Extracto
Antecedentes
El cáncer de ovario es la quinta causa de muertes relacionadas con el cáncer en las mujeres más importantes. las tasas de supervivencia de cinco años para la enfermedad en etapa temprana son mayores que 94%, sin embargo la mayoría de las mujeres son diagnosticadas en estadio avanzado con 5 años de supervivencia inferior al 28%. Se necesitan medios mejorados para la detección temprana y el seguimiento fiable paciente para aumentar la supervivencia.
Metodología y Principales conclusiones
La aplicación de la proteómica basada en la espectrometría de masas, hemos tratado de dilucidar una pregunta sin respuesta en relación con la investigación de biomarcadores capacidad de determinar la carga tumoral detectable por una proteína biomarcador de cáncer de ovario que emana directamente de las células tumorales. Desde agresivos cánceres epiteliales de ovario seroso representan la mayor parte de la mortalidad, un modelo de xenoinjerto utilizando SKOV-3 células de cáncer de ovario seroso humanos fue establecido para modelar la progresión a carcinomatosis diseminada. El uso de un método para el enriquecimiento de la proteína de bajo peso molecular, seguido de cromatografía de líquidos y el análisis de espectrometría de masas, una secuencia de péptido-humano específico de S100A6 se identificó en el suero de los ratones en estadio avanzado de carcinoma de ovario experimental. expresión S100A6 se documentó en xenoinjertos de cáncer, así como a partir de tejidos de pacientes de cáncer de ovario. Estudio longitudinal reveló que la concentración de suero S100A6 está directamente relacionada con las predicciones de la carga tumoral a partir de un análisis de regresión de calibración inversa de los datos obtenidos a partir de una imagen óptica bioluminiscente detergente suplementada antígeno de captura de inmunoensayo y de todo el animal. El resultado del modelo animal se confirmó en material clínico humano como se encontró S100A6 ser significativamente elevados en los sueros de mujeres con cáncer de ovario en estadio avanzado en comparación con aquellos con enfermedad en estadio temprano.
Conclusiones
S100A6 se expresa en tejidos de cáncer de ovario y otros, pero no se ha documentado previamente en los sueros de la enfermedad de cáncer de ovario. S100A6 se encuentra en el suero en concentraciones que se correlacionan con la carga tumoral experimental y con la etapa de la enfermedad clínica. Los datos significan que S100A6 puede resultar útil en la detección y /o seguimiento de cáncer de ovario, cuando se usa en conjunto con otros biomarcadores
Visto:. Wei BR, Hoover SB, Ross MM, Zhou W, Meani M, Edwards JB , et al. (2009) Suero Concentración S100A6 predice carga tumoral peritoneal en ratones con cáncer ovárico epitelial y se asocia con la etapa avanzada en los pacientes. PLoS ONE 4 (10): e7670. doi: 10.1371 /journal.pone.0007670
Editor: Irene Oi-Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 25 Junio, 2009; Aceptado: September 29, 2009; Publicado: 30 Octubre, 2009
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Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural, Centro para la Investigación del cáncer, Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, Bethesda , Maryland, y por una subvención del Instituto Superior de Sanidad, de Italia bajo el Programa Oncoproteomics EE.UU.-Italia. BRW y RMD son empleados de las aplicaciones científicas International Corporation, Frederick, Inc., Frederick, Maryland, bajo contrato con el Programa Nacional del Cáncer del Instituto de Investigación Intramural (Premio N01-CO-12400). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (OVCA) representa sólo el 4% de los casos de cáncer en las mujeres, sin embargo, es la quinta causa principal de muerte por cáncer y el cáncer ginecológico más letal en esta población [1]. En 2008, había un estimado de 21.650 nuevos casos y 15.520 muertes en el [1] de Estados Unidos. Cisplatino, un agente quimioterapéutico basado en platino introducido en 1978, se ha convertido en una parte esencial de un régimen de quimioterapia OVCA y ha mejorado en gran medida el resultado de OVCA etapa temprana [2]; la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes en estadio I es mayor que 94% (http //: seer.cancer.gov/csr/1975_2006). Por desgracia, OVCA rara vez se diagnostica en una etapa temprana, cuando la enfermedad está limitada ya menudo asintomática. Casi el 70% de los casos Ovča se detectan en etapas difundidos, es decir, las etapas III y IV, durante el cual la tasa de supervivencia a 5 años disminuye a un 30% o menos.
Una prioridad de investigación OVCA urgente es el descubrimiento y validación de biomarcadores útiles para el diagnóstico de los tipos más mortales de OVCA, que a menudo progresa rápidamente [3]. El único procedimiento no invasivo aprobado por la FDA disponibles para el diagnóstico de cáncer de ovario hasta la fecha es la medición de CA-125 niveles de suero. A pesar de que 80% de los pacientes con avanzado OVCA han elevado suero CA-125, hay una alta tasa de falsos positivos asociados con la prueba CA-125 [4] - [6]. Las condiciones físicas tales como el embarazo, enfermedad inflamatoria pélvica, quistes benignos, miomas uterinos, o infección también pueden aumentar los niveles séricos de CA-125 [7], [8]. Otros tumores malignos, incluyendo páncreas, pulmón, mama, cáncer gástrico y de colon también se han demostrado para aumentar el suero CA-125 [4], [8].
La aparición de espectrometría de masas (MS) la tecnología proteómica ha dado nueva oportunidades para el descubrimiento de marcadores de proteínas específicas para la detección temprana OVCA. Suero humano se presenta como un espécimen atractivos para el descubrimiento de biomarcadores usando MS porque la adquisición de muestras es mínimamente invasivo, y el suero es el fluido fisiológico estándar utilizado para fines de diagnóstico. Sin embargo, la complejidad y la amplia gama dinámica de concentración de proteína de suero hacen análisis de un proteoma total en suero desafiante; las concentraciones de proteína de suero varían & gt; 9 órdenes de magnitud y 99% de la masa total de proteínas de suero está constituido por sólo aproximadamente 22 especies de proteínas [9]. Tales desafíos asociados con la proteómica para el descubrimiento de biomarcadores séricos no serán fáciles de superar [8], [10]. Por lo tanto, los enfoques experimentales adicionales que incorporan la tecnología EM y procesamiento de muestras de suero deben ser examinados con el fin de descubrir biomarcadores Ovča clínicamente relevantes. De hecho, se han empleado métodos tales como el agotamiento de las proteínas abundantes utilizando columnas de afinidad y el fraccionamiento de la proteína para aumentar la probabilidad de descubrir especies de proteínas derivadas de tumores, que son a menudo en baja abundancia [11]. Un enfoque que sostiene un potencial significativo es el análisis del proteoma de bajo peso suero /peptidome molecular [12]. proteínas y péptidos de bajo peso molecular (LMW) a menudo se unen a las proteínas del suero de alto peso molecular, lo que prolonga la vida media de la fracción LMW en circulación [13] - [15]. De este modo, el suero proteoma de BPM representa un reservorio atractiva donde las bajas proteínas y péptidos abundantes derivados del tumor pueden ser mejor conservados y potencialmente detectados.
El desarrollo y uso de modelos animales Ovča pueden servir como ayudas suplementarias en la identificación y confirmación de predicción biomarcadores séricos. El uso de modelos animales tiene la posibilidad de reducir al mínimo algunos de la profunda variabilidad genética y ambiental a menudo se encuentra en los estudios de proteoma humano, donde las muestras de control imparciales son a menudo difíciles de obtener [16]. Tales estudios usando modelos de xenoinjerto de cáncer humano han sido publicados anteriormente [17] - [20]. El trasplante de cáncer humano en ratones inmunodeficientes es un modelo útil para el descubrimiento de perfiles proteómicos de suero o plasma que se correlacionan con la carga tumoral. Estos modelos tienen la ventaja añadida de proporcionar medios para determinar si el biomarcador de interés se deriva directamente de la célula de cáncer o es un producto de la respuesta del huésped porque se puede examinar la presencia de proteínas específicas humanos derivados de células tumorales. biomarcadores diana identificados por la EM podrían ser validados en estos modelos, lo que aumenta la probabilidad de obtener un marcador patológicamente relevantes. En consecuencia, un modelo de ratón OVCA humano se estableció en un intento de discernir proteínas derivados del cáncer de ovario en el suero utilizando descubrimiento basado en MS. Este enfoque reveló la presencia de S100A6, además de otras proteínas humanas, en los sueros de ratones con OVCA. La expresión de S100A6 se examinó en líneas celulares de cáncer y tejidos humanos procedentes de pacientes Ovča. Además, se buscó un sistema de correlacionar la cantidad de S100A6 suero y la carga tumoral en el modelo. Este último objetivo se esfuerza para empezar a abordar importantes preguntas sin respuesta con respecto a un tamaño del tumor sea necesario para permitir
de novo
detección de firmas de proteínas de la masa en la sangre. Por último, hemos tratado de validar el perfil de expresión de S100A6 en suero humano utilizando un conjunto estudio clínico bien controlado de las mujeres con cáncer de ovario tempranos y avanzados de la etapa.
Resultados
Un enfoque experimental general para el descubrimiento de las proteínas del suero de BPM con posible relevancia para OVCA humano en un modelo de ratón usando MS se representa en la Figura 1. Después de la inyección intraperitoneal (ip) de ratones con células Ovča humanos serosas SKOV-3 o control de solución salina, la sangre se tomaron muestras en diversos puntos temporales mientras se está modelando carcinomatosis temprana y progresiva. Se analizó el suero proteoma LMW para identificar proteínas específicas para, o más abundantes en, ratones portadores de cáncer. La presencia de la proteína S100A6 derivado del tumor en suero se estudió adicionalmente como un biomarcador candidato usando análisis basados en anticuerpos. La carga tumoral se correlaciona con la presencia o el nivel de proteína de suero de S100A6 en el modelo, que de ese modo se podría considerar como un biomarcador putativo. El trabajo de base para validar aún más la relevancia clínica de estos hallazgos para los pacientes Ovča fue colocada por la detección de S100A6 más abundante en el suero de mujeres con enfermedad en estadio avanzado, en comparación con la enfermedad en etapa temprana
.
Para determinar si las proteínas derivados del cáncer tienen potencial biomarcador candidato, (a) un modelo de xenoinjerto bioluminiscente, (B) eclisa, (C) de transferencia de Western, y (D) OVCA array tejido inmunohistoquímica (IHC) se utilizan. Esto fue seguido por S100A6 mediante el análisis de sueros de pacientes humanos.
Descubrimiento de Ovča asociadas proteínas séricas
La enfermedad progresó desde la siembra experimental celular neoplásica del peritoneo durante el injerto de carcinomatosis diseminada , imitando la progresión desde la regional a la lejana OVCA estadio avanzado en mujeres. Todos los ratones inoculados-Skov-3 mostró múltiples nódulos de tamaño variable, infiltrantes de tumores sólidos moreno, distribuidos por todo el peritoneo por 4 semanas después de la inoculación (p.i.). Esto fue acompañado por derrames neoplásicos en la mayoría de las cavidades abdominales de ratones inoculados-SKOV-3. Histológicamente, las masas mesentéricos estaban compuestos de una población morfológicamente variable de células epiteliales de ovario neoplásicas. Estas células se produjeron como expansibles, crecimientos papilares con trabéculas 2-3 células de espesor, o masas densamente celulares como sólidos soportados por tejido fibroso limitada (Figura 2A y B). Todos los ratones de control con solución salina inoculada se mantuvieron libres de la enfermedad.
(A) exhibe Ovča el crecimiento del tumor predominantemente sólida Representante, con evidencia de proyecciones papilares y quistes hora ocasionales (barra = 25 micras). Inserción, a mayor resolución fotomicrografía que representa al epitelio cúbico microquístico pleomórfico poligonal con anisocariosis y mitosis atípicas de núcleos de células de cáncer de ovario (barra = 50 micras). (B) del implante nódulo tumoral OVCA en uterina infundíbulo-ovárico ligamento (punta de flecha) adyacente al ovario (flecha) (bar = 25 micras). Los implantes tumorales se produjeron a lo largo de la cavidad peritoneal, peri-ovario tejidos conectivos, y ha invadido los tejidos circundantes, tales como los intestinos, el hígado y el diafragma. Hematoxilina y eosina (H & amp; E). Manchado, secciones de tejidos embebidos en parafina
Índice sueros recogidos de ratones con la fase tardía de la carcinomatosis a las 4 semanas después de la inoculación de 1 x 10
6 SKOV- 3 células Ovča humanos fueron analizados por MS y se compararon con el control de los sueros de ratón (primera de 3 cohortes de animales de estudio). se analizaron los datos para determinar péptidos /proteínas con mayor abundancia en el cáncer frente a las muestras de control (análisis de recuento espectral). En general, los análisis arrojaron identificación de alrededor de 400 péptidos correspondientes a aproximadamente 300 proteínas (base de datos de resultados de búsqueda humanos y de ratón combinados). Para determinar las proteínas con una alta probabilidad de la abundancia diferencial, los resultados del análisis de recuento espectral de la búsqueda de base de datos de proteína humana fueron filtradas utilizando software Andamios para producir proteínas con un mínimo de 10 MS /MS espectros asignado (total de todos los análisis replicados) y una diferencia estadísticamente significativa en el número de espectros asignado (cáncer de & gt; control) tal como se mide por una prueba t (valor de p & lt; 0,05), o un mínimo de una diferencia de 100% en los recuentos espectrales ((recuentos de cáncer - recuentos de control) /(cáncer de promedio y los recuentos de control) x 100%). Estos resultados se muestran en la Tabla 1.
Después de la identificación de éstos candidato diferencialmente abundante (cáncer de & gt; control) proteínas humanas, secuencias de péptidos humanos identificados por MS /MS espectros continuación, se realizaron búsquedas en contra de una base de datos del ratón para examinar si la secuencia del péptido era homóloga entre el ser humano y el ratón y para verificar la idoneidad de la llamada secuencia (o si había ambigüedad en la designación de aminoácidos). Las proteínas se clasifican por tener (1) péptidos humanos específicos solamente, (2) péptidos homólogos a humanos y ratón, y (3) tanto 1 y 2 (Tabla 1). Las proteínas identificadas por los péptidos específicos de los humanos son potencialmente de mayor valor, ya que muy probablemente se originaron a partir de las células de cáncer humano xenoinjertados.
S100A6 fue seleccionado para su posterior estudio. Además de criterios de importancia establecidos para diferenciar cáncer asociado proteínas de suero a partir de muestras de control (Tabla 1) de reuniones, S100A6 fue considerado como un candidato para una validación adicional debido a su mayor expresión en una variedad de cánceres humanos y su tamaño relativamente pequeño (10,5 kDa ). A este último respecto, S100A6 era atractivo por su potencial para ser una proteína intacta cedido por la estrategia de separación de BPM se utiliza para enriquecer para las proteínas con peso molecular inferior a ~ 25 kDa. Como se muestra en la Tabla 1, se identificaron tres péptidos S100A6; dos secuencias comunes a las versiones humana y de ratón de esta proteína (rojo y azul), fuentes y un péptido únicos para la versión humana (fuente verde) (Figura 3A). El espectro de MS /MS se utiliza para identificar el péptido humano único, LMEDLDR, se muestra en la Figura 3B. La secuencia de ratón correspondiente tiene un ácido aspártico en la posición tercera de residuos, en lugar del ácido glutámico en la secuencia humana. La presencia de este péptido humano-específica se confirmó posteriormente en un segundo análisis MS /MS realizado en muestras de suero recogidas de los ratones portadores de tumor en el tercio cohorte de animales (ver Materiales y Métodos).
(A ) alineados secuencias de ratón S100A6 representan 3 diferencias de aminoácidos entre las dos especies (líneas verticales) y humanos. Tres péptidos se detectaron mediante LC-LTQ MS /MS de portador de un tumor sueros de ratón; secuencias se muestran en color de la fuente. Los péptidos en la fuente roja y azul son homólogos de humanos y de ratón, mientras que la secuencia del péptido en la fuente verde es única para S100A6 humana, debido a la diferencia de un aminoácido. (B) espectro MS /MS del péptido S100A6 humanos específicos, LMEDLDR. Esta secuencia no se detectó en solución salina inoculados ratones de control sueros.
La expresión de S100A6 en OVCA
Un inmunoblot anti-S100A6 se llevó a cabo para confirmar la presencia de S100A6 intacta en el ratón sueros utilizados en el análisis de MS. El uso de un anticuerpo S100A6 encargo anti-humano, C1, se detectó una banda de 10,5 kDa correspondiente al peso molecular de S100A6 en sueros combinados recogieron 4 semanas p.i. de los ratones portadores de tumor utilizados para la MS inicial análisis (Figura 4A). S100A6 no se detectó en los sueros de los ratones de control de solución salina-estudio emparejado. La inmunotransferencia anti-C1 S100A6 también se realizó en series adicionales de sueros muestreada de SKOV-3 animales inyectados con células individuales con enfermedad en estadio final experimental, así como los sueros de los animales de control no tratados previamente; la banda S100A6 10,5 kDa sólo se observó en los sueros de los animales con tumores, no en los sueros control del ratón (datos no mostrados). La evidencia de expresión de la proteína S100A6 en xenoinjertos Ovča y órganos abdominales de ratones se examinó mediante inmunohistoquímica (IHC). se observó S100A6 immunolabeling en el tejido tumoral, pero no en los alrededores de mesenterio o órganos abdominales (intestino, hígado, riñón, vejiga urinaria, bazo, páncreas, útero y ovario) (Figura 4B y C).
(A) el análisis por inmunotransferencia para detectar la presencia de S100A6 en el suero agrupado en bruto a partir de ratones portadores de cáncer (1) y los ratones de control de solución salina (2). Los sueros se utiliza en la preparación de LMW fracción de proteína para el análisis de MS en el descubrimiento de biomarcadores. (B) xenoinjertos Ovča expresan S100A6 como analizados por IHC. Tumor de xenoinjerto implante en el mesenterio intestinal revela la proteína S100A6 limita a un tumor, con la falta de immunolabeling en los intestinos y el mesenterio adyacentes. sección de serie a partir de tejido se muestra en B, que se utiliza para el control de reacción IHC (C), revela la falta de inmunorreactividad cuando el anticuerpo primario S100A6 se omite de IHC. Inmunoperoxidasa, colorante de contraste hematoxilina (Bares = 50 m).
El potencial relevancia clínica de la búsqueda de S100A6 en el suero de los ratones con xenoinjertos Skov-3 se investigó adicionalmente mediante el examen de la expresión de S100A6 en otro humano OVCA las muestras de pacientes derivada mediante Western blot. En emparejado canceroso y emparejado lisados ovario normal de 2 pacientes, S100A6 estaba elevada en tejido de carcinoma en comparación con sus tejidos de ovario no neoplásicas emparejados (Figura 5A y B). las líneas celulares derivadas de OVCA humanos expresaron varios niveles de S100A6 (Figura 5C y D). Todas las células Ovča probados, excepto OVCAR-4 y la línea celular derivada de carcinoma ovárico de células claras (ACI-89-2), expresaron S100A6 sobre el nivel del fondo (ovario normal).
lisados (A y B) Emparejado de OVCA (cáncer) y tejido ovárico normal adyacente (normal) a partir de 2 pacientes Ovča fueron borrados para la expresión S100A6. SKOV-3 lisado celular se utilizó para la comparación. (C y D) la expresión de S100A6 en líneas celulares de Ovča NCI60 (Skov-3, OVCAR-3, 4 y 5), así como líneas celulares derivadas de pacientes Ovča (véase también Materiales y Métodos).
Para definir con mayor precisión la expresión S100A6 diferencial en los tejidos de pacientes humanos, Ovča examen de los tejidos malignos de ovario, borderline, benignos, no cancerosos, y se ha realizado mediante IHC. Muestras de tejido que carecen de S100A6 inmunorreactividad, similar a las observaciones en el control de la reacción negativa IHC, se consideraron negativos. La inmunorreactividad claramente por encima del control negativo fue asignado como positivo. Las muestras con pocos números de células débilmente positivas se consideraron equívoca. Entre 140 muestras Ovča malignos, 116 (83%) fueron positivos para S100A6 immunolabeling (Tabla 2). Se observó alta S100A6 incidencia positiva (más de 80%) en todos los tipos malignos de OVCA con la excepción de carcinoma de células claras, de los cuales sólo 2 de cada 4 especímenes fueron S100A6 positivo. Casi el 85% de los adenomas benignos mostraron reactividad positiva S100A6 así; la intensidad etiquetado era comparable con la de OVCA maligno. No se observó ninguna relación aparente entre la intensidad del etiquetado y la etapa del cáncer o grado. Por el contrario, los tejidos ováricos normales y el tejido no neoplásico adyacente a los tumores exhibieron etiquetado S100A6 limitada o nula. Estos resultados, que demuestra la expresión S100A6 en una variedad de líneas epiteliales de ovario derivados del paciente de células de cáncer y tejidos, establecen que la expresión de S100A6 en OVCA es bastante común. En este contexto, la búsqueda de secuencia de péptido S100A6 humano específico en el suero de ratones portadores de OVCA humanos indica que S100A6 puede tener beneficio como una proteína candidata para el seguimiento de OVCA. Además, la expresión positiva de S100A6 en OVCA benignas como malignas, en contraste con su ausencia virtual en la superficie del ovario normal, sugiere S100A6 puede ser adecuado como un marcador en imágenes de diagnóstico para ayudar a localizar y corroborar cambios proliferativos de ovario.
suero Nivel S100A6 se correlaciona con la carga tumoral OVCA
para determinar si la cantidad de S100A6 en el suero podría ser utilizado como un correlato para la estimación de la carga tumoral,
in vivo
bioluminiscente de imágenes y una se aplicaron ensayo ELISA modificado (eclisa). En primer lugar, para proporcionar estimaciones de la carga tumoral en el número de células, 35 animales fueron inyectados con un número variable de luciferasa que expresa Skov-3 células (Skov-3-Luc) y
in vivo
señales de fotones bioluminiscentes se cuantificaron (segunda cohorte , cáncer de ovario humano Modelo Animal, Materiales y Métodos). El análisis de regresión se realizó en vs. (log
10) de salida de fotones (log
10) del número de células inoculadas para producir una curva de calibración estándar (Figura 6A). Una ecuación de predicción inversa (ver Materiales y Métodos) se derivó del análisis de regresión para obtener estimaciones de los números de células, es decir, la carga tumoral predicho de la salida de flujo de fotones de animales vivos.
(A) de fotones mediciones de flujo obtenidos de los ratones que albergan números definidos de células bioluminiscente SKOV-3-Luc dentro de la cavidad peritoneal. El análisis de regresión se realizó en vs. (log
10) de salida de fotones (log
10) del número de células inoculadas para producir una curva de calibración estándar usando una ecuación de predicción inversa (ver Materiales y Métodos). Esto se utilizó para predecir la carga tumoral a partir de mediciones de flujo de fotones (véase también la figura 6C). (B) Las comparaciones de S100A6 en suero en portadores de tumor (T, círculos cerrados) y los ratones de control con solución salina inoculada (SC, círculos abiertos). Las concentraciones séricas de S100A6, probados como muestras individuales de varios ratones por eclisa (representaron como valores individuales con línea horizontal en valor de la mediana), fueron significativamente diferentes entre T vs. SC en cada uno de tres veces la prueba después de la inoculación, 9 días (p = 0,015) , 15 días (p = 0,036), y 21 días (p = 0,0031) (prueba de suma de rangos de Wilcoxon). (C) Correlación entre la estimación de la carga tumoral en carcinomatosis OVCA y concentración de S100A6 suero, medido por eclisa de los ratones portadores de tumor (r = 0,79, p & lt; 0,0001).
Para determinar si el suero niveles S100A6 intensificaron como la carga tumoral aumentó con el tiempo en el estudio, los ratones fueron inyectados con SKOV-3-Luc o solución salina (tercera cohorte, cáncer de ovario humano Modelo Animal, Materiales y Métodos). En los días 9, 15, 21 y 28 p.i., todos los ratones inoculados-Luc SKOV-3 eran ópticamente de captación de imagen para obtener la salida de fotones a partir de cánceres de crecimiento. los datos de flujo de fotones se convierten después en las estimaciones de
in vivo
carga de células tumorales. Diez animales de cada uno de los grupos portadores de tumores y de control se les extrajo sangre y se retira del estudio en cada punto de tiempo; nivel S100A6 suero se cuantificó por eclisa para todos los ratones del estudio. Las comparaciones de la concentración sérica de S100A6 de ratones portadores de tumores y controles inyectados con solución salina revelaron que, tan pronto como 9 días p.i., no fue significativamente mayor concentración de S100A6 en suero en los ratones portadores de tumores, bien antes de cualquier masa de tumor identificable estaban presentes; el nivel sérico S100A6 diferencial significativa persistió hasta el día 15 hasta el día 21 p.i. (Figura 6B). La mayoría día 28 p.i. las muestras de suero se usaron para el análisis de MS /MS, y el número de muestras de suero restantes eran insuficientes para esta comparación estadística
.
La correlación entre la carga del tumor y el nivel de S100A6 en suero en las muestras de estos mismos SKOV-3-Luc ratones inyectados se buscó siguiente. Cuando la carga tumoral (número de células) se representó frente a la concentración en suero de proteína S100A6 en estos animales, los resultados indicaron una correlación altamente significativa (r = 0,79, p & lt; 0,0001); concentración sérica S100A6 era mayor a medida que la carga tumoral aumentó con el tiempo para los animales que recibieron SKOV-3-Luc (Figura 6C). La cantidad de S100A6 en ratones de control inyectados con solución salina se mantuvo cerca de un nivel basal en todos los puntos de tiempo del estudio, por lo general que se aproxima el límite inferior de detección de S100A6 eclisa (Figura 6B, SC). concentraciones crecientes de S100A6 también se observaron en los sueros recogidos en serie a 1, 2, y 4 semanas p.i. a partir de ratones individuales dentro de la cohorte inicial de 20 ratones que recibieron la línea celular Skov-3 parental (datos no mostrados).
niveles séricos de S100A6 en cuadernos de estudio OVCA humano se relacionan con enfermedad Etapa
para determinar si había una relación entre la elevación de la proteína S100A6 y la carga tumoral en mujeres con OVCA, se realizó un experimento piloto usando un conjunto estudio clínico en humanos bien controlado de 66 muestras de diagnóstico de suero que estaba disponible para nosotros a través de los Oncoproteomics EE.UU.-ITALIA Programa. Sera se había obtenido antes de la terapia de mujeres con estadio temprano (I-IIb) y borderline OVCA (n = 23), y de las mujeres con estadio avanzado (IIc-IV) de la enfermedad (n = 43). Las inmunotransferencias, con el C1 anti-S100A6, se llevaron a cabo en un microarray de proteínas de fase inversa (RPMA) diapositiva. Usando esta técnica, se encontraron niveles de S100A6 a ser elevados estadísticamente en el suero de mujeres con enfermedad en etapa avanzada en comparación con aquellos con tumores en fase inicial (p = 0,031), lo que demuestra una asociación entre características clínicas de la mayor carga tumoral y un aumento de los niveles de S100A6 en pacientes Ovča (Figura 7).
Diagrama de dispersión muestra la intensidad relativa de los valores séricos S100A6 para las mujeres con etapa temprana (círculos abiertos, n = 23) y estadio avanzado (círculos cerrados, n = 43) OVCA. El grupo de enfermedad en etapa temprana incluye 2 tumores diagnosticados como borderline OVCA. Las medias de los valores de intensidad relativa de las concentraciones de analitos que se muestran (líneas horizontales) son significativamente diferentes para los dos grupos (p = 0,031, muestra de dos t-test), y representan relativamente mayor concentración media S100A6 en el suero de los pacientes en etapa avanzada.
Discusión
S100A6 fue identificado en el suero de los ratones con OVCA humano usando una estrategia proteómica de abajo hacia arriba basado en MS MS /en un intento por descubrir biomarcadores candidatos derivados de la masa tumoral . Se estableció el tumor-origen humano de la S100A6 para el modelo, y la concentración sérica de S100A6 correlacionada con la cantidad de cáncer presente experimental. Además relevancia clínica se demostró a través del descubrimiento de las posibilidades de S100A6 en suero se correlaciona con la carga tumoral utilizando conjuntos de estudios clínicos humanos.
Durante la fase de descubrimiento, se empleó un método de separación de suero para aislar el proteoma LMW para enriquecer las proteínas /péptidos que circula en abundancia relativamente baja, frente a la complejidad de todo el proteoma de suero. El modelo de xenotrasplante de células de ratón Skov-3 humana proporciona la oportunidad de evaluar las diferencias entre especies en el esfuerzo para clasificar proteoma asociada al cáncer, ya sea derivado de tumores (humanos) vs. respuesta del huésped (ratón). Más en profundidad están garantizados estudios de validación clínica para examinar el potencial de suero S100A6 para servir como un biomarcador candidato para la evaluación de las mujeres con OVCA, en particular para el seguimiento de recurrencia. Esta premisa se apoya en las siguientes pruebas: (1) la presencia de una secuencia específica de péptido-humana de S100A6 en el suero, (2) la detección de la expresión de la proteína S100A6 en tumores experimentales, pero no en los tejidos circundantes ratón no neoplásicas, (3) una correlación positiva y directa entre la concentración en suero S100A6 y la carga tumoral en el modelo de xenoinjerto, (4) la demostración de la expresión de S100A6 elevada en tejidos y líneas celulares de pacientes Ovča, pero rara vez en ovario normal, en este y otros estudios [21], [22 ], y, finalmente, (5) la elevación significativa de la sustancia analizada en el suero de mujeres con OVCA etapa avanzada vs. mujeres con enfermedad en estadio temprano. La limitación de la selección inicial de los ratones a la línea celular Skov-3 en este caso, por tanto, no se opone a la identificación de un posible biomarcador sustituto clínica para su posterior validación. proteínas asociadas a los tejidos Ovča humanos adicionales también fueron reportados en suero utilizando este enfoque, y estos pueden ser probados más de potencial biomarcador candidato usando la estrategia aplicada aquí.
S100A6 fue perseguido para la validación inicial como un biomarcador de suero candidato debido a su asociación con la progresión del cáncer [22], [23]. S100A6 es una pequeña proteína de unión de calcio que pertenece a la familia de proteínas S100. Los cerca de 25 miembros de la familia S100 se caracteriza por 2 estructuras EF-mano y es probable que tenga la función de sensor de calcio [24]. proteínas S100 se han implicado en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación y la señalización intracelular, aunque sus funciones exactas quedan por definir aún más [24] - [27]. Con respecto a la S100A6, su expresión se encuentra normalmente en los fibroblastos y células epiteliales [28], y elevada S100A6 se ha informado en un número de tipos de cáncer humanos, incluyendo carcinomas de colon, páncreas, mama, ovario, pulmón y glándula tiroides [29] - [35]
Hay informes contradictorios sobre el papel S100A6 juega en el cáncer.. Vimalachandran et. Alabama. [29] estudiaron el patrón de expresión de S100A6, ya que tenía que ver con el resultado clínico en cáncer de páncreas y de expresión S100A6 fue un factor pronóstico negativo. Alta, específicamente nuclear, la expresión de S100A6 estaba asociada con un mal pronóstico. Además, un incremento escalonado de la S100A6 durante la carcinogénesis pancreática ha informado [36]. Por el contrario, los niveles elevados de S100A6 disminuyó la movilidad de las células de osteosarcoma y se asociaron con una disminución de las metástasis clínicamente evidentes [37]. Del mismo modo, el aumento de expresión S100A6 estaba asociada con un beneficio de supervivencia para no pequeñas de cáncer de pulmón de células [35]; S100A6 se demostró en los sueros de pacientes con cáncer de pulmón 2 ', y en el derrame pleural de uno. En el presente estudio, hemos extendido el valor de S100A6 incluirlo como un biomarcador de suero OVCA mediante la demostración de expresión positiva en el OVCA humana mediante inmunohistoquímica, así como una asociación entre el nivel de suero de S100A6 y la carga tumoral en ratones y pacientes humanos. El hecho de que S100A6 es elaborado por un número de cánceres humanos, sugiere que su uso como un único biomarcador puede encontrar posibles incidencias de falsos positivos, similar a CA-125. Por lo tanto, la incorporación de S100A6 en un panel de biomarcadores de cáncer representa un enfoque lógico para ser perseguido.
La baja incidencia de OVCA hace establecer y validar biomarcadores clínicos utilizando muestras humanas difícil. Se estima que sólo 1 de cada 2500 mujeres post-menopáusicas a ser afectados por OVCA al año [38], [39]. Debido a esta baja incidencia, cribado de la población requiere un gran número de pacientes y por lo tanto es muy caro para OVCA descubrimiento de biomarcadores y validación. Por esta razón el uso de un modelo animal puede ser un medio rentable de proporcionar los datos preclínicos para justificar un gran estudio de validación clínica. Utilizando modelos animales Ovča para este fin requiere la fidelidad a ambos objetivos experimentales y recapitulan las características cardinales de la biología de la enfermedad humana.