Extracto
Antecedentes
El sulindac es un aprobado por la FDA no esteroide antiinflamatorio (NSAID) que afecta a la producción de prostaglandinas mediante la inhibición de las ciclooxigenasas (COX) 1 y 2. El sulindac también tiene sido de interés durante más de diez años como quimiopreventivo de pólipos adenomatosos colorrectales y cáncer de colon.
Principales conclusiones
el tratamiento previo de las células de cáncer de pulmón y de colon humanos con sulindac potencia la muerte por un agente oxidante tal como hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) o peróxido de hidrógeno. Este efecto no implica la ciclooxigenasa inhibición (COX). Sin embargo, bajo las condiciones utilizadas, no hay un aumento significativo de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de las células cancerosas y una pérdida de potencial de membrana mitocondrial, lo que sugiere que la muerte celular se debe a la apoptosis, que fue confirmado mediante el ensayo Tunel. Por el contrario, esta mayor eliminación no se observó con células de pulmón o de colon normales.
Importancia
Estos resultados indican que las células normales y cancerosas manejar el estrés oxidativo en diferentes formas y sulindac pueden mejorar esta diferencia. La combinación de sulindac y un agente oxidante podría tener valor terapéutico
Visto:. Marchetti M, L Resnick, Gamliel E, S Kesaraju, Weissbach H, Binninger D (2009) Sulindac Mejora la muerte de las células del cáncer expuestos a Estrés oxidativo. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10.1371 /journal.pone.0005804
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Febrero, 2009; Aceptado el 11 mayo del 2009; Publicado: 5 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Marchetti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por un centro de excelencia en biomedicina y biotecnología de concesión de Marina del Estado de Florida (1140-190-43 subvención concedida a DB y HW). El apoyo adicional proporcionado por los Institutos Nacionales de la Salud (1 R15 CA 122001-01A1 adjudicado a HW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Sulindac fue una de las no-esteroides anti-inflamatorios tempranos (AINE), que afectan a la producción de prostaglandinas por las ciclooxigenasas que inhiben (COX) 1 y 2 [1]. Desde hace más de una década, sulindac también ha sido de interés como un tratamiento quimiopreventivo de pólipos adenomatosos colorrectales y el cáncer de colon [2] - [5], especialmente en pacientes con poliposis adenomatosa familiar [6]. Sulindac también ha sido reportado como un agente quimiopreventivo para el cáncer de vejiga urinaria de ratón [7]. La actividad anti-tumorigénico de sulindac contra el cáncer de colon puede implicar tanto inhibición de la COX [2] y las actividades que son independientes de la inhibición de la COX [8] - [11]. Se ha informado de que sulindac induce la apoptosis de células de cáncer de colon, [11], [12], que parece implicar cambios en la expresión de genes [12] - [18].
Sulindac es un pro-fármaco que debe ser convertida a la COX-inhibidor activo, el sulfuro de sulindac [19]. Hemos demostrado anteriormente que la conversión de sulindac en sulfuro de sulindac puede ser catalizada por MsrA, un miembro de la familia metionina sulfóxido reductasa (MSR) de enzimas [20]. El sistema Msr se ha estudiado en detalle en los últimos años, después de que se demostró que MsrA puede jugar un papel en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad [21] - [23]. La función obvia del sistema Msr es reducir la metionina sulfóxido (Met (O)) en las proteínas de nuevo a la metionina (Met) (revisado en [23]), aunque también funciona como parte de un sistema eliminador de ROS, en el que el Msr sistema permite residuos se reunieron en proteínas para funcionar como antioxidantes catalíticos [24]. Apoyo a la función del tesoro de MsrA ha venido de estudios recientes con ambos PC-12 células neuronales, en el que se sobreexpresa MsrA [25], y las células del cristalino humano, en el que la expresión MsrA se regulan a la baja [26]. Por lo tanto, existe considerable evidencia para sugerir que el sistema Msr juega un papel importante en la protección de las células contra el daño oxidativo.
Desde el sulindac es un sustrato para MsrA [20], parecía razonable que la muerte de las células cancerosas mediante la sulindac podría implicar el estrés oxidativo. Además, quisimos determinar si las células normales y células cancerosas respondieron de manera similar (s) después del tratamiento con sulindac y el estrés oxidativo. En un estudio preliminar, se demostró que el tratamiento de una línea celular de cáncer de células escamosas con sulindac y un agente oxidante dio lugar a un aumento de casi 500% en los niveles de ROS intracelulares y muerte celular significativa. En contraste, los queratinocitos epidérmicos humanos normales no mostraron un aumento en los niveles de ROS o la muerte celular. Estos resultados llevaron a un ensayo clínico limitado que mostraron un prometedor potencial del uso de la aplicación tópica de sulindac y peróxido de hidrógeno para el tratamiento de la queratosis actínica [27]
.
En el presente estudio hemos extendido estos resultados anteriores utilizando líneas celulares de cáncer derivan de pulmón y tejido de colon. Proporcionamos evidencia adicional de que la mayor eliminación observada con sulindac y el estrés oxidativo implica la disfunción mitocondrial que conduce a la muerte celular por apoptosis. Estos nuevos datos refuerzan el potencial para mejorar específicamente la aplicación terapéutica de sulindac y sus derivados para el tratamiento del cáncer mediante el uso de ellos en combinación con un compuesto que produce especies reactivas de oxígeno (ROS).
Resultados
sulindac aumenta la destrucción de células tumorales por el estrés oxidativo, pero no implica ya sea inhibición de la COX o el sistema Msr
líneas celulares de cáncer de pulmón y de colon humano se preincubaron en presencia o ausencia de sulindac durante 48 horas. El exceso de sulindac se eliminó por lavado antes de la incubación de 2 h con TBHP como se describe en los Materiales y Métodos. Sulindac se utilizó a 500 mM de concentración final ya que los experimentos preliminares utilizando sulindac a esta concentración no mostró ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular de cualquiera de las líneas celulares de cáncer.
Cada línea celular de cáncer tenían una marcada disminución de la viabilidad celular en el presencia de TBHP después del pretratamiento con 500 M sulindac (Figura 1A y 1B). La viabilidad de las células de cáncer de pulmón tratados previamente con sulindac se redujo en más de un 80% después de la incubación durante 2 horas con 240 TBHP mu M en comparación con las células control que no fueron tratados previamente con sulindac (Figura 1A). respuestas similares a TBHP se observaron con las células de cáncer de colon tratado sulindac (Figura 1B), aunque se requiere una mayor concentración de TBHP para una destrucción significativa de las células de cáncer de colon. Sulindac también mejoró la muerte de las dos líneas celulares de cáncer cuando TBHP se reemplazó con peróxido de hidrógeno, a concentraciones entre 1,0 mM y 6,0 mM (Figura 2).
células de cáncer de pulmón (A) o células de cáncer de colon (B) se incubaron en presencia (▪) o ausencia (□) de 500 M sulindac durante 48 horas. Las células fueron lavadas para eliminar el sulindac libre antes de la incubación durante 2 horas con la concentración indicada de TBHP y la viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTS se describe en Materiales & amp; Métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no tratadas previamente con sulindac o expuestos a TBHP). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM) expresada como un% del valor medio de cuatro muestras replicadas de un experimento representativo. Importancia de las diferencias entre las células tratadas con y sin sulindac, pero expuesto a la misma concentración de TBHP: * p & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001; *** P & lt; 0,0001
células cancerosas de pulmón (A) o las células del cáncer de colon (B) se incubaron en presencia (▪) o ausencia (□) de 500 M sulindac durante 48 horas.. Las células fueron lavadas para eliminar el sulindac libre antes de la incubación durante 2 horas con la concentración indicada de peróxido de hidrógeno. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTS se describe en Materiales & amp; Métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no tratadas previamente con sulindac o expuestas a peróxido de hidrógeno). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM) expresada como un% del valor medio de cuatro muestras replicadas de un experimento representativo. Importancia de las diferencias entre las células tratadas con y sin sulindac, pero expuestos a la misma concentración de peróxido de hidrógeno: * p & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001; *** P & lt;.
0,0001
Varias líneas de evidencia indican que la mayor eliminación de las células cancerosas por sulindac y el estrés oxidativo no implica inhibición de la COX. Dos otros AINE, ácido acetilsalicílico (aspirina) y el ibuprofeno, a 500 mM, no lograron aumentar la sensibilidad de las células cancerosas con el estrés oxidativo (Figura 3A y 3B, respectivamente). Como se señaló anteriormente, sulindac es un profármaco que se debe convertir a la COX-inhibidor activo, sulindac sulfuro de [19], principalmente a través de la actividad de MsrA [20]. Para determinar si la mayor eliminación de las células cancerosas sulindac-tratado por TBHP involucrado reducción de sulindac en sulfuro de sulindac, el inhibidor activo de ciclooxigenasas, los experimentos descritos anteriormente se repitieron utilizando sulindac sulfona, que no es un sustrato para MsrA (datos no publicados) o un inhibidor de la COX [28]. Debido a aumento de la toxicidad de sulindac sulfona se utilizó una concentración más baja (250 mM) para estos experimentos. El pretratamiento de las células de cáncer de pulmón con 250 sulfona M sulindac (Figura 3C), seguido por la exposición a TBHP dio resultados comparables a los observados usando 500 sulindac mu M (compárense las Figuras 1A y 3C). Resultados similares utilizando sulindac sulfona también se obtuvieron con las líneas de células de cáncer de colon (datos no mostrados). Por lo tanto, los datos colectivos indican que el aumento de la sensibilidad de las células cancerosas tratadas sulindac al estrés oxidativo, bajo las condiciones utilizadas, no implica o bien el sistema Msr o inhibición de la COX.
células de cáncer de pulmón se incubaron en presencia ( ▪) o ausencia (□) de cualquiera de ácido acetilsalicílico 500 mM (a), 500 M ibuprofeno (B) o 250 sulfona M sulindac (C) durante 48 horas. Las células fueron lavadas para eliminar el NSAID libre o sulindac sulfona antes de la incubación durante 2 horas con la concentración indicada de TBHP. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTS se describe en Materiales & amp; Métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no expuestas a un AINE, sulfona de sulindac, o TBHP). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM) expresada como un% del valor medio de cuatro muestras replicadas de un experimento representativo. Importancia de las diferencias entre las células tratadas con y sin sulindac sulfona, pero se expone a la misma concentración de TBHP: * p & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001; *** P & lt;.
0,0001
El sulindac no mejoran la muerte de las células normales expuestas a estrés oxidativo
Es importante determinar si el efecto mayor eliminación de sulindac y sulindac sulfona en las células cancerosas en la presencia de TBHP (Figura 1) también se produjo con las células normales, no inmortalizadas. La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento previo de las células pulmonares normales con sulindac o sulfona de sulindac sobre la viabilidad celular después de estrés oxidativo utilizando TBHP. La incubación de las células pulmonares normales con 500 sulindac mu M durante 48 h antes de la exposición a TBHP no sólo no mejoró matar, pero sulindac proporcionan protección contra el estrés oxidativo causado por TBHP (Figura 4A). El efecto protector contra el estrés oxidativo en las células pulmonares normales también se observó cuando las células fueron pretratadas con sulindac sulfona (Figura 4B).
Se incubaron células pulmonares normales durante 48 horas en (A) la presencia (▪) o ausencia (□) de 500 sulindac M o (B) la presencia (▪) o ausencia (□) de 250 M sulindac. Ver Materiales y Métodos y leyenda de la Figura 1 para más detalles. Importancia de las diferencias entre las células tratadas con y sin sulindac sulfona o sulindac, pero expuesto a la misma concentración de TBHP: * p & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001; *** P & lt;.
0,0001
Se realizaron experimentos similares usando las células normales del colon. No hubo ningún efecto sobre la viabilidad celular en presencia de TBHP cuando las células normales del colon se trataron previamente con o bien 500 sulindac M o 250 sulfona M sulindac (datos no mostrados). Así, ni pulmonar normal ni las células del colon normales mostraron una mayor destrucción por TBHP tras el tratamiento con sulindac o sulfona de sulindac, como se observó con las dos líneas celulares de cáncer.
Sulindac pretratamiento de las células de cáncer de pulmón conduce a niveles elevados de ROS y la pérdida de potenciales
células de cáncer de pulmón de membrana mitocondrial se utilizaron para obtener más información sobre el mecanismo del efecto matando mejorada de sulindac en presencia de TBHP. Para investigar si la mayor eliminación de las células de cáncer observados con sulindac y el estrés oxidativo podría implicar disfunción mitocondrial, se determinaron los cambios en el nivel de ROS intracelulares. Para estos experimentos las células de cáncer de pulmón fueron tratados con sulindac durante 48 horas, expuestos a TBHP y entonces el nivel de ROS intracelular se visualizó usando un colorante fluorescente tal como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados se muestran en la Figura 5. En comparación con las células no tratadas de cáncer de pulmón (figura 5A), las células tratadas con sulindac solo (Figura 5B) o TBHP sola (Figura 5C) mostró un aumento modesto (53-58%) en los niveles de ROS basado en aparición de fluorescencia verde. Sin embargo, las células de cáncer de pulmón que fueron pretratados con 500 M sulindac seguido de una incubación de 2 h con 80 mM TBHP (Figura 5D) tuvieron un aumento de 400% en la fluorescencia verde intracelular en comparación con las células no tratadas (comparar Figura 5A y 5D). Estos datos muestran claramente que el pretratamiento de las células de cáncer de pulmón con sulindac conduce a un gran aumento de ROS intracelular después de la exposición al estrés oxidativo, apoyando los resultados en células de cáncer de piel informado recientemente [27].
Los paneles muestran intracelular fluorescencia ROS. (A) las células no tratadas; células (B) tratados sólo con sulindac; células (C) tratados sólo con TBHP; las células (D) tratados tanto con sulindac y TBHP. Las condiciones de incubación se describen en la Figura 1. Se cuantificó Las células se prepararon para microscopía de fluorescencia y la señal de fluorescencia verde como se describe en Materiales y Métodos. niveles de fluorescencia son la media de dos experimentos independientes y se ajustaron para el porcentaje de células viables. El SEM fue de menos de 10% para cada muestra. El aumento de la fluorescencia en comparación con células de control en el panel A son: B, 53%; C, 57%; D, 401%.
Para profundizar en el mecanismo de matar las células cancerosas expuestas a estrés oxidativo después del pretratamiento con sulindac, se investigó si hay una pérdida concomitante de potencial de membrana mitocondrial, que se sabe que inicia la muerte celular apoptótica. Efectos sobre el potencial de membrana mitocondrial fueron evaluados usando los cambios en la fluorescencia del colorante JC-1 como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se muestran en la figura 6. Los paneles superiores muestran imágenes fluorescentes rojos y los paneles inferiores imágenes fluorescentes verdes. La pérdida de potencial de membrana mitocondrial se traduciría en una disminución de la fluorescencia roja y un correspondiente aumento en la fluorescencia verde. En relación con las células no tratadas (Figura 6A) o células tratadas con sólo el sulindac (Figura 6B) o TBHP sola (Figura 6C), sulindac pretratamiento de las células de cáncer de pulmón, seguido por el estrés oxidativo (Figura 6D) dio lugar a la interrupción del potencial de membrana mitocondrial como lo demuestra un aumento de casi 20 veces en la fluorescencia verde (véase la leyenda de la figura 6 para más detalles). En resumen, el tratamiento previo de las células de cáncer de pulmón con sulindac seguido de tratamiento con TBHP conduce a un marcado aumento de ROS intracelular y una pérdida significativa de potencial de membrana mitocondrial. Estos resultados indican que la muerte celular se produce a través de la apoptosis, lo cual fue confirmado por análisis de Tunel (Figura S1)
Los paneles superiores muestran imágenes de fluorescencia de color rojo mientras que los paneles inferiores muestran imágenes de fluorescencia verde. La pérdida de potencial de membrana mitocondrial se detectó por una disminución de la fluorescencia de color rojo con un aumento concomitante de la fluorescencia verde. El diseño experimental se describe en las leyendas de la Figura 1. (A) células no tratadas; células (B) tratados sólo con sulindac; células (C) tratados sólo con TBHP; las células (D) tratados tanto con sulindac y TBHP. Las células se prepararon para microscopía de fluorescencia y la señal de fluorescencia se cuantificó como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados son un promedio de tres experimentos independientes. SEM fue de menos de 10% para cada muestra. El análisis cuantitativo de fluorescencia verde se expresa de la siguiente manera en unidades arbitrarias: el panel A -1.39; el panel B -1.23; Panel C -1,29; el panel D -25.3.
Discusión
El sulindac y sus metabolitos, tales como sulfuro de sulindac y sulfona de sulindac, han demostrado tener actividad contra el cáncer [29]. De acuerdo con nuestro estudio previo de las células de cáncer de piel [27], hemos demostrado que la muerte de líneas celulares de pulmón y tumor de colon puede ser mejorada significativamente si se combina sulindac con un oxidante, tal como TBHP o peróxido de hidrógeno. También hemos demostrado que el pretratamiento sulindac puede mejorar la muerte de células de cáncer de la piel causadas por el trióxido de arsénico (datos no mostrados), que mata las células cancerosas mediante la generación de ROS intracelular, como se informó en otro lugar para las células de cáncer de pulmón [30]. Parece razonable que sulindac puede mejorar la eficacia de cualquier fármaco contra el cáncer en el que el mecanismo de acción implica daño oxidativo. La aplicación con éxito de una terapia con múltiples fármacos se ha informado recientemente de un ensayo clínico que incluyó a casi 300 pacientes con riesgo de recurrencia de adenomas colorrectales que fueron tratados con una combinación de sulindac y difluorometilornitina, un inhibidor de la síntesis de poliaminas [31].
parece probable que el mecanismo de la muerte selectiva de células de cáncer observados en estos estudios implica la disfunción mitocondrial, posiblemente como resultado del aumento de la producción de ROS. Mientras que el tratamiento de células cancerosas con sulindac o TBHP conduce individualmente a un modesto aumento en el nivel de ROS (Figura 5B y [27], [32]), hay un aumento espectacular en los niveles intracelulares de ROS en células pretratadas con sulindac y a continuación, se expone a TBHP (Figura 5D). Además, hay una interrupción significativa del potencial de membrana mitocondrial en las mismas condiciones experimentales (Figura 6), lo que sugiere que sulindac provoca apoptosis en las células cancerosas expuestas a estrés oxidativo. El efecto contra el cáncer de sulindac solo se ha informado que implicar la muerte apoptótica [33]. Los resultados con sulindac sulfona y otros AINE indican que el efecto de sulindac en nuestro sistema no implica la inhibición de la COX o el sistema de Msr.
Los presentes resultados indican una diferencia fundamental en la forma en células normales y cancerosas responden a oxidativo estrés. Sulindac y sus metabolitos pueden acentuar esta diferencia, que conduce a mayor eliminación de las células cancerosas, pero no las células normales, por el estrés oxidativo. Es bien establecido que el cáncer y las células normales difieren en su metabolismo oxidativo y que las células cancerosas tienen una mayor tasa de glucólisis que las células normales, un fenómeno descrito por primera vez por Warburg [34]. También hay evidencia convincente de que las células cancerosas son típicamente bajo mayor estrés oxidativo en comparación con las células normales [35]. Una diferencia entre las células normales y cancerosas a estrés oxidativo que se ha informado es la citotoxicidad causada por la privación de glucosa. Los estudios realizados por Spitz y compañeros de trabajo [36] han demostrado claramente que este efecto es mediado por la producción de ROS mitocondrial.
Los resultados descritos proporcionan una prueba más que una combinación de sulindac y un agente oxidante pueden tener valor terapéutico en el tratamiento de una clínica variedad de cánceres. En un estudio preliminar anterior se informó de que los resultados de una prueba de concepto limitado de ensayo clínico en humanos utilizando sulindac (1-5%) y peróxido de hidrógeno (25%) geles aplicados diariamente durante tres semanas sobre la queratosis actínica (AK) que implican las extremidades superiores [27]. Al finalizar, los diez AKs tratados mostraron una reducción del tamaño, como se muestra por la fotografía clínica con cinco exhibiendo desaparición completa de las células precancerosas después de la biopsia de la piel. Estos resultados preliminares justifican más extensos ensayos clínicos
Materiales y Métodos
Materiales
El sulindac, ácido acetilsalicílico (aspirina), (S) -. (+) - Ibuprofeno, y tert-butil hidroperóxido (TBHP) se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). Sulindac sulfona fue sintetizado por Custom Synthesis Inc. (Boca Raton, FL). Todos los medios de cultivo de tejidos incluyendo suero bovino fetal y otros suplementos se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).
Cell Cultura
Una línea celular de cáncer de colon (RKO), una línea celular de cáncer de pulmón (A549), y celulares de fibroblastos líneas derivadas de tejido normal humano de colon (CCD-18Co) y normal de pulmón humano (MRC-5) se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD). Todas las líneas celulares se mantuvieron en el medio de cultivo recomendado. Las líneas de células normales no fueron inmortalizados y se utilizaron células de paso para los primeros experimentos aquí. Las líneas celulares se determinaron para estar libre de micoplasma utilizando el Kit de Detección VenorGeM® Mycoplasma (Sigma-Aldrich), que es un ensayo basado en PCR de alta sensibilidad.
viabilidad celular Ensayo
A menos que se indique lo contrario , las células fueron pretratadas con sulindac, sulfona de sulindac u otro AINE durante 48 horas antes de la exposición a TBHP durante 2 horas. Las suspensiones celulares (~100,000 células) que contienen el suplemento indicado se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos usando 100 l de la suspensión de células indicada. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. Después se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron una vez con medio de cultivo fresco con suero. Después de la eliminación de la solución de lavado, se añadió medio de cultivo fresco con suero que contenía la concentración final indicada de TBHP o peróxido de hidrógeno a las células, y las células se incubaron un adicional de 2 horas. Se obtuvieron resultados similares cuando se incluyó sulindac durante el tratamiento de 2 h con el agente oxidante
La viabilidad celular se determinó por el CellTiter 96 Aqueous Un Ensayo de proliferación celular. (Promega; Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El ensayo utiliza un nuevo compuesto de tetrazolio que las células metabólicamente activas convierten a un formazán soluble en agua por la acción de deshidrogenasas celulares, que se mide por absorbancia a 490 nm usando un lector de placa de microtitulación colorimétrico (SpectraMax Plus
384; Molecular Devices) . absorbancia de fondo se sustrajo de cada muestra. Se ha informado de que algunos medicamentos contra el cáncer pueden causar cambios en la absorbancia en los ensayos basados en MTS para la viabilidad celular en ausencia de células [37]. Los experimentos de control utilizando sulindac solo, TBHP solo o combinaciones de sulindac y TBHP del intervalo de concentración utilizado en los experimentos reportados no mostraron ningún efecto de cualquiera de los compuestos solos o en combinación en la absorbancia.
intracelular de ROS Ensayo
los niveles intracelulares de ROS se determinaron mediante el uso de las especies reactivas del oxígeno (ROS) reactivos de detección de Molecular Probes (Eugene, OR) como se describe en otro lugar [38]. Los niveles elevados de ROS resultado en un aumento de la fluorescencia verde, que se visualizó mediante microscopía de fluorescencia.
se determinó JC-1 Ensayo para medir potencial de membrana mitocondrial
La pérdida de potencial de membrana mitocondrial usando el JC-1 teñir de Molecular Probes (Eugene, OR). La pérdida de potencial de membrana mitocondrial conduce a un aumento de fluorescencia verde en el citosol y una correspondiente disminución en la fluorescencia roja mitocondrial. Por lo tanto, los cambios en el potencial de membrana mitocondrial se determinaron siguiendo el rojo a cambio tinción verde usando un filtro FITC (Zeiss microscopio invertido Axiovert-40 CFL). La cuantificación de las señales de fluorescencia se utilizan ambos métodos densitométricos estándar y un Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) de análisis de imágenes basado en [39].
TUNEL ensayo para demostrar la apoptosis
se detectaron células
apoptóticas usando el ensayo de TUNEL colorimétrico Deadend (Promega) que terminan ADN fragmentado etiquetas. Las células fueron fijadas con 4% de formaldehído antes de ser permeabilizadas con 0,2% de Triton-X-100. Las células fueron lavadas con PBS antes de la incubación con transferasa recombinante terminal de desoxinucleotidil (TdT) y los nucleótidos biotinilados para 1 h a 37 ° C, que incorpora los nucleótidos biotinilados en 3 'del ADN fragmentado. Las células se lavaron con PBS y después se incubaron con peroxidasa de rábano-estreptavidina (HRP-estreptavidina) a temperatura ambiente durante 30 min. células marcadas HRP-estreptavidina se detectaron por peróxido de hidrógeno y diaminobencidina (DAB). Las células apoptóticas se visualizaron por tinción nuclear marrón oscuro.
El análisis estadístico
Los resultados de experimentos de viabilidad celular se expresan como la media de cuatro réplicas de un experimento representativo. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Las medias se compararon mediante pruebas t estándar y los P-valores se indican en la figura de leyendas. valores & lt; P 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La cuantificación de las señales de fluorescencia se utilizan ambos métodos densitométricos estándar y un Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) de análisis de imágenes basado en [39].
Apoyo a la Información
Figura S1.
muerte celular por apoptosis. Un ensayo TUNEL se utilizó para detectar la apoptosis de células de cáncer de pulmón. (A) las células no tratadas; (B) las células tratadas con solamente 500 M sulindac; (C) células tratadas sólo con 180 mM TBHP; las células (D) tratados con tanto 500 sulindac mu M y 180 TBHP M. Aumento de los niveles de apoptosis se indican por un aumento de la formación de la coloración marrón. El diseño experimental se describe en las leyendas de la Figura 1 en el manuscrito. Detalles adicionales del ensayo de TUNEL se proporcionan en los Materiales y Métodos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0005804.s001 gratis (0.22 MB TIF)
Reconocimientos
le gustaría reconocer doctor Daphna Sagher por su ayuda y útiles debates. También nos gustaría dar las gracias a Kelsey Binninger por su ayuda en la obra.