensidad de fluorescencia de MMP (Figura 7B), que refleja el colapso de MMP. Por otro lado, subditine (1) tratado con LNCaP y PC-3 mostraron un aumento fluorescente-tinción en el citosol comparación con el control, lo que indica liberación del citocromo c (Figura 7A y 7B). Estos resultados sugieren que subditine (1) provocó la pérdida de MMP y la posterior translocación de citocromo c de la mitocondria en el citosol en LNCaP y células PC-3.
LNCaP y células PC-3 fueron tratados con subditine (1 ) durante 24 h. Las células fueron fijadas y teñidas con colorante permeabilidad de la membrana, MMP, citocromo c y Hoechst como se describe en Materiales y Métodos. Las células teñidas (A) se visualizaron usando el sistema de ArrayScan HSC para comprobar la morfología nuclear, permeabilidad de la membrana, la integridad de MMP, la liberación del citocromo c; Azul (nuclear), verde (permeabilidad de la membrana), Rojo (MMP), Cyan (la liberación del citocromo c). gráfico (B) de barras que muestra la intensidad de fluorescencia media de permeabilidad de la membrana, MMP y el citocromo c (media ± DE; * p & lt; 0,05) guía empresas
Subditine (1) activa la caspasa 9 y 3/7..
La liberación de citocromo c de la mitocondria activa las moléculas de caspasa aguas abajo y conducen a la muerte celular por apoptosis. Para examinar esto, las intensidades bioluminiscentes de la caspasa-3/7, -8, -9 actividades de subditine (1) tratado con LNCaP y PC-3 células a 6, 12, 18, 24, o 30 horas se midieron los puntos de tiempo . Como se muestra en la Figura 8, aumento significativo de la caspasa-3/7, -9 se detectaron actividades tanto en células LNCaP y PC-3 después de 12 y 24 horas de subditine (1) de exposición. Se observó la actividad más alta para la caspasa-9 en ambas líneas celulares después de 24 horas de tratamiento con subditine (1). Por otra parte, la actividad de caspasa-3/7 llegó a un máximo después de 18 horas de tratamiento y disminuye gradualmente en puntos de tiempo posteriores (24 y 30 horas). Ni LNCaP ni las células PC-3 mostraron ninguna inducción de la actividad de la caspasa-8 durante 30 horas de subditine (1) de tratamiento.