Extracto
Antecedentes
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es morfológicamente heterogénea ser clasificado como seroso, endometrioide, de células claras o mucinoso. análisis genético molecular ha sugerido un papel para genes supresores de tumores localizados en el cromosoma 3p en serosa patogénesis EOC. Nuestro objetivo fue evaluar la expresión de
HYAL1
, localizado en el cromosoma 3p21.3, en estos subtipos de EOC, y para investigar su correlación con la expresión de receptores de hormonas esteroides.
Metodología /Principales hallazgos
se determinó la expresión de ARNm de -α
HYAL1
, receptor de estrógeno (ER), ERβ y del receptor de progesterona (PR) en muestras de tumores de EOC y líneas celulares utilizando RT-PCR cuantitativa. También se examinó la expresión de estos genes en un conjunto de datos de microarrays a disposición del público. HYAL-1 actividad de la enzima se midió en las líneas celulares de EOC y en muestras de plasma de pacientes. Hemos encontrado que
HYAL1
expresión mRNA fue elevado en células claras y muestras de tejidos de EOC mucinosos, pero no en muestras serosas y endometrioide, ovarios normales o tumores benignos. Resultados similares se obtuvieron mediante dos técnicas diferentes y con cohortes muestra de tejido de dos instituciones independientes. Concordantemente,
niveles y enzimática HYAL1
actividad ARNm aumentaron solamente en líneas celulares derivadas de EOC de células claras y subtipos mucinosos. También demostramos que
HYAL1
ARNm está en relación inversa a la de ER específicamente en células claras y EOC mucinosos. Además, la expresión ectópica de ER en una línea celular de células claras EOC (ER y PR-negativo) inducida reducción del 50% de los
HYAL1
la expresión del ARNm, el apoyo a un papel de ER en el gen
HYAL1
regulación. De manera significativa, la actividad HYAL-1 también fue alta en el plasma de pacientes con estos subtipos de EOC.
Conclusiones /Importancia
Este es el primer informe que muestra altos niveles HYAL-1 en EOC y demostrando
HYAL1
gen represión de ER. Nuestros resultados identifican hialuronidasa-1 como un objetivo potencial /biomarcador para los EOC celulares y mucinosos claras y sobre todo en los tumores con niveles bajos ER
Visto:. Yoffou PH, Edjekouane L, L Meunier, Tremblay A, Provencher DM, Mes-Masson AM, et al. (2011) Subtipo de elevada expresión específica de hialuronidasa-1 (HYAL-1) en el cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 6 (6): e20705. doi: 10.1371 /journal.pone.0020705
Editor: Nai Sum Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 15 de diciembre de 2010; Aceptado: May 8, 2011; Publicado: 10 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Yoffou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (subvención#262142 de la CEE). banca tumor fue apoyado por el Banco de tejidos y de données del Réseau de Recherche sur le cáncer de Fonds de la recherche en santé du Québec afiliada a la Red Repositorio tumor canadiense. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en la mayoría de los países occidentales [1]. Debido a su crecimiento asintomático y la falta de métodos de detección eficaces, alrededor del 70% de todos los casos son diagnosticados en una etapa avanzada, con sólo modestas mejoras en la supervivencia en los últimos 40 años [1]. Aunque la mayoría de los pacientes responden inicialmente a la quimioterapia, las tasas de recurrencia son muy alto dando como resultado el mal pronóstico general que se observa en estas [2] pacientes. Además, los EOC son morfológicamente heterogénea, y diferentes subtipos histopatológicos tener características moleculares distintas y la respuesta al tratamiento diversa [3]. EOC puede ser clasificado como seroso, endometrioide, de células claras o mucinoso que corresponden a los diferentes tipos de epitelios presentes en el tracto reproductor femenino [4]. Las diferencias en la respuesta a la quimioterapia y resultados de los pacientes probablemente el resultado de la heterogeneidad molecular de estos morfológicamente distintos EOC [3]. Por ejemplo,
TP53
mutaciones se observan con frecuencia en los cánceres serosos y endometrioide, pero apenas se detectó en células claras y EOC mucinosos [3]. También se sabe que la frecuencia de la inestabilidad cromosómica es mayor en EOC seroso que en los otros subtipos [3].
En EOC seroso, el análisis genético molecular ha sugerido un papel para los genes supresores de tumor localizado en el brazo corto del cromosoma 3 (3p) en la patogénesis de esta enfermedad [5]. El análisis del transcriptoma del cromosoma 3 genes identificados varios genes expresados diferencialmente en líneas celulares de EOC y tumores de ovario en comparación con las células del epitelio superficial del ovario normal (NOSE) [6], [7]. aberraciones cromosómicas en 3p21.3 se encuentran frecuentemente en los cánceres de pulmón, renal y de la mama, lo que sugiere que albergan genes supresores de tumores [8]. Localizado en el cromosoma 3p21.3 es un grupo de genes, hialuronidasas con nombre (
HYAL1
,
HYAL2
y
HYAL3
), que son el blanco más frecuente de deleciones homocigóticas en cáncer de pulmón [8].
hialuronidasas de mamífero (EC 3.2.1.35) son endo
N
-acetylhexosaminidases que hidrolizan el ácido hialurónico glicosaminoglicanos. Ellos comprenden una familia de 6-7 genes con identidad de aproximadamente el 40% entre sí [9], [10]. En los seres humanos, que se agrupan en grupos de tres en los cromosomas 3p21.3 (
HYAL1
,
HYAL2
y
HYAL3
) y 7q31.3 (
HYAL4
,
PH20
/
SPAM1
y
HYALP1
), con
HYALP1 sobre ser un pseudogen y
HYAL4
que codifica para una enzima condroitinasa [9], [11]. Por lo tanto, en los seres humanos, hay cuatro hialuronidasas, Hyal-1, -2, -3 y PH20 /Spam1, esta última se expresa principalmente en el tracto reproductor masculino y que tiene un papel importante en la fertilización [12]. Por otro lado, hialuronidasas, situados en el cromosoma 3 se expresan de manera ubicua. HYAL-1 y HYAL-2 son los principales responsables de hialuronidasas somáticas rotación de hialuronano y se sabe que tienen varias funciones fisiológicas y patológicas [9], [13], tales como la curación de heridas, la inflamación y la osteoartritis. Por el contrario, Hyal-3 ha sido descrito para ser desprovisto de actividad enzimática hialuronano [14] y su papel fisiológico aún queda por determinar.
En el cáncer de ovario, el desequilibrio alélica de estos tres genes (
HYAL1
,
HYAL2
y
HYAL3
) se ha demostrado en los tejidos tumorales y el estroma [15]. En particular,
HYAL-1 se encontró
la expresión de ARNm que se reduzca significativamente en EOC seroso en comparación con ovarios normales [16], mientras que sin cambios o una tendencia de disminución de la actividad HYAL-1 se informó en extractos de tejidos de EOC [ ,,,0],16], [17]. De acuerdo con esta observación, la acumulación extracelular de hialuronano se observa a menudo en el estroma del tumor de ovario y de la matriz pericelular, y se asocia con un mal resultado de la enfermedad [17], [18]. Además, varios informes han demostrado interacciones entre los receptores de hialuronano y de membrana, tales como CD44, que promueve la asociación de CD44 con ciertas proteínas del citoesqueleto (por ejemplo, anquirina, RhoGTPases, Cdc42) de generación de eventos de señalización específicos de fomento de ovario de adhesión de células de cáncer, la migración y la supervivencia [ ,,,0],19]
en contraste, los niveles de hialuronano y se ha informado HYAL-1 para ser aumentado en la vejiga, de próstata y cáncer de cabeza y cuello, y estar implicado en la progresión tumoral y la metástasis [20] -. [ ,,,0],22]. Curiosamente, hialuronano extracelular elevada se encuentra principalmente en el estroma del tumor, mientras que elevados niveles de HYAL-1 se detectan en los tejidos tumorales, lo que sugiere una estrecha relación entre estos dos tipos de tejidos. Los altos niveles de HYAL-1 de expresión también se encuentran en cáncer de mama y glioblastomas, y se correlacionan con tumores metastásicos [22], [23]. Curiosamente, los receptores de estrógenos (ER) las líneas celulares de cáncer de mama negativos, los cuales tienden a ser más agresivos, han mejorado la actividad hialuronidasa en comparación con ER positivo líneas celulares [24]. Por un mecanismo aún desconocido, HYAL-1 induce la transición del ciclo celular y hasta regula los niveles de los reguladores positivos de la transición G2-M (por ejemplo, Cdc25C, ciclina B1, cdk10) en la vejiga, de próstata y líneas escamosas orales de células de cáncer [25] - [27]. HYAL-1 también mejora la angiogénesis, probablemente mediante la generación de fragmentos de ácido hialurónico de diferentes tamaños que poseen la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales y la formación de capilares [28].
Por lo tanto, los niveles de expresión de hialuronidasa pueden variar dependiendo del tipo de tumor y sobre su comportamiento agresivo. En el presente trabajo se realizó un estudio detallado sobre la expresión de HYAL-1 en muestras de tejido de cáncer de ovario en representación de cuatro subtipos histopatológicos diferentes y mostraron niveles elevados de esta enzima en células EOC y mucinosos claras, pero no en seroso o endometrioide. Se demostró además que los niveles de
HYAL1
ARNm en células claras y EOC mucinosos estaban inversamente correlacionados con los de ER. De manera significativa, hemos demostrado que la expresión ectópica de ER indujo una disminución del 50% en
HYAL1
la expresión del ARNm en una línea celular de células claras EOC. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe: i) que demuestren un aumento HYAL-1 en subtipos EOC morfológicas específicas, ii) que muestra una correlación inversa entre el
HYAL1 Opiniones y hormonas esteroides en muestras de tejido, y iii) que comprometen a
HYAL1
gen como un objetivo para la represión de genes ER. Finalmente, se mostró un aumento de 2.1 a 2.8 veces en los niveles plasmáticos de esta enzima en los pacientes con células claras y EOC mucinoso, pero no en aquellos con tumores serosos o endometrioides, en comparación con los pacientes con quistes benignos. Nuestros resultados actuales identifican HYAL-1 como un posible biomarcador para la detección de estos dos subtipos distintos de EOC.
Materiales y Métodos
Muestras clínicas
muestras de tumores de tejidos y EDTA se obtuvieron plasma recogido, con el consentimiento informado, los participantes se someten a cirugías realizadas en el Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal (CHUM) Hôpital Notre-Dame. Las políticas para la recopilación y uso de tejidos y muestras de sangre fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la CHUM. Sólo se utilizaron los tumores de pacientes no tratados previamente con quimioterapia. Histopatología, grado y estadio de los tumores fueron asignados de acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO criterios). Como ovario normal tiene poco contenido epitelial, tumores de ovario benignos serosos se utilizaron como control. La información relativa a las muestras utilizadas en el presente estudio se resume en la Tabla 1.
Líneas Celulares
Los cultivos primarios de epitelio superficial ovárico normal se obtuvieron células (nariz), como se describe anteriormente [ ,,,0],29], a partir de ovarios de tres participantes sin antecedentes de cáncer de ovario, la ooforectomía profiláctica siguientes en el CHUM Hôpital Notre-Dame y el consentimiento informado. Se establecieron líneas celulares EOC como se describe anteriormente [29] - [31], y fueron derivadas de tumores serosos epiteliales de ovario (TOV81D, TOV2223, TOV1946) o líquido ascítico (OV1946, OV866), a partir de un tumor de ovario endometrioide (TOV112D), una el carcinoma de células claras (TOV21G), y un cáncer de ovario epitelial mucinoso (TOV2444). Las células se cultivaron en medio OSE (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canadá) que contiene 2,5 mg /ml de anfotericina B y 50 mg /ml de gentamicina (ambos de Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). Los medios de cultivo se suplementó con suero al 15% de bovino fetal (FBS, Invitrogen) para los cultivos de la nariz y FBS al 10% para las líneas celulares de EOC.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Q-PCR)
El ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen) a partir de muestras congeladas de tumores o directamente de las células cultivadas a 80% de confluencia, como se describe anteriormente [32]. la calidad del ARN se controló de forma rutinaria mediante electroforesis en gel de agarosa y con el 2100 Bioanalyzer, utilizando el kit de Nano LabChip RNA 6000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). La síntesis de ADNc se realizó según el protocolo del kit QuantiTect transcripción inversa (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canadá) utilizando 1 g de ARN total. La solución de ADNc obtenida se diluyó diez veces y 5 ml de alícuotas se utilizaron en cada reacción Q-PCR. amplificaciones cuantitativos se obtuvieron utilizando el Platinum® SYBR® verde Q-PCR Supermix UDG (Invitrogen) y el siguiente par de cebadores: 5'-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 'y 5'-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3' para
HYAL1
, 5'-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 'y 5'-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3' para ER, 5'-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 'y 5'-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3' para ERβ, 5'-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 'y 5'-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC-3 'para el receptor de progesterona (PR), 5'-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3' y 5'-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3 'para
ERK1
. Los mencionados primer secuencias ER, PR y ERβ se obtuvieron de una publicación anterior [33].
ERK1
se eligió como el gen de control en base a su expresión estable en muestras de ovario, que consiste en los subtipos normales y diferentes EOC [34], [35], y como se describe anteriormente [34]. La fluorescencia se capturó usando el sistema de detección en tiempo real iCycler iQ (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Las amplificaciones se llevaron a cabo a 50 ° C durante 2 minutos (UDG de incubación), 95 ° C durante 3 minutos (desnaturalización), y 50 ciclos de 95 ° C /30 seg, 58 ° C /30 seg y 72 ° C /45 seg , seguido por una curva de fusión de 70 ciclos de 0,5 ° C de aumento /ciclo a partir de 60 ° C. Los controles positivos y negativos se introdujeron en todos los experimentos, y la pureza y la especificidad de los productos de la PCR se controlaron de forma esporádica mediante electroforesis en gel de agarosa. Las reacciones de PCR se realizaron al menos tres veces para cada muestra de ADNc en experimentos separados. valor relativo de expresión se obtuvo mediante el método
1/2? Ct utilizando
ERK1
como el gen de control. En este método, la diferencia en la C
T (? C
T) entre el objetivo y los genes de control se utilizó para determinar la expresión de genes con la fórmula 2
Ct. a continuación, un valor normalizado de expresión para el gen diana con referencia al gen de control se obtuvo mediante el cálculo de media
Ct. Todos los valores de expresión de mRNA fueron relaciones relativas al control
ERK1
gen.
Para monitorizar la respuesta biológica de ER expresión ectópica en células TOV21G (véase más adelante), Q-PCR se realizó para medir el ARNm niveles de objetivos ER conocidos, por ejemplo
GREB1 gratis (regulación del crecimiento por el estrógeno en el cáncer de mama 1) y
TFF1 gratis (factor trébol 1, también conocido como gen PS2) [36], [37]. Las reacciones de PCR se realizaron como se ha descrito anteriormente usando los siguientes pares de cebadores: 5'-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 'y 5'-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3' para
GREB1
, y 5'-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 'y 5' CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 'para
TFF1
.
Análisis conjunto de datos GEO
perfiles de expresión génica de varias muestras de tejido de los cuatro tipos de cáncer de ovario y morfológicamente distintos de los ovarios normales se ha realizado utilizando la Affymetrix HG_U133A [35] y se ha hecho accesible a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (GEO GSE6008 conjunto de datos). En el presente estudio, hemos subido la tabla en bruto para cada muestra de tumor y se seleccionaron los valores normalizados [-cuantil normalizado-media truncada, log-transformado con el registro (max (x + 50,0) 50] para la hibridación de las sondas de interés. en el caso de
HYAL1 Opiniones y PR, la matriz de Affymetrix HG_U133A sólo contenía una sonda para cada uno de estos genes (210619_s_at y 208305_at, respectivamente). por lo tanto, estos valores fueron utilizados como tales en nuestro análisis a . evaluar la expresión de estos genes en muestras de tejido individuales Sin embargo, para ER y ERβ varias sondas estaban disponibles (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at para ER, y 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at para ERβ), y se utilizó el promedio de los valores normalizados de las sondas de cada gen en nuestro trabajo para analizar la expresión de estos genes en muestras de tejido individuales. se obtuvo información relativa a la histología, grado y etapa de estas muestras de la material complementario disponible [35] y se resume en la Tabla 1.
El hialuronano zimografía
Para supervisar la actividad hialuronidasa de lisados celulares de líneas celulares de cáncer de ovario, se realizó zimografía hialuronano como se describe anteriormente [38] . Las células cosechadas a partir de 80% de cultivos confluentes se resuspendieron en tampón de lisis (10 mM de imidazol, 0,25 M de sacarosa), se sonicó brevemente y su contenido de proteínas determinadas por el reactivo de proteínas BioRad. Las muestras (que contiene 30 g de proteína) se separaron mediante PAGE nativo (20 mA, 4 ° C) en un gel de 8% que contiene 0,25 mg /ml de ácido hialurónico humano cordón umbilical (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá). El gel fue luego brevemente equilibrada en el tampón de ensayo específico para hialuronidasa-1 de detección (formiato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 3,7) y posteriormente se incubaron durante la noche en el mismo tampón a 37 ° C. Después de la incubación, los geles fueron tratados con 0,01 mg /ml Pronasa (Sigma-Aldrich) en un tampón Tris 20 mM (pH 8,0) durante 4 h, se enjuagaron con agua destilada, y se tiñeron secuencialmente con 0,5% azul Alcian y 0,1% azul de Coomassie R , tanto en 30% de ácido acético methanol:10%. Los geles se tiñeron-des hasta la limpieza de bandas de hialuronano digerido fueron evidentes. zimografía Gel se repitió tres veces para cada línea celular utilizando extractos de células de diferentes culturas.
HYAL-1 actividad enzimática de las muestras de plasma
La cuantificación de la actividad HYAL-1 en la muestra de plasma se ensayó por una método colorimétrico para la estimación de
N-acetil-D
-glucosamina (NADG) dio a conocer después de la digestión de ácido hialurónico [39], [40]. Brevemente, alícuotas de plasma tratado con EDTA (alrededor de 4 l, que contiene 30 g de proteínas, tal como se determina por el reactivo de proteínas BioRad) se incubaron con 40 mg de hialuronano de cordón umbilical humano (Sigma-Aldrich) en 200 volumen final l de tampón de reacción (formiato de sodio mM 79, NaCl 150 mM, 0,2 mg /ml BSA, pH 3,9) a 37 ° C durante 24 h. La reacción se terminó mediante la adición de 40 l de 1,2 M de potasio tetraborato de pH 9,1 y se hirvió durante 3 min. la formación de color se revela por la adición de 1,2 ml de
reactivo p
-dimethylaminobenzaldehyde (preparado como se describió previamente [39], [40]) y la incubación a 37 ° C durante 20 min en el medio ácido de este reactivo . Las muestras se leyeron inmediatamente a 585 nm. actividad hialuronidasa se estimó a partir de una curva NADG (Sigma-Aldrich) estándar (1 a 10 nmoles), y se expresó como proteína nmol /g. contenido de proteína de plasma se determinó por el ensayo de proteínas BioRad. Los blancos se obtienen mediante la omisión de las muestras de plasma. Cada muestra de plasma se midió al menos tres veces en experimentos separados.
TOV21G transfección de células
pCDNA plásmido (Invitrogen) que contiene la secuencia del receptor alfa de estrógenos humano (llamado pERα) se ha descrito [41] , [42]. Las células fueron cultivadas en TOV21G completa (bisonte) Medio de OSE como se describió anteriormente hasta que las células estaban en torno al 60% de confluencia. Las células fueron transfectadas transitoriamente con 1 g pERα en medio DMEM-F12 (Wisent) sin suplementos utilizando el reactivo de transfección GeneJuice (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de una transfección durante la noche, el medio se reemplazó por medio OSE completa, y las células se cultivaron durante un adicional de 24 h para la expresión de proteínas. Al final del experimento, las células se recogieron por tratamiento con tripsina-EDTA (0,25% de tripsina con EDTA 1 mm; Invitrogen), se lavaron en PBS y se utiliza para la extracción de RNA y Q-PCR o para la extracción de proteínas e inmunotransferencia. Los experimentos de transfección se repitieron al menos tres veces.
Immunoblotting
Las células se lisaron en solución salina tamponada con Tris (20 mM Tris-HCl, 150 mm NaCl, pH 7,4) (TBS) que contenía 0,1% Triton X-100, ortovanadato 1 mM, NaF 1 mM, PMSF 0,1 mM y 1 × proteasa cóctel inhibidor (Complete-mini, Roche Diagnostics Canadá, Laval, QC, Canadá). El contenido de proteína se determinó por el reactivo de proteína BioRad utilizando una curva estándar de BSA. Las muestras (lisados de aproximadamente 30 g de proteína) se sometieron a 12% de SDS-PAGE, en condiciones reductoras, y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa. la unión a la membrana no específica se bloqueó con 5% de leche desnatada deshidratada en TBS. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (4 ° C, durante la noche), se lavó en TBS que contiene 0,1% de Tween, y se incubaron con peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios conjugados. Los anticuerpos IgG primarios utilizados en nuestro trabajo fueron anti-ER (H-184, 1:1000, anticuerpo de conejo; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y anti-actina (pan Ab-5, 1:1500, anticuerpo de ratón; Lab Vision Corp., Fremont, CA). Estos anticuerpos se probaron en nuestras condiciones para ser específicos para sus proteínas diana. Y conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón (1:1000, anticuerpo de cabra; Sigma) y la IgG anti-conejo (1:3000, anticuerpo de cabra; Bio-Rad) se utilizaron como anticuerpos secundarios. el reconocimiento de la proteína-anticuerpo se detectó por Western relámpago quimioluminiscencia reactivo Plus (PerkinElmer, Boston, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico
Debido a que los niveles de receptores de hormonas HYAL-1 y no fueron siempre una distribución normal, se utilizaron pruebas no paramétricas para analizar la expresión de genes en muestras de tejido y la actividad enzimática en muestras de plasma. En primer lugar, realizamos un no paramétrico de análisis de Kruskal-Wallis de la varianza y cuando se observaron diferencias significativas, se realizó Mann Whitney pruebas comparando el grupo de muestras normales (por microarrays) o benigno (por Q-PCR y la actividad) con cada uno de los subtipos de tumores por separado . La significación estadística se consideró a
P Hotel & lt; 0,05. los coeficientes de correlación de Spearman se calcularon y se consideraron estadísticamente significativas cuando
P Hotel & lt; 0,05. Las diferencias en la expresión génica de las células transfectadas y no transfectadas TOV21G fueron analizados por de Student
t-test
(dos colas, con igualdad de varianza) y se consideraron significativos cuando
P Hotel & lt; 0,05 . Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism4 para Windows versión 4 (GraphPad Software, Inc).
Resultados
hialuronidasa-1 de expresión es elevada en células claras y mucinoso, pero no en serosa y endometrioide EOC
en el pasado, la expresión de hialuronidasa-1 en cáncer de ovario se ha descrito específicamente en tumores serosos [16], [17], la mayoría probablemente porque este es el subtipo más frecuente EOC [4]. En el presente estudio hemos analizado la expresión de ARNm de esta enzima por Q-PCR en muestras de tejido de cáncer de ovario obtenidas de pacientes con diferentes subtipos morfológicas de esta enfermedad, por ejemplo, serosos (11 muestras), endometrioide (9 muestras), de células claras (11 muestras) y mucinosos (8 muestras). Los niveles de expresión se compararon con los de 15 tumores de ovario benignos. Los tumores benignos fueron elegidos para la comparación debido a su contenido abundante de epitelio de la superficie que es muy pocos en los ovarios normales. Además, queríamos evitar la posible interferencia de HYAL-1 de expresión en otros tipos de células de ovario. Por ejemplo, hemos demostrado que esta enzima se expresa en el ratón de ovario células de la granulosa [38]. Como se muestra en la Figura 1A, los niveles de
HYAL1
mRNA son significativamente elevados en células claras y carcinomas mucinosos (prueba de Mann Whitney,
P
& lt; 0,05)., Pero no en tumores serosos y endometrioide
a) Q-PCR para
HYAL1
expresión de mRNA en tumor benigno (barra blanca) y, en serosa (barra punteada), endometrioide (barra rayada), de células claras (barra sombreada) y mucinoso (barra de color negro) muestras de tejido de pacientes con EOC. Las barras representan la media ± SEM de la relación
HYAL1
expresión normalizada para controlar gen
ERK1
de diferentes pacientes en cada grupo. El valor para cada muestra de ADNc individual es la media de 3-4 mediciones Q-PCR separadas. * Denota
P Hotel & lt; 0,05 en la prueba de Mann-Whitney. B) Los valores normalizados para
HYAL1
sonda de hibridación de la matriz de Affymetrix HG_U133A (GEO GSE6008 conjunto de datos) en muestras de ARN de tejidos ováricos normales (barra blanca), y de la serosa (barra punteada), endometrioide (barra rayada), de células claras (barra sombreada) y el COE (barra negro) mucinosos. Las barras representan la media ± SEM de valores en bruto normalizado de
HYAL1
hibridación. * Denota
P Hotel & lt; 0,05 en la prueba de Mann-Whitney. C) Q-PCR para
HYAL1
de expresión de ARNm en las líneas celulares derivadas de epitelio ovárico normal (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D; barras blancas), y desde serosa (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866; salpicado bares ), endometrioide (TOV112D; barra rayada), de células claras (TOV21G; barra sombreada) y mucinoso (TOV2444; barra de color negro) EOC. Las barras representan la media de la relación
HYAL1
expresión normalizada para controlar gen
ERK1
para cada línea celular. mediciones de Q-PCR se repitieron al menos tres veces para cada línea celular cDNA. Las líneas celulares derivadas de diferentes subtipos de EOC se representan en barras separadas, por tanto, no hay barras de error están representados. Las flechas verticales indican células claras y las líneas celulares que tienen mucinosos
HYAL1
alta expresión de ARNm. D) El hialuronano zymogram de lisados celulares de la mencionada seroso, endometrioide, de células claras y líneas celulares de cáncer de ovario mucinoso. La flecha horizontal marca la banda clara de hialuronano digerido. La imagen puede no coincidir tres experimentos independientes zymogram.
Debido a que el tamaño de nuestra cohorte muestra podría ser considerado pequeño, decidimos para validar nuestros resultados mediante el análisis de
HYAL1
la expresión del ARNm en una a disposición del público de microarrays de datos [35] (GEO GSE6008 conjunto de datos) que contiene 41 seroso, endometrioide 37, 8 células claras y 13 muestras de EOC mucinosos, y 4 muestras de tejidos ováricos normales. Figura 1B muestra los valores normalizados [-cuantil normalizado-media truncada, log-transformado con el registro (max (x + 50,0) 50] para la hibridación de cada muestra con el
HYAL1
sonda (210619_s_at) de la matriz de Affymetrix HG_U133A. de acuerdo con nuestros resultados Q-PCR, no se observó diferencia significativa para
HYAL1
la expresión de ARNm entre los tejidos ováricos normales y la de las muestras de tumor seroso o endometrioides (Figura 1B). carcinomas de células claras tenían fue alcanzado una tendencia a expresar mayores niveles de
HYAL1
ARNm que el tejido ovárico normal, pero sin significación estadística. de acuerdo con nuestros resultados, las muestras mucinosos tenían mayores niveles estadísticamente significativos de
HYAL1
que el tejido normal (prueba de Mann Whitney,
P
& lt; 0,05). (Figura 1B)
líneas celulares de cáncer de ovario derivados de muestras de tumores de estos diferentes subtipos morfológicos se han caracterizado anteriormente y mostró un comportamiento similar a la muestra de tumor del que se derivan [29] - [31] ellos proporcionan potentes herramientas para investigar los eventos moleculares relacionados con el cáncer de ovario cada morfológicamente distintos.. Por lo tanto, nuestro siguiente paso fue analizar el nivel de expresión de
HYAL1
ARNm y proteínas en estas líneas celulares. Se utilizaron cultivos primarios de células de epitelio normal de ovario superficie (nariz) [29] como controles. La figura 1C muestra que, como era de esperar, la expresión de ARNm de
HYAL1
fue particularmente alta en las líneas celulares TOV21G (derivada de un carcinoma de células claras) y TOV2444 (derivado de un EOC mucinoso). Un nivel intermedio de
se observó HYAL1
mRNA expresión en la línea celular TOV112D, que se derivó de un tumor de ovario endometrioide. Las líneas celulares derivadas de cáncer epitelial de ovario seroso en el sitio primario (TOV81D, TOV2223, TOV1946) o desde el fluido de ascitis (OV1946, OV866) mostraron niveles bajos de
HYAL1
expresión, comparables a los de las líneas celulares nariz. Con el fin de demostrar que los niveles de expresión de mRNA, medido cuantitativamente por nuestro grupo de cebadores, que se refleja la cantidad de proteína HYAL-1 en estas muestras, se midió HYAL-1 actividad enzimática por un zymogram sustrato-gel. Este es un método convencional para medir la actividad de la hialuronidasa y es específico para hialuronidasa-1 cuando se ensayó a pH ácido [38]. La figura 1D muestra una banda clara de sustrato digerido (ácido hialurónico) sólo en los lisados celulares de las líneas celulares TOV21G y TOV2444. La actividad enzimática HYAL-1 en las muestras serosas y endometrioide estaba por debajo del nivel de detección de nuestro ensayo.
Dado que los niveles Hyal-1 elevados se han correlacionado previamente con más altos de la vejiga y de próstata de grado tumores [21], [22 ], decidimos verificar si los niveles de
HYAL1
ARNm en células claras de ovario y tumores mucinosos se correlacionan con el grado de la enfermedad o de la etapa (véase la Tabla 1 para obtener información de los pacientes). Sin embargo, los análisis de correlación de Spearman no reveló una correlación positiva significativa entre los niveles de
HYAL1
ARNm y ya sea de grado o etapa de células claras (r = 0,262 y -0,322 para el grado y estadio, respectivamente, en nuestro conjunto de datos, y r = 0,055 para la fase de los microarrays de datos, todos los
P Hotel & gt; 0,05) o muestras de tumores mucinosos (r = -0.655 -0.577 y para el grado y estadio, respectivamente, en nuestro conjunto de datos, y r = -0.094 y - 0,378 para el grado y el estadio de los microarrays de datos, todos los
P Hotel & gt; 0,05). Análisis global que incluye todos los subtipos no mostraron una correlación positiva significativa, ya sea (r = -0,234 -0,251 y por grado y estadio, respectivamente, en nuestro conjunto de datos, y r = 0,185 y 0,042 para el grado y el estadio de los microarrays de datos, todos los
P Hotel & gt; 0,05). Estos resultados sugieren que HYAL-1 de expresión podría ser una característica fenotípica intrínseca de células claras y EOC mucinosos y que podría ser utilizado como marcador de diagnóstico /detección para estos subtipos de cáncer de ovario.
actividad hialuronidasa-1 se puede detectar en el medio de cultivo acondicionado de la línea celular TOV21G y es un potencial biomarcador de suero /plasma para células claras y mucinoso EOC
se ha demostrado que HYAL-1 está presente en el medio de cultivo de líneas celulares de cáncer de próstata y vejiga así como en la orina de pacientes con cáncer de vejiga [21], [26], [27]. En el presente trabajo, hemos querido verificar si HYAL-1 también fue secretada por líneas celulares de EOC y si podría ser utilizado como un marcador de suero /plasma para los dos subtipos morfológicos en el que se elevó su nivel de expresión, por ejemplo, de células claras y EOC mucinoso. La Figura 2A muestra la presencia de actividad HYAL-1 (banda clara de hialuronano digerido) en el medio concentrado libre de suero condicionado de cultivo celular TOV21G así como en su lisado celular. En contraste, no la actividad enzimática se puede detectar en el medio y las células se concentraron lisado acondicionado de la línea celular TOV1946 (derivado de un EOC serosa). Habiendo establecido que HYAL-1 es secretada por las células de cáncer de ovario que expresan esta enzima, se investigó si esta actividad enzimática se pudo detectar diferencialmente en el plasma de pacientes con distintos subtipos de EOC morfológicas.