Extracto
Antecedentes
La inflamación crónica se observa con frecuencia en el análisis histológico de muestras prostáticas malignas y no malignas. Es un factor de apoyo para la sospecha de enfermedades de la próstata y su progresión y una causa principal de las pruebas de PSA falsos positivos en la detección del cáncer. La hipótesis de que la inflamación induce anticuerpos, que pueden ser biomarcadores útiles. El objetivo fue identificar y validar la próstata inflamación asociada autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer de próstata y evaluar la expresión de autoantígenos correspondientes.
Métodos
piezas de prostatectomía radical de pacientes con cáncer de próstata (N = 70) fueron clasificados en grupos de alto y bajo de la inflamación de acuerdo con la cantidad de linfocitos infiltrantes de tejidos. Las correspondientes muestras de suero de sangre antes de la cirugía fueron examinados para detectar autoanticuerpos utilizando una matriz de proteínas de baja densidad. autoantígenos seleccionados fueron identificados en tejido de la próstata y su patrón de expresión se analizaron por inmunohistoquímica y qPCR. El perfil de autoanticuerpos identificados se cotejará en un conjunto de muestras independientes (N = 63) utilizando el Luminex con perlas tecnología de matriz de proteína.
Resultados
detección matriz de proteínas identificó 165 autoanticuerpos diferencialmente abundante en el suero de alta en comparación con los pacientes de bajo inflamación. El patrón de expresión de los tres antígenos correspondientes se establecieron en el tejido benigno y el cáncer por inmunohistoquímica y qPCR: Spast (Spastin), STX18 (sintaxina 18) y SPOP (tipo speckle proteína POZ). De estos, Spast fue significativamente mayor en el tejido prostático con alta inflamación. Los tres autoantígenos se expresaron diferencialmente en los tumores de próstata resistentes a la castración primaria y /o cuando se analizaron en una micromatriz de tejido inflamación-independiente. La validación cruzada del perfil de la inflamación de autoanticuerpos en un conjunto de muestras independientes utilizando una matriz de proteína de Luminex con perlas, recuperado 51 de los autoanticuerpos que discriminan significativamente. Tres autoanticuerpos se upregulated significativamente en ambas pantallas, Mut, RAB11B y CSRP2 (p & gt; 0,05)., Dos, SPOP y ZNF671, cerca de la significación estadística (p = 0,051 y 0,076)
Conclusiones
Ofrecemos pruebas de un perfil de autoanticuerpos-inflamación específica y confirmamos la expresión de autoantígenos correspondiente en el tejido prostático. Esto apoya la evaluación de autoanticuerpos como marcadores no invasivos de la inflamación de la próstata
Visto:. Schlick B, P Massoner, Lueking A, Charoentong P, M Blattner, Schaefer G, et al. (2016) Suero de próstata autoanticuerpos en la inflamación crónica en pacientes con cáncer de próstata. PLoS ONE 11 (2): e0147739. doi: 10.1371 /journal.pone.0147739
Editor: Aamir Ahmed, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 28 Julio, 2015; Aceptó 7 de enero de 2016; Publicado: 10 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Schlick et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante están disponibles en el apoyo de sus archivos de información en papel y los datos
Financiación:. el estudio fue apoyado por COMET K1 Centro Oncotyrol-Centro para la medicina personalizada, financiado por la Agencia de Promoción de la Investigación de Austria (FFG) y la Fundación futuro de el País del Tirol, y Protagen AG. ONCOTYROL GmbH, Protagen AG y Targos Patología Molecular GmbH proporcionaron apoyo en forma de salarios de los autores [BS, PM, GS], [AL, KM, CT, PA, SM, PSK], [DZ, MK], pero no tenía ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Todos los demás autores declaran no tener ningún interés en competencia. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. El estudio fue apoyado por COMET K1 Centro Oncotyrol-Centro para la medicina personalizada, financiado por la Agencia de Promoción de la Investigación de Austria (FFG) y la Fundación futuro del País de Tirol y Protagen AG. Petra Massoner, Georg Schaefer y Bettina Schlilck fueron empleados por ONCOTYROL. Angelika Lueking, Klaus Marquart, Carmen Theek, Peter Amersdorfer, Stefan Müllner y Peter Schulz-Knappe fueron empleados por Protagen AG. Stefan Müllner es el co-fundador y CEO de Protagen AG. Dirk Zielinski y Matthias Kirchner fueron empleados por Targos Patología Molecular GmbH. Petra Massoner está afiliado actualmente como un compañero del DAAD con Roche Diagnostics GmbH, sin embargo, con los datos incluidos en el estudio se generaron antes de que la afiliación, estudio presentado en este documento es independiente de la beca o cualquier otro trabajo relacionado con Roche Diagnostics GmbH. Protagen AG tiene una patente sobre "marcador Secuencias para el diagnóstico de cáncer de próstata, y el uso del mismo". No hay productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La glándula prostática es un sitio frecuente de benigna y la enfermedad maligna con la edad como el principal factor de riesgo [1, 2]. Como aspecto negativo de la constante aumento de la esperanza de vida de la incidencia de enfermedades de la próstata, como el cáncer de próstata, hiperplasia de próstata (HBP) y la prostatitis va en aumento, así y estas enfermedades representan un problema médico y social creciente, sino también una carga económica cada vez mayor [3- 6]. Con frecuencia, el análisis histopatológico de biopsias de próstata y especímenes quirúrgicos revela inflamación asociada con la enfermedad de la próstata, en la mayoría de los casos una asintomática, la inflamación "crónica" caracteriza por alteraciones histológicas e infiltrados de células inmunes [7-10]. La inflamación crónica puede ser una de las causas de la progresión de la enfermedad de la próstata y un factor importante que contribuye a falsos positivos prostático específico del cáncer de próstata antígeno (PSA) [11-15].
La fuente de la inflamación intraprostatic aún no es totalmente al descubierto, infección, autoinmunidad, lesión de las células, las variaciones hormonales, dietéticos o factores podrían contribuir. Por mucho que la causa de la prostatitis es restante un reto para las posteriores investigaciones, su relevancia para los procesos patológicos está claro [16]. Los estudios sugieren una contribución de la inflamación crónica a la carcinogénesis y el desarrollo de enfermedad de la próstata [17, 18]. En particular, la atrofia inflamatoria proliferativa (PIA) que se considera una lesión precursora del cáncer de próstata, se asocia con infiltrados de células inmunes inflamatorias, que estimulan la proliferación, apoyar la carcinogénesis a través de estrés oxidativo mejorada y daño celular y pionero degeneración maligna [19]. Aunque la mayoría de los estudios se dirigieron al impacto de la inflamación en la carcinogénesis y la progresión del tumor, este fenómeno no se limita a cáncer, infiltrados de células inmunes también se encuentran frecuentemente en hiperplásico o incluso en el tejido prostático histológicamente normales [17].
A la luz de la necesidad de continuar con los esfuerzos que se aclare el impacto de la inflamación en la enfermedad prostática, los biomarcadores de fácil acceso para la inflamación de la próstata sería una gran ayuda. Por otra parte, este tipo de marcadores que permiten una forma menos invasiva para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de monitoreo de la prostatitis crónica se requiere para mejorar la atención al paciente, aumentar la especificidad de la prueba de PSA para la detección del cáncer de próstata y dar lugar a una mejora de la gestión de cáncer de próstata. En este contexto autoanticuerpos son tipos importantes de moléculas marcadoras, ya que están vinculados a la actividad del sistema inmune. Los anticuerpos tienen propiedades ideales como marcadores potenciales, que son muy estables y no sufrir variaciones a corto plazo en la concentración, son fácilmente accesibles a través de las muestras de suero o plasma y en cada laboratorio clínico existen métodos de detección altamente sensibles disponibles para su cuantificación. Para los pacientes de cáncer se demostró convincentemente que una respuesta inmune anti-tumor puede ser activado [20, 21]. Los autoanticuerpos contra antígenos del cáncer se han identificado en pacientes con entidades de tumores sólidos diferentes, tales como los tumores de instancia de la mama [22, 23], de cabeza y cuello [24, 25], pulmón [26, 27], el esófago [28], colon [29] y de próstata [26, 30, 31].
Recientemente, se emplearon microarrays de proteínas para el perfil de autoanticuerpos en la sangre de pacientes con cáncer de próstata y los controles sin cáncer. Hemos identificado un panel de próstata cáncer asociado autoanticuerpos [31]. La extensión de estos estudios que aquí presentamos la identificación y validación de autoanticuerpos asociados con la próstata infiltrados de células inmunes en pacientes con cáncer de próstata. Además, se evaluó el patrón de expresión de autoantígenos en el tejido prostático maligno y no maligno correspondiente y preguntamos si las mutaciones podrían dar lugar a autoanticuerpos.
Material y Métodos
retrospectivo de cohortes muestra
las muestras de suero se obtuvieron del cáncer de próstata Biorecursos del Departamento de Urología de la Universidad médica de Innsbruck. Las muestras de sangre se habían recogido en el marco del programa de detección precoz del cáncer de próstata del Tirol y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso [32]. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Innsbruck (Estudio 3174 AM, la enmienda 2). Todas las muestras se obtuvieron antes de la cirugía prostatectomía radical de pacientes con cáncer de próstata clínicamente localizado confirmado por biopsia, que eran por lo menos 40 años de edad y que no habían recibido tratamiento previo de cáncer de próstata. La selección de pacientes para los casos de baja y alta de la inflamación se basó en el análisis de las muestras enteras glándula prostática para detectar la infiltración de linfocitos. Una cohorte de 70 pacientes (38, 32) de infiltración bajo alta para el estudio de cribado y 63 pacientes (33, 30) de infiltración bajo alta para el estudio de validación cruzada fueron reclutados.
autoanticuerpos perfiles
Los ensayos utilizados para el perfil de autoantígeno, una matriz de proteína de baja densidad y una matriz de proteína Luminex-talón, respectivamente, se establecieron como técnicas ampliamente aplicables y no específicamente para el cáncer de próstata solamente. Considerando que la técnica proteína matriz se aplicó para el estudio de detección inicial, se utilizó la técnica de Luminex-grano establecida después de un estudio de validación cruzada independiente.
La selección de proteínas de autoantígeno incluidos se basa en nuestras pantallas de autoanticuerpos anteriores en la próstata cáncer [31] y las enfermedades autoinmunes [33-35], y en autoantígenos publicados encuentran asociados con el cáncer [36-42]. Además, la eficacia de la producción de proteínas, calidad de las proteínas, y los criterios de rendimiento del ensayo fueron considerados para la selección final de las proteínas de autoantígeno. Se seleccionaron 4012 proteínas de la matriz de proteínas, proteínas 3061 para la matriz de proteína Luminex-perla. paneles de autoantígeno se enumeran en la información de apoyo (S1 Tabla). El ensayo de proteína del grano se agrupan en 8 subconjuntos como el número máximo disponible de forma individual, codificados por colores LuminexMagPlex
TM (perlas Luminex, MV's-Hertogenbosch, Países Bajos) es de 500. Se estableció el ensayo de autoanticuerpos Luminex-grano para una amplia aplicación, independiente de la próstata inicial baja /alta inflamación resultados de la prueba y por tanto no coincidir exactamente con el panel de autoantígeno inicial. Sobre la base de las correspondientes identificaciones de genes, el 84% de las proteínas de autoantígeno del ensayo Luminex con perlas también estuvieron representados en el microarray de proteínas.
autoantígeno proteínas se expresaron en
E
.
coli Opiniones y proteínas recombinantes se purificaron usando un procedimiento de purificación por afinidad de His-tag. Generación de microarrays de proteínas planas se llevó a cabo como se describe anteriormente [31]. Brevemente, las proteínas fueron vistos por cuadruplicado en las diapositivas de FAST-nitrocelulosa recubierto (GE Healthcare). se añadieron ratón y IgG humanos a diferentes concentraciones para ser utilizados como controles de detección inmunológico y para la normalización de datos. Una estación automatizada (HS 4800 Pro, Tecan) se utilizó para realizar el análisis de microarrays de autoanticuerpos. diapositivas de matriz se bloquearon con 2% (w /v) de suero bovino (BSA) en TBS que contiene 0,1% (v /v) de Tween 20 (TBST) y se añadieron muestras de suero de sangre en una dilución 1: 100 en 2% (w /v) BSA /TBST. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 16 horas secundario (ratón-anti-humano-IgG, 1: 5000, Sigma) y terciario (burro marcado con Cy3 anti-IgG de ratón, 1: 500, Jackson ImmunoResearch) los pasos de incubación de anticuerpos se llevaron a cabo en 2% (w /v) BSA /TBST a temperatura ambiente durante 1 h. Después de cada etapa de incubación, los portaobjetos se lavaron 3 veces con TBST. arrays de proteínas procesadas fueron digitalizadas en un lector de microarrays confocal (ScanArray 4000, Perkin Elmer Life Science) y se analizaron usando el software GenePix Pro 6.0 microarrays de análisis de imágenes (Molecular Devices).
La forma de Luminex-grano para el perfilado autoantígeno era establecida, ya que tiene varias ventajas en comparación con la técnica de matriz de proteína utilizada inicialmente como el rango dinámico más alto, más bajos coeficientes de variación, mayor estabilidad debido a la unión covalente de proteínas y un mejor rendimiento en el análisis de alto rendimiento. Para la matriz autoantígeno grano se seleccionaron 3061 autoantígenos. Sus etiqueta de afinidad proteínas recombinantes purificadas se unen covalentemente al color carboxilado magnéticas codificadas MagPlex
TM perlas de microesferas siguiendo el protocolo del fabricante (Luminex). Para cada reacción de acoplamiento sola hasta 12,5 g de antígeno y 8,8 x 10
Se han usado 5 cuentas codificadas de forma individual. La eficiencia de acoplamiento y la estabilidad del grano fueron monitoreados. Un subconjunto de cuentas consistió en hasta 384 diferentes cuentas recubiertas de antígeno y ocho bolas de control. Debido a la cantidad total de los antígenos, se establecieron ocho subconjuntos diferentes y se utilizaron para los análisis. cuentas de Proteína recubierto se distribuyeron en placas de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron con diluido (1: 100) de muestras de suero durante 22 horas a 4 ° C. En cada placa de ensayo, se midieron tres sueros de referencia que sirve como control de calidad. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado. anticuerpos humanos unidos se cuantificaron por sondeo con phytoerythrin (PE) marcado con anticuerpo de detección anti-humana (cabra anti-humana-PE, Jackson /Dianova), seguido de varios ciclos de lavado y medición de la señal fluorescente en un dispositivo FlexMap3D (Luminex) (DD puerta de 7,500 a 15,000; tamaño de la muestra: 80 l; 1000 eventos por zona del talón; tiempo de espera de 60 segundos)..
datos de pre-procesamiento y análisis bioestadístico
Planar arrays de proteínas
Después de fondo mediana de la resta, la intensidad media de fluorescencia de 4 puntos replicadas se calculó para cada autoantígeno y normalizado a los controles de IgG manchados. Puntos de corte se determinaron de forma individual para cada autoantígeno y calculan como la intensidad de la señal media de la cohorte bajo el control de la inflamación más 3 desviaciones estándar. muestras de cohortes de alta inflamación con valores por encima de la línea de corte se clasificaron como positivos y todos los antígenos fueron ordenados de acuerdo al número de muestras positivas descendente. aumento N veces o disminución de un autoanticuerpo específico se determinó sobre la base de la intensidad media de la señal normalizada en el alta en comparación con la cohorte bajo la inflamación. Ranking de los mejores marcadores candidatos se basó en factor de cambio y corregida p-valor.
grano de arrays de proteínas.
La intensidad de fluorescencia media del grano medido para cada autoantígeno se utilizó para los cálculos posteriores. En raros casos en que se recuperaron menos de 10 granos para la medición, este valor se establece en falta. Estos valores fueron sustituidos por el valor medio de este autoantígeno medido en todas las muestras. Autoantígenos con valores que faltan más de 20% se excluyeron del análisis adicional. Después de la transformación log 2 cuantil normalización [43, 44] se utilizó para normalizar las muestras en cada plato individual.
La clasificación de las cinco mejores autoanticuerpos identificados realizan con la técnica de bolas de serie para la diferenciación de la baja y las cohortes de alta inflamación se basó en un modelo de regresión logística con la variable grupo (de mayor a menor inflamación /) como la variable dependiente y los valores de fluorescencia medias de los autoanticuerpos como los factores que influyen. P-valores para los factores que influyen individuales se determinaron con base en la prueba de Wald, y, además, estimaciones de los parámetros y se calcularon los respectivos intervalos de confianza del 95% (IC) de dos caras. La odds ratio (OR) se dan junto con los respectivos intervalos de confianza del 95% por las dos caras. La clasificación de rendimiento fue evaluado basado en la sensibilidad, la especificidad y los valores de AUC que se lograron con este modelo [43, 45]
Funcional anotación y análisis de vías
Después de la cartografía de las 165 principales autoanticuerpos a prueba positiva con el microarray de proteínas de los genes, se obtuvo un conjunto de 136 genes y se utiliza para el análisis de genes ontología. Funcional anotación de la agrupación se realizó utilizando la base de datos DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) [46, 47].
Tejido de microarrays (TMA) e inmunohistoquímica
Para la construcción de un microarray de tejido (inflamación-TMA) de formalina y parafina fijado incrustado muestras de tejidos humanos (n = 70) se presentan cantidades altas o bajas de linfocitos infiltrantes de tejidos fueron seleccionados de la cohorte de cribado de autoanticuerpos. Características clínicas y patológicas se resumen en la Tabla 1 en la columna "Cohorte de detección". El uso de muestras archivadas derivadas de piezas de prostatectomía radical obtenidos en el Hospital Universitario de Innsbruck fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Innsbruck. Para cada caso de tres núcleos de tejido de cáncer y tres núcleos benignos con un diámetro de 0,6 mm se troquelan del tejido del donante y se transfieren al receptor TMA bloque [48]. El TMA se ensambló usando un arrayer manual de tejidos (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Basal p63 marcador de células tumorales y marcador de células α-metilacil-CoA racemasa (AMACR) tinciones utilizan para controlar el diagnóstico histológico y Spast, STX18 o SPop tinciones, respectivamente, se llevaron a cabo en un dispositivo de tinción Descubrimiento-XT (Ventana, Tucson, AZ) utilizando protocolos estándar de instrumentos. anticuerpos diana, proveedores, números de artículo, y las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: anti-Spast, Atlas anticuerpos (Estocolmo, Suecia),#HPA017311, 1:50; anti-STX18, Atlas-anticuerpos,#HPA003019, 1: 150; anti-SPOP, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO),#SAB1406659, 01:50; anti-p63, Sigma-Aldrich,#P3362, 1: 200; anti-AMACR, Dako (Viena, Austria),#M3616, 1: 200, anti-CD45, Dako,#M0701., 1: 300
Evaluación de la intensidad de la tinción inmunohistoquímica fue supervisada por un experimentado uropathologist (GS). Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio Axio Imager Z2 (Zeiss) y el software TissueFAXS (TissueGnostics). análisis inmunohistoquímico cuantitativo se realizó utilizando el software de análisis de inmunohistoquímica HistoQuest (TissueGnostics). Para cada TMA detectar la intensidad media y el porcentaje de células teñidas positivamente se evaluaron y una puntuación se calcula multiplicando los dos valores para cada TMA básico. Resultado valores medios se calcularon a partir de tres cáncer y tres núcleos de tejido benigno de cada paciente. se utilizó la prueba U de Mann Whitney para el análisis de las diferencias entre los dos grupos.
A segunda TMA (Targos-TMA) que comprende 111 muestras de tejido de próstata histológico normal (BE), hiperplasia de próstata benigna (BPH), próstata carcinoma (CA), así como tumores refractarios castración clínicamente diagnosticada (CRPC), se construyó y se tiñeron como se describe anteriormente. El uso de estas muestras de tejido derivadas de cirugías de prostatectomía radical en el Hospital de Kassel fue aprobado por las juntas de revisión institucional. Tinciones fueron evaluadas por un patólogo independiente (M.K.), utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo (H-Score), que combina cuatro categorías de intensidad con el porcentaje estimado de células teñidas [49]. Se utilizó la prueba U de Mann Whitney para el análisis de las diferencias entre los grupos.
aislamiento de ARN y qPCR
ARN total fue extraído de las zonas benignas y malignas de secciones de tejido congeladas de ambos grupos de pacientes (alta /bajo la inflamación, n = 66) usando el kit de AllPrep ADN /ARN Micro (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania). Las concentraciones de ARN y la pureza se determinaron por espectrofotometría. Transcripción inversa (RT) se realizó en 500 ng de ARN total usando iScript seleccione kit de síntesis de ADNc (Bio-Rad, Hercules CA, EE.UU.) y cebadores hexámeros aleatorios (Promega, Madison WI, USA). QPCR (40 ciclos) se realizó por triplicado utilizando 8 ng equivalentes de ARN total de cDNA para cada reacción de 10μl. Se utilizaron los siguientes ensayos TaqMan (Applied Biosystems, Foster CityCA, EE.UU.): PTPRC, Hs04189704_m1; STX18, Hs01099207_m1; SPOP, Hs00737433_m1; Spast, Hs00208952_m1; TBP, Hs00427620_m1. expresión del gen diana se normalizó a la PDD gen de mantenimiento. La relación de expresión relativa (R) se calcula en función de la eficiencia de ensayo Taqman de gen diana y el gen de referencia y la desviación ciclo umbral (Ct) de cada muestra a una muestra de control (calibrador, cDNA mezcla de 3 benigna y 3 secciones de tejido malignos, 20 ng qPCR entrada) utilizando la siguiente fórmula:. R = [E
target ^ Ct (calibrador-muestra)] /[E
referencia ^ Ct (calibrador-muestra)] [50]
Buscar para las mutaciones SPop
Cincuenta y tres muestras de ADNc derivadas de aislamiento de ARN de muestras de alta /baja la inflamación del tejido descritos en el párrafo anterior se utilizaron para la pantalla mutación SPOP. Un par de cebadores (Eurofins GTM Operon, Ebersberg, Alemania) que flanquean la región de mutaciones recurrentes SPop fue diseñado utilizando el software de código abierto Primer 3: Desvío, 5'-AAGGGTTCCAAGTCCTCCAC-3 '; Rev, 5'-CGGCACTCAGGAACCTTTAC-3 '[51]. la amplificación PCR se realizó en 100 ng de equivalente de ARN total con Taq ADN polimerasa (Peqlab, Erlangen, D) en un total de 100 pl, la aplicación de las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 2 min; 40 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 62 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 1 min; elongación a 72 ° C durante 7 min. PCR cantidad y tamaño del producto se comprobó en un 1,2% de agarosa de Flash Geles (Lonza, Rockland, EE.UU.). ADN fue purificado utilizando el kit de extracción de Qiagen PCR y secuenciado utilizando los mismos cebadores de acuerdo con un protocolo estándar de secuenciación de Sanger (Mycrosynth, Balgach, CH).
Dado que la frecuencia de mutaciones SPop detectado fue significativamente menor que el reportado en la literatura [51], los resultados se confirmaron por el método descrito originalmente por Blattner et al. [52], se aisló el ADN de las zonas benignas y malignas de secciones de tejidos congelados utilizando el Kit AllPrep ADN /ARN Micro. Después de un primer paso de amplificación pre-PCR para enriquecer las regiones objetivo, un análisis de alta resolución de fusión (GRH) se llevó a cabo. Este ensayo se dirige a los exones 6 y 7 del gen SPOP que contiene todas las mutaciones detectadas anteriormente en el cáncer de próstata (aminoácidos 80 a 106 y aminoácidos 120 a 140). La muestra que mostró un cambio notable en la curva de fusión fue expulsado por secuenciación de Sanger para confirmar y precisar su alteración.
Resultados
niveles de autoanticuerpos en suero son elevados en pacientes con cáncer de próstata con células inmunes infiltración de la próstata
en un intento de identificar la inflamación crónica de la próstata autoanticuerpos asociados, los pacientes con cáncer de próstata que muestran un bajo o un alto número de infiltración de células inmunes en sus piezas de prostatectomía radical se sometieron a análisis. Con el fin de identificar las cohortes de pacientes de alto y bajo de inflamación, nos aprovechamos de la cantidad de infiltración de células inmunes a lo largo de toda la próstata. Para cada paciente veinte a treinta diapositivas de tejidos que representan diferentes áreas de la próstata se tiñeron para el pan CD45 marcador leucocitario para definir los linfocitos infiltrantes de tumor. Un uropathologist experimentado realizó la clasificación en dos grupos (alto-bajo de inflamación /) de acuerdo con un sistema de clasificación histopatológica de la inflamación crónica de la próstata [53]. Las muestras de pacientes con nula o leve inflamación se especificaron como "grupo de la inflamación baja" y aquellos con inflamación moderada y alta como "grupo de alto inflamación". Los parámetros clínicos como la edad, los marcadores de inflamación proteína C-reactiva (PCR), la puntuación de Gleason, volumen prostático, PSA y PSA libre se distribuyen por igual entre los grupos inflamación de bajo y alto (Tabla 1, Figura S1).
los perfiles de autoanticuerpos en suero de 38 de alto y 32 bajo la inflamación inflamación (de control) de los pacientes se obtuvieron de muestras de suero sanguíneo correspondiente antes de la cirugía que emplean una pantalla de matriz de proteína recombinante 4012 (figura 1A). Selección del panel de ensayo de antígeno se basa en la propia y informó datos sobre autoantígenos asociados con el cáncer de próstata, otros tipos de cáncer y enfermedades relacionadas con la inflamación, tales como la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico, respectivamente [31, 36-42] (S1 Tabla). se detectaron autoanticuerpos contra autoantígenos 3919 en al menos uno de los pacientes y el número de pacientes dieron positivo para autoanticuerpos que corresponden a un autoantígeno individuo varió de 0 a 69 de 70 (S1 Tabla). Teniendo en cuenta el número de muestras positivas en ambos grupos genera una lista de 15 autoanticuerpos más diferente presente en el alto en comparación con el grupo de bajo inflamación (Fig 1B). Los autoanticuerpos de alta clasificación contra Spastin (Spast, giI40806168) y proteínas POZ de tipo speckle (SPop, giI56117827) estaban presentes en 37% y 42% de los sueros derivados de pacientes de alto inflamación mientras detectable en menos de 3% y el 10% de la sueros de pacientes bajo control de la inflamación. Evaluación del factor de cambio para cada una de las 997 autoanticuerpos en el alto en comparación con el grupo de bajo control de la inflamación, reveló aumentado significativamente la abundancia (p & lt; 0,05) de 165 autoanticuerpos en la cohorte de los altos de inflamación pacientes (figura 1C, S2 Tabla). Ninguno de ellos se determinó exclusivamente dentro del grupo de alto inflamación. Curiosamente, el nivel de intensidad de un solo autoanticuerpos (unión al antígeno FEZF2, giI157388917) se redujo significativamente (log2-foldchange: -2.66, p-valor: 0,002). En el alto en comparación con el grupo de bajo control de la inflamación
Un diagrama de flujo de la estrategia utilizada para la detección y la validación cruzada de autoanticuerpos (AAB) firmas asociada con la inflamación prostática crónica. piezas de prostatectomía radical se clasificaron en dos grupos (alto-bajo de inflamación /) en función del grado de infiltración de células inmunes en toda la próstata. Las correspondientes muestras de suero de sangre antes de la cirugía se analizaron para autoanticuerpos (AAB) utilizando una matriz de proteína plana (cribado, n = 70). Un estudio de validación cruzada probar la robustez del panel AAB identificado se basa en la tecnología Luminex-talón array de proteínas (de validación cruzada, n = 63). Se utilizó la comparación estadística de los perfiles de autoanticuerpos en suero en los grupos de bajo y alto de inflamación para identificar y validar diferencialmente abundantes OAA. Se establecieron los patrones de expresión de tejido de la próstata y la expresión en diferentes etapas de la progresión del cáncer de próstata durante tres autoantígenos seleccionados correspondientes (AAGS). B carta de bar para las observaciones clasificadas positivamente de los 15 autoanticuerpos detectados diferencialmente más alta en el grupo de la inflamación en comparación con el grupo de la inflamación baja. Los datos se expresan como porcentaje del número total de muestras positivas de cada grupo. C Cálculo del factor de cambio para cada autoanticuerpo reveló un aumento significativo de 165 antígenos en cáncer de alta inflamación de la próstata (panel superior derecho, p & lt; 0,05, el cambio & gt veces; 2, Mann-Whitney) y una disminución de sólo una (panel superior izquierdo ). Representación gráfica D de los diez mejor clasificados grupos funcionales asignados para la inflamación asociada autoanticuerpos utilizando la herramienta de anotación funcional DAVID. El tamaño de la barra corresponde al porcentaje de genes identificados correspondientes relacionados con una categoría funcional específica (P & lt; 0,05).
Nos preguntamos si los 165 autoanticuerpos mejoradas significativamente por la inflamación crónica se asocian con grupos funcionales distintos y Por lo tanto, les asigna a sus genes correspondientes para realizar una agrupación de anotación funcional utilizando la base de datos DAVID. Se identificaron varias funciones moleculares y procesos biológicos enriquecidos. De los diez primeros términos de anotaciones "de localización de proteínas" forma el clúster más grande que contiene 14 genes asociados que codifican proteínas implicadas en el tráfico vesicular (GDI1, MYH9), endo (CDC42) y exocitosis (STX18), la cromatina vinculante (CHMP5) y T citotóxicos activación células beta (CTLA) .El grupo "organización subunidad complejo macromolecular" se compone de los genes necesarios para la reparación del ADN (SF3B3), la síntesis de proteínas (eIF2a), la proliferación de células T (FADD) y microtúbulos desmontaje (STMN1, Spast). En general, se observó que los autoanticuerpos excesivamente altos de inflamación en pacientes estaban dirigidos principalmente contra los antígenos estructurales y proteínas asociadas proliferación celular (Figura 1D, Tabla 2).
Antígenos de autoanticuerpos derivados del suero se expresan en la próstata
Para dilucidar si los antígenos de autoanticuerpos identificados se expresan y posiblemente dysregulated en el tejido de la próstata, se investigó el patrón de expresión de proteínas diana diferentes. Para que los tres antígenos candidatos, Spastin (Spast), de tipo moteado proteína POZ (SPOP) y sintaxina 18 (STX18), fueron seleccionados de acuerdo a los siguientes criterios: (i) los autoanticuerpos se encuentran entre la parte superior los asociados con la inflamación diferencialmente abundantes de acuerdo a los valores de p y doble cambio (S2 Tabla); (Ii) anticuerpos para IHC están disponibles comercialmente y los niveles de antígeno correspondientes son suficientes para la detección inmunohistológica de acuerdo a la proteína humana Atlas (www.proteinatlas.org); (Iii) había sido informado de la asociación con diferentes tipos de cáncer (Tabla 3). Un microarray de tejido incluyendo muestras de tejido de pacientes de alto y bajo de inflamación de la pantalla de autoanticuerpos se generó y se utiliza para la detección inmunohistoquímica de estas proteínas autoantígenos.
Spast, SPOP y STX18 se encontraron expresado en el epitelio del benigna y las áreas de cáncer en ambos grupos de pacientes. La cuantificación de la intensidad de inmunotinción reveló un aumento significativo de la expresión Spast en el alto inflamación en comparación con muestras de tejido bajo la inflamación de la próstata. Sin embargo, SPop y STX18 inmunorreactividades se inalterada entre muestras de pacientes de alta y baja la inflamación (Figura 2A).
Un tinciones inmunohistoquímicas de tejido microarrays puntos representativos de cohortes de pacientes de alto y bajo de inflamación. Spast, STX18 y SPOP se expresan en el epitelio de las áreas benignas (BE) y el cáncer (CA) de ambas cohortes. El análisis cuantitativo se realizó utilizando el software de análisis de inmunohistoquímica HistoQuest (TissueGnostics). Una puntuación se calcula multiplicando la intensidad de tinción y el porcentaje de células teñidas positivamente. n = 25 por grupo. * P & lt; 0,05, prueba de Mann-Whitney. Bar, 100μm.