Extracto
antígeno tumoral MUC1 asociada El es altamente expresado en una variedad de tumores. Su amplia distribución en tumores primarios y metástasis la hace una diana atractiva para la inmunoterapia. Después de MUC1 síntesis se escinde, dando una gran subunidad alfa extracelular soluble que contiene el tándem repite array dominio (TRA) unido específicamente, a través de interacción no covalente, a una subunidad beta más pequeño que contiene los dominios transmembrana y citoplásmicos. Hasta ahora, la eficacia no concluyente se ha informado de anticuerpos anti-MUC1 dirigidos contra la subunidad alfa soluble. Orientación de la subunidad beta unido a la célula, pueden pasar por alto las limitaciones que plantean los dominios TRA circulante. péptido señal de MUC1 (SP) de dominio se une de forma promiscua múltiple MHC de clase II y clase I alelos, que, después de la vacunación, generado robusta inmunidad de células T contra los tumores MUC1-positivo. Esta es una primera demostración de la no-MHC asociado, MUC1, superficies específicas de células presencia del dominio MUC1 SP. Los anticuerpos policlonales y monoclonales generados contra MUC1 dominio SP unirse específicamente una gran variedad de líneas celulares de tumores sólidos y hematológicos humanos MUC1-positiva; células MUC1-positivas derivadas de médula ósea de plasma obtenidas de mieloma múltiple (MM) -Los pacientes, pero las células tumorales no MUC1 negativos, y las células de sangre primaria y epiteliales ingenuos normales. Membranal MUC1 SP aparece principalmente como una entidad independiente, sino también co-localizada con la molécula MUC1 completa. específica MUC1-SP de unión en las células plasmáticas derivadas-BM pueden ayudar en la selección de pacientes para ser tratados con anti-MUC1 SP vacuna terapéutica, ImMucin. Un potencial terapéutico de los anticuerpos anti-MUC1 SP fue sugerido por su capacidad de apoyar de la lisis mediada por el complemento de las células tumorales MUC1-positivo, pero no las células tumorales negativas MUC1 y las células epiteliales primarias ingenuos normales. Estos hallazgos sugieren un nuevo presencia superficie celular de dominio MUC1 SP, un beneficio terapéutico potencial de los anticuerpos anti-MUC1 SP en los tumores MUC1-positiva y una herramienta de selección para pacientes con MM a ser tratados con la vacuna anti-MUC1 SP, ImMucin.
Visto: Kovjazin R, G Cuerno, Smorodinsky NI, MI Shapira, Carmon L (2014) Superficie celular asociada Derivado-anti-MUC1 péptido señal de Anticuerpos: Implicaciones para el Diagnóstico y Terapia del cáncer. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10.1371 /journal.pone.0085400
Editor: Stefan Dübel, Universidad Técnica de Braunschweig, Alemania |
Recibido: 9 Octubre, 2013; Aceptado: 5 de diciembre de 2013; Publicado: 8 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Kovjazin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca Nº 48447 del israelí Jefe Científico del Ministerio de Industria Comercio y Trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Lior Carmon es el fundador y CEO y Riva Kovjazin, y es un científico senior de Vaxil BioTherapeutics Ltd., una empresa de nueva creación que se está desarrollando ImMucin, una vacuna terapéutica anti-MUC1 SP contra los tumores MUC1-positivo. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Introducción
MUC1 es una glicoproteína tipo mucina altamente expresado en una serie de carcinomas epiteliales, incluyendo pulmón, de mama, de ovario, de próstata y de colon, como así como en la superficie de tumores hematológicos, tales como el mieloma múltiple (MM) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Su amplia distribución tanto en tumor primario y metástasis, incluyendo las células madre del cáncer [7], se ha establecido como un objetivo ampliamente explorada para la inmunoterapia [1], [8], [9], [10]. De hecho, MUC1 fue catalogado por el proyecto piloto Instituto Nacional del Cáncer como el segundo destino más prometedor de una lista de 75 posibles antígenos asociados a tumores (TAA) [11].
MUC1 existe en un número de isoformas [12 ], donde la forma más ampliamente estudiado es el tipo polimórfica I proteína transmembrana (MUC1-TM), que consta de un dominio extracelular que contiene 20-125 arrays 20-aminoácidos de longitud de repetición en tándem (TRA), seguido de un dominio transmembrana y un corto cola citoplasmática [13], [14]. MUC1 se procesa en la vía secretora, produciendo una gran subunidad alfa extracelular contiene el dominio de TRA, ligado no covalentemente a una subunidad beta más pequeña que contiene transmembrana de la molécula y dominios citoplásmicos [15]. Hasta la fecha, mientras que la mayoría de los anticuerpos anti-MUC1 dirigen el dominio TRA de la subunidad alfa extracelular [16], [17], [18], los estudios han mostrado resultados contradictorios con respecto a la eficacia inmunoterapéutica de dicha base de anticuerpos TRA-epítopo de orientación [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Se propone que estas resultados inconsistentes a ser la consecuencia de la unión no covalente del dominio TRA a la superficie de las células tumorales; la, forma circulante soluble actúa como un señuelo para los anticuerpos anti-TRA, lo que limita su capacidad para llegar a las células tumorales que expresan MUC1-[23], [25]. En consecuencia, dirigidas a epítopos MUC1 sin circulación expresan exclusivamente en la superficie de las células del tumor potencialmente podría pasar por alto estas limitaciones. Para este propósito, los epítopos de los segmentos extracelulares e intracelulares que rodean el dominio MUC1 TRA, junto con epítopos dentro de péptido señal de MUC1 (SP) de dominio, se identificaron [20], [21], [27], [28].
SP son secuencias cortas de ácidos lipófilos de larga 13-50 aminoácidos normalmente ubicados en el extremo amino-terminal de las proteínas destinadas para la secreción o para la integración en las membranas celulares [29]. Una vez se ha completado la traducción de proteínas, SPs incorporados en la membrana del retículo endoplásmico (ER) se eliminan generalmente de la proteína madura, pero todavía pueden entrar en el lumen del RE y unirse a moléculas del MHC, ya sea directamente, debido a la actividad de la proteasa única de ER-membrana peptidasa asociada péptido señal (SPP) [29], o indirectamente, al igual que otras secuencias degradadas, a través del transportador asociado con el procesamiento de antígenos (TAP) de máquinas [30]. Sin embargo, la localización ER y el dominio de unión del MHC de SP [31] es necesario disponer de su naturaleza hidrofóbica y la secuencia específica. A saber, al lado de mantenimiento del motivo de consenso requerido como una señal de direccionamiento, diferentes SPs exhiben una alta variabilidad y el antígeno de especificidad [29], [32], [33]. En consecuencia, los dominios de SP pueden servir como candidatos a vacuna (VCS), la inducción de respuestas inmunes específicas de antígeno en una gran parte de la población.
El dominio SP 21-mer de MUC1 (MUC1 SP), en el presente documento el MUC1- SP-L o péptido VXL100 o la vacuna formulada terapéutico, ImMucin [28], se procesa y se presenta en asociación con múltiples MHC de clase I y II en la superficie celular tanto de células presentadoras de antígeno y diversas células tumorales MUC1-positivo, que puede generar robusta inmunidad de células T contra los tumores MUC1-positivas [28]. Además, una respuesta humoral-MUC1 específica puede ser generada contra MUC1 SP, como se manifiesta por una elevación significativa de los autoanticuerpos naturales en el torrente sanguíneo de los pacientes con MM, pero no en donantes sanos [34]. Desde solubles MUC1 SP no se detectó en sueros de pacientes [34], se especuló que los autoanticuerpos generados de forma natural se cebaron por no restringida por el MHC, SP unido a la célula tumoral asociada a MUC1. El presente estudio exploró esta posibilidad mediante la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para MUC1-SP-L. se detectó la presencia de la superficie celular de MUC1 SP, el uso de los anticuerpos generados, en líneas celulares tumorales y tumores primarios, pero no en células primarias no tratados previamente. Además de su potencial terapéutico directo anti-tumor, estos anticuerpos pueden mejorar los criterios de selección de los pacientes con MM destinadas a ser tratado con la vacuna terapéutica ImMucin anti-MUC1 SP.
Materiales y Métodos
Síntesis de péptidos
MUC1-SP-L, MUC1-SP-M, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 y TB-Rv0476 /4941-SP-L se sintetizaron por, en fase sólida totalmente automatizado, la síntesis de péptidos utilizando fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) /tBu-estrategia y resina Rink-amida-poliestireno (EMC Microcollections, Alemania y Ciencias ALMAC, Reino Unido). MUC1-TRA-L y BAGE-SP-L se sintetizaron utilizando la misma metodología (GL Biochem, China). la pureza del péptido y la identidad fue & gt;. 95%, según se determina mediante cromatografía de líquidos de alta y espectrometría de masas análisis
Tumor líneas celulares e hibridomas
Las líneas de leucemia humana B-linfocítica Raji y Ramos , las líneas celulares de mM humano U266, y RPMI8226 y la línea de leucemia PC humano ARH-77 se cultivaron en suspensión en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, 1 mM de HEPES y 50 ug /ml de gentamicina. La línea de carcinoma de ovario humano OVARCAR-3 se cultivó como una monocapa adherente en medio RPMI-1640 suplementado con 20% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 50 ug /ml de gentamicina. La línea de carcinoma de ovario humano ES-2, línea de melanoma SK-MEL-28 las líneas celulares de cáncer de mama MCF7, MDA-231 y MDA-453, y se cultivaron como monocapas adherentes y la línea de melanoma humano SK-MEL-1 fue cultivada en suspensión en DMEM, suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 50 ug /ml de gentamicina. Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC (Manassas VA, EE.UU.). Todos los hibridomas utilizados en este estudio se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero de caballo, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 50 ug /ml de gentamicina. Todos los reactivos de cultivo se adquirieron en Biological Industries, (Bet-Haemek, Israel).
Los anticuerpos
El anti-MUC1 TRA mAb H23, levantado en contra de la línea celular de cáncer de mama humano T47D, [35 ] reconociendo la no glicosilada APDTRP MUC1 epítopo, sirvió como un control positivo. Mouse anti-cabra o de conejo anti-IgG de ratón-FITC (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) sirvió como analiza un control negativo para FACS. Se utilizaron anticuerpos IgG de ratón o de conejo normal (Chemicon, Millipore, EE.UU.) para la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) analiza.
Animales
ratones de ocho semanas de edad Balb /c hembra (Tel Aviv University instalación de cría) y de dos meses de edad, los conejos (Harlan, Jerusalem, Israel) se mantuvieron en las instalaciones de la universidad la investigación con animales.
Todos los procedimientos experimentales con ratones y conejos fueron aprobados por la Universidad de Tel Aviv Cuidado de animales Comité.
paciente de médula ósea (BM) aspirados y primaria Naïve células sanas
aspirados BM (2-3 ml) fueron extraídos de cuatro pacientes (edades 50-75) con progresión lenta, asintomática MM, que habían sido seleccionados para la inscripción en la fase de ImMucin I /II de ensayos clínicos (protocolo VAXIL-001). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Hadassah, Jerusalén, Israel, el Ministerio de Salud de Israel y se registró en el ERP como NCT01232712. El análisis de PC derivados de BM se llevó a cabo en el marco del proceso de selección del estudio y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes con MM para el uso de su muestra para la investigación. Fresca humana normal BM (Cat. No. 1 M-105) y nhec (Cat. No. CC-2251) humana, se adquirieron de Lonza BioResearch (Somerset, Nueva Jersey, EE.UU.). los glóbulos blancos humanos normales fueron aisladas de muestras de la capa leucocitaria donados por el Banco Nacional de Sangre de Israel, de 3 donantes naive.
Producción de anticuerpos anti-MUC1 SP anticuerpos policlonales
Cuatro conejos (R22, R23, R32 y R33) se inmunizaron por vía subcutánea cuatro veces, a intervalos de dos semanas, con 500 ug de lapa californiana hemocianina (KLH) conjugada MUC1-SP-M, emulsionado en adyuvante completo de Freund en la primera inmunización y en adyuvante incompleto de Freund en inmunizaciones posteriores. conjugación KLH-péptido se realizó por Adar Biotech (Rehovot, Israel) por medio de reticulación glutaraldehído impulsada. Siete días después de la inmunización final, sueros de conejo se examinaron para la presencia de anticuerpos MUC1-SP-M-específicos; sueros positivos (título 1:12,800) se recogieron y se agruparon. IgG de conejo fracciones de R23, denominados R23IgG, que se utiliza para todos los ensayos inmunológicos, se sometieron a sulfato de amonio (40%) la precipitación antes de su uso, tal como se describe anteriormente [36].
Producción de anticuerpos anti-MUC1 SP mAb
ratones Cuatro BALB /c se inmunizaron por vía subcutánea como se describe anteriormente. Dos semanas después de la inmunización final, los ratones sueros se evaluaron para la presencia de anticuerpos MUC1-SP-M-específicos. células de bazo de la más alta ratón sueros de soporte positivo se cosecharon y se fusionaron con la línea celular NSO socio de mieloma murino, usando polietilenglicol (peso molecular 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Se seleccionaron hibridomas durante 2 semanas en medio de crecimiento de hibridoma suplementado con 2% de hipoxantina-aminopterina-timidina y se cultivaron adicionalmente en medio de crecimiento de hibridoma suplementado con 2% de hipoxantina-timidina. ELISA se realizó para sobrenadantes de cultivo de pantalla para la presencia de anticuerpos anti MUC1-SP-M-IgG Abs. Las muestras positivas se volvieron a explorar por ELISA y se subclonaron y se expandieron aún más. A gran escala de producción de Ab clones seleccionados se logró mediante la purificación de mAbs utilizando una columna de agarosa anti-IgG de ratón (Sigma, Israel; Cat. No A6531). Isotipificación de anticuerpos monoclonales se realizó utilizando un kit Isostrip (Roche;.. Cat nº 1.493.027).
basado en ELISA de detección de ratón hiperinmune Sera y de anti-MUC1-SP-M-IgG producir hibridomas
placas de ELISA (Maxisorp F96, Nunc, Dinamarca) fueron activadas durante 1 h con 0,1% de glutaraldehído (Sigma, Israel) en tampón carbonato, pH = 9. a continuación, las placas se recubrieron con 50 ul de péptido (5 ug /ml), en tampón de carbonato (durante la noche, 4 ° C), seguido de bloqueo (2 h, temperatura ambiente) con PBS suplementado con 5% de FBS y 0,04% de Tween 20 (ICN Biomedical Inc, EE.UU.). Las muestras de suero de los ratones inmunizados-MUC1 SP-M se diluyeron en el tampón de bloqueo, mientras que las muestras de cultivos de hibridoma no se diluyeron. Todas las muestras se incubaron (2 h, temperatura ambiente), antes de un lavado extensivo y el tratamiento (1 h, temperatura ambiente) con HRP-conjugado anti-IgG de ratón (Jackson ImmunoResearch, EE.UU., 50 ul /pocillo), después de una dilución 1:10,000 en tampón de bloqueo. Después de un extenso lavado, las placas se desarrollaron con TMB solución /E (Chemicon, Millipore, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para ensayos de competición de anticuerpos péptido, sueros hiperinmunes y medio de crecimiento de hibridoma se incubó con 1 ug /así péptidos en placas de 96 pocillos de ELISA (Maxisorp F96, Nunc, Dinamarca) activadas con glutaraldehído. El resto del ensayo se realizó como se describió anteriormente. Una disminución de al menos el 50% en el DO se considera un resultado positivo.
citometría de flujo y ImageStream
Para confirmar la tinción de la superficie de MUC1 en líneas celulares tumorales y co-expresión de marcadores de MM y MUC1 en aspirados BM, las células se lavaron y se incubaron durante 30 min en tampón de tinción, que consiste en PBS, suplementado con 3% de FBS, 10% suero AB humano y azida sódica al 0,1%. BM "grandes" células fueron cerrada inicialmente por el lado frente a la dispersión frontal. A continuación, las células se tiñeron con uno o más de los siguientes: Abs CD138-APC antihumano conjugado comercialmente (IQ Products, Países Bajos), ligera kappa de cadena eFluor 450 y anti-humana de cadenas ligeras lambda-PE (eBioscience anti-humano, EE.UU.) y /o de la propia preparados con FITC o PE-conjugado anti-MUC1 humana (anti-MUC1-TRA H23), anti-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 y SPmAb-2.1 anticuerpos. FITC y PE conjugación se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (enlace de iluminación R-ficoeritrina Conjugación Kit, Innova Biosciences, EE.UU.). Las células marcadas se lavaron dos veces, se fijaron en BD CellFIX (Becton Dickenson, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se almacenaron a 4 ° C hasta su análisis. Al menos 1 x 10
6, y 3 × 10
4 eventos fueron adquiridos por citometría de flujo y flujo de imágenes, respectivamente. Para el análisis ImageStream, núcleos celulares se tiñeron con solución de tinción de Hoechst (3.030.145), de acuerdo con el protocolo del fabricante (MP Biomedicals, CA, EE.UU.). La citometría de flujo El análisis se realizó con el LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, EE.UU.) y los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo (TreeStar, EE.UU.). análisis de colocalización se realizó con el sistema ImageStream (ImageStreamX citómetro de flujo; Amnis Corp) y se analizó usando las ideas similitud función Detalle brillante (IDEAL 6.0; Amnis Corp). La puntuación de similitud es una medida del grado en que las dos imágenes están correlacionados linealmente.
Microscopía de inmunofluorescencia
Las células adherentes (5 x 104 células /pocillo) se sembraron en cubreobjetos de vidrio (Marlenfeld GmbH & amp ; Co), en placas de 24 pocillos, durante 18 h 37 ° C. cubreobjetos de vidrio se lavaron dos veces con frío (4 ° C) PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% (20 min, temperatura ambiente), se bloquearon y se permeabilizaron con PBS, suplementado con 3% de BSA y 0,1% de Triton (1 h, temperatura ambiente). A continuación, se tiñeron las células (1 h, temperatura ambiente) con anticuerpos diluidos a 20 ug /ml en solución de tinción (1% de BSA, 0,1% de Triton en PBS), y luego con el anticuerpo secundario, se diluyó 1:200, en solución de tinción suplementado con DAPI (30 min, temperatura ambiente). Los portaobjetos se monta con fluorescencia Medio de montaje (Puente Golden Life Science, EE.UU.). Las células cultivadas en suspensión se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios y luego fijaron y se sembraron en cubreobjetos de vidrio. Las células fueron vistos con un Zeiss × 100, NA 1.4, Yokogawa CSU-22, Zeiss o totalmente automatizado invertida microscopio 200 M, con láseres de estado sólido 473, 561 y 660 nm; piezo-controlado Z-etapa, todo bajo el mando de Slidebook ™. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara Evolve EMCCD (Fotometría; 100 × lente, 1 × 1 hurgar en la basura, tamaño de píxel: 0.16 micras).
CDC
Varias líneas tumorales y las células diana (HMEC) ( 1 × 10
6 células /ml) fueron marcadas con 2 uCi /ml 3 [h] -timidina (Amersham, UK), durante 18 horas a 37 ° C. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron (2 h, temperatura ambiente) con 100, 50 o 10 ug H23, anticuerpos /ml R23IgG, SPmAb-6 o SPmAb-2.1. Después, las células se lavaron con PBS, y 1 × 10
se incubaron 4 células (5 h, 37 ° C) en 4 ml de tubos con 20 ul, 10 ul o 5 ul complemento del suero humano (Sigma, Israel). Las células fueron lavadas tres veces con PBS, se resuspendieron en 300 ul de PBS y se sembraron en 100 ul /pocillo por triplicado, en placas de 96 pocillos (Griner, De Groot, Alemania). la recolección de células se realizó utilizando UNIFILTER placas de 96 pocillos (PerkinElmer, EE.UU.). Se determinó la radiactividad en un contador beta (PerkinElmer, IL, EE.UU.). Para la lisis espontánea, se incubaron las células en las mismas condiciones, pero sin la adición del complemento. Para la lisis total, el 10% de Triton X100 se añadió a las células marcadas. Porcentaje de lisis específica se calculó como sigue:. (CPM en el pocillo experimental - CPM en la muestra espontánea) /(CPM en el total de la muestra - CPM en la muestra espontánea) × 100
Análisis estadístico
Estadística significancia se determinó mediante la prueba t de Student. En todas las pruebas, el nivel mínimo de significancia para una prueba de 2 colas se fijó en p. & Lt; 0,01
anticuerpos
Resultados
Generación de MUC1 SP-específicos
Para promover exploración de la naturaleza, la especificidad y la localización del antígeno que conduce a la generación de autoanticuerpos frente a MUC1-SP-L, se utilizó el conjugado KLH-17-mer MUC1-SP-M péptido (Tabla 1) para generar anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. MUC1-SP-M fue elegido sobre la base de una predicción in silico para alta densidad de MHC de clase II y epítopos de células B y de la concentración considerable de autoanticuerpos contra este péptido, que se encuentra en el suero de pacientes con MM [34]. Anti-MUC1-SP-M anticuerpos policlonales (título de los sueros positivos a ≤1:25,000) se obtuvieron en ratones (datos no presentados) y en dos conejos inmunizados R23 y R32 (positivo en el título de ≤1:12,800) (Tabla 1 y Fig . 1A panel izquierdo). La respuesta humoral anti-MUC1 demostró reactividad cruzada limitada (títulos de & lt; 1:800 diluciones) tanto eucariota (BAGE-SP-L, Tabla 1 y Figura 1A panel del medio.) Y procariotas (TB-Rv0476 /4941-SP- L, Tabla 1 y del panel derecho SP Fig. 1A). Los epítopos internos MUC1-SP-M más reconocidos por R23 eran MUC1-SP-S1 y MUC1-SP-S2 (Tabla 1, Fig. 1B), ambos ubicados en la MUC1 SP C-terminal. Los ensayos de competencia que evalúan la especificidad de los anticuerpos policlonales demostrado & gt; 50% de inhibición tanto R23- y anticuerpos R32-derivan por MUC1-SP-M y su epítopo interior MUC1-SP-S2 (figura 1C.). La inhibición de & lt; 10% se logró mediante otros epítopos MUC1 SP, en particular, MUC1-SP-S4 y MUC1-TRA-L, y por el BAGE SP dominio BAGE-SP-L. Sobre la base de estos resultados, el epítopo mínimo de R23 y R32 se encuentra dentro de los-SP-S1 MUC1 secuencias y MUC1-SP-S2, es decir, los aminoácidos 12-21.
La especificidad y epítopo mínimo definido de la generada anti-MUC1 SP anticuerpos policlonales (a-C) y mAbs SPmAb-2.1 y SPmAb-6 (D-e) se evaluaron contra el péptido inmunizante MUC1-SP-M y sus epítopos internos MUC1-SP-S1 a S5, en ensayos de ELISA. epítopo de MUC1 TRA, MUC1-TRA-L, y la no-MUC1 SP dominio BAGE-SP-L, se utilizaron en estos ensayos como controles negativos.
Tras el establecimiento de MUC1-SP -M inmunogenicidad en conejos, se optó por generar mAb en ratones. Los sueros recogidos de ratón inmunizado-MUC1-SP-M No. 1 (M1) unido firmemente el péptido inmunizante, MUC1-SP-M (& gt; 1:12,800 título) (Fig 1D.), Moderadamente unido MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 y MUC1-SP-S3 (& gt; 1:1800-3600 títulos) y débilmente unida MUC1-SP-S4 y MUC1-SP-S5 (& gt; 1:800 título). Los sueros no pudo enlazar MUC1-TRA-L. Encuadernación experimentos con sueros de ratón No. 2 demostró los títulos más altos (& gt; 1:1600) a péptidos MUC1-SP-S4 y MUC1-SP-S5 (datos no mostrados). Los esfuerzos de clonación produjo dos mAbs, una con un isotipo Ig-gamma1, designado SPmAb-2,1, y el segundo con un isotipo Ig-gamma2a, designado SPmAb-6. mAb especificidad fue validado por ensayos de unión y de competencia (Fig. 1E) con varios péptidos libres (Tabla 1). MUC1-SP-S2 más potentemente inhibida SPmAb-2.1, mientras que MUC1-SP-S4 con mayor eficacia inhibido SPmAb-6 de unión, tanto en la definición de los epítopos mínimos de los anticuerpos respectivos.
anti-MUC1 SP anticuerpos se unen a MUC1 Las células tumorales positivas a
análisis de citometría de flujo demostraron moderada-alta SPmAb-2.1, SPmAb-6 y R23IgG unión a MUC1-expresión de los tumores sólidos y hematológicos (Tabla 2). El anti-MUC1 TRA mAb H23 [35], que sirvió como control positivo MUC1, mostró reactividad inequívoca, con una fuerza similar a la de los anticuerpos de unión a R23IgG. Por el contrario, MUC1-negativo de melanoma líneas celulares, SK-MEL-28 y SK-MEL-1, y la línea celular de ovario MUC1-negativas, ES-2, fallaron consistentemente reaccionar (bajo media geométrica) con todos los anticuerpos probados (Tabla 2), demostrando la selectividad de anticuerpos a MUC1 SP. Más apoyo del tumor por células y MUC1 SP-especificidad de los anticuerpos, fue proporcionado por ausencia de unión de SPmAb-2,1, SPmAb-6 y anticuerpos mAbs R23IgG a los glóbulos blancos humanos, en particular, a CD3
+ T -Cells, CD20
+ células B y células CD14
+ células mieloides, así como a la ingenua células epiteliales mamarias humanas normales (HMEC) (Tabla 2).
anti-MUC1 SP los anticuerpos se localizan en las membranas de las células tumorales MUC1-positivo
la localización del antígeno reconocido por los diferentes anticuerpos MUC1 SP se determinó mediante análisis ImageStream. se observó presencia MUC1 SP, utilizando conjugado con PE SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb y APC conjugado con H23 MUC1 TRA mAb, en la superficie celular de la línea celular de ovario MUC1-positivo OVCAR-3, mientras que no se observó expresión en la MUC1 -negativo línea celular de ovario ES-2 (Fig. 2A). Las imágenes fusionadas de 30000 células indican que MUC1 SP y MUC1 TRA localizan principalmente solo en la membrana de las células. MUC1 SP se observó como un dominio membranal independiente, como se demuestra por una sola PE
brillante tinción membranal, en 47% y 56% de las células analizadas, tras el tratamiento con SPmAb-6 y SPmAb-2,1, respectivamente. Colocalización de las moléculas de MUC1 SP y MUC1 TRA, demostrado por un doble PE
brillante /APC
brillante tinción membranal, era mínima, y se observó en el 18% y el 27% de las células expuestas a SPmAb-6 y SPmAb- 2,1, respectivamente (datos no mostrados). se observó (datos no presentados), lo que indica la colocalización de estas moléculas en muy pocas células seleccionadas; A alta similitud entre MUC1 SP y tinción MUC1 TRA (1,0 coeficientes de similitud & gt). la confirmación adicional de la MUC1-especificidad de estos anticuerpos se obtuvo mediante la unión específica de los anticuerpos anti-MUC1 SP mAb SPmAb-2,1 y la MUC1 TRA mAb H23 a-2 ES células de ovario de MUC1-negativa únicamente a su transfección con la expresión MUC1-TM construir (Figura 2B).
la presencia de la superficie celular y análisis de similitud del dominio MUC1 SP y MUC1 TRA se evaluó en OVACAR-3 MUC1-positivas y ES-2 líneas de células de tumor MUC1-negativas por análisis usando ImageStream PE y APC-etiquetados anti-MUC1 SP mAb SPmAb-2.1, SPmAb-6, y anti-MUC1 TRA H23 mAB (A). análisis de microscopía de fluorescencia también se realizó en ES-2 células de ovario de MUC1 transfectadas frente a las células MUC1-negativo matrices (B). BF soporte de campo brillante y soporte secundario para anticuerpos IgG anti-ratón.
anti-MUC1 SP anticuerpos se unen MUC1-que expresan las células MM en plasma fresco de médula ósea aspirados
óseo obtenido recientemente ósea (MO) aspirados de cuatro pacientes con MM se utilizaron para investigar si los anticuerpos se unen selectivamente R23IgG células tumorales primarias en un ex-vivo, entorno heterogéneo. células plasmáticas sospechosos (PC) fueron cerrada (Fig. 3 la columna A) y su fenotipo fue verificado por la tinción de ligera kappa y cadenas lambda (datos no mostrados). La población fue cerrada al lado analizó para la expresión de MUC1 TRA (Fig. 3 la columna C) y MUC1 SP (columna de la Fig. 3 E) sobre las células CD138 positivas. anticuerpos de control de especies de concordancia para la tinción de MUC1 se utilizaron para cada experimento (Fig. 3 columnas B y D). El PC CD138-positivo de aspirados de BM de pacientes con MM#1,#2 y#3 con destino R23IgG (78,2%, 66,3%, 95,9%, respectivamente, de la población de células analizadas) y H23 (78,3%, 59,2%, 93,2% , respectivamente, de la población de células analizadas) (Fig. 3 columnas C y e). Por el contrario, el aspirado cuarto (P#4) demostró baja reactividad tanto a H23 y R23IgG (0,37% y 0,45%, respectivamente, de la población analizada), a pesar de la expresión de CD138 moderada (74,9% y 39,9% de las células, respectivamente) en este aspirado. Como control, nos encontramos con un flujo similar en análisis de citometría de un aspirado de BM derivado de un donante naïve, saludable. Las células en este análisis fueron cerrada para kappa y lambda expresión, como la expresión de CD138 fue negativo (Fig. 3 columnas F). Resultados (Fig. 3 columnas G y H) confirmaron unión mínima de aproximadamente 1% tanto para MUC1-TRA y MUC1 SP en ambas cadenas kappa y lambda. En resumen, estos resultados demuestran que R23IgG y H23 reconocen específicamente PC malignos, convirtiendo MUC1 SP un antígeno adecuado para la selección del tratamiento y seguimiento.
La presencia de la superficie celular del dominio MUC1 SP se evaluó mediante análisis FACS cerrada en las células PC en aspirados BM frescas obtenidas de pacientes con MM (A-e) y la muestra ingenuo normal (M-H). Policlonales anti-MUC1 SP (R23IgG) se utilizó para determinar la expresión de MUC1 SP; la expresión de MUC1 dominio TRA se determinó con mAb H23. Para cada experimento, se utilizaron anticuerpos de control en especies emparejados para la tinción MUC1: o IgG normal de ratón-FITC (B), o IgG normal de conejo-FITC (D). Anti-MUC1 SP MAB (SPmAb-2.1) se utilizó para la expresión de MUC1 SP determinado; la expresión de MUC1 dominio TRA se determinó con mAb H23.
citotoxicidad dependiente Piropo mediada por anti-MUC1 anticuerpos SP
La traducibilidad de antígenos tumorales y especificidades de anticuerpos anti-MUC1 SP de potencial inmunoterapéutico funcional se demuestra por la lisis eficaz de células que expresan MUC1 por R23IgG (Fig. 4A), SPmAb-2.1 y SPmAb-6 (Fig. 4B), lo que indica su potencial como efectores anti-tumorales. anticuerpos R23IgG mediadas 60-100% de lisis de las células de ovario OVACAR-3 sólidos y hematológicos, U266, RPMI 8226, MM, ARH-77 y las células tumorales Ramos leucemia. De una manera similar, SPmAb-2.1 y SPmAb-6 activan lisis altamente específica de & gt; 90% y 60-80%, respectivamente, de las mismas líneas celulares. En comparación, H23 induce la lisis de 80 a 90% de las poblaciones celulares ensayadas (Fig. 4B). La lisis inducida por todos los anticuerpos anti-MUC1 fue altamente significativa (p & lt; 0,001 en la prueba t de Student) en líneas celulares de tumores MUC1-expresión, en comparación con la línea celular de ovario ES-2, la línea celular de melanoma SK-MEL-1 y nhec, tres líneas celulares de MUC1-negativo. En general, la eficacia de lisis CDC correlaciona fuertemente con los niveles de expresión de la superficie celular MUC1, evaluados por citometría de flujo análisis (tabla 2), con la excepción de SPmAb-6 mAb, que demostró la presencia de alta superficie celular pero moderada CDC.
La propiedades citotóxicas de los anti-MUC1 SP policlonal R23IgG (A) y monoclonal SPmAb-2.1, SPmAb-6 mAB (B) se evaluaron mediante análisis de CDC utilizando diversos tumores sólidos, no sólida, MUC1-positivos y negativos y HMEC. La MUC1 TRA-dominio específico mAb H23, NMS y NRS y no hay (W /O) anticuerpos se evaluaron como controles.
Discusión
A pesar de una amplia investigación en relación con el potencial inmunoterapéutico de MUC1 , todavía no existe un producto con licencia en contra de este objetivo. Si no se aísla, epítopos MUC1 insolubles unidos a células ha obstaculizado el desarrollo de un agente inmunoterapéutico relacionados MUC1-efectiva. avance significativo fue hecho por Rubinstein et al [37] y, más recientemente, por Pichinuk y colegas [24], que produce anticuerpos contra la unión de alfa /beta de MUC1s celulares. Estos anticuerpos mostraron unión a MUC1 altamente selectiva y la citotoxicidad inducida de los tumores MUC1-positivo, cuando se une a una toxina [24]. Sobre la base de nuestras observaciones anteriores de autoanticuerpos anti-MUC1 SP generados de forma natural en los pacientes con MM, pero no en donantes sanos tratados previamente, [34] el estudio actual ha adoptado una estrategia diferente para apuntar el dominio MUC1 SP insoluble. Los anticuerpos R23IgG, SPmAb-2.1 y SPmAb-6 que hemos planteado, específicamente con destino MUC1 SP, sin SPs no relacionados (fig. 1A) y MUC1-TRA epítopos de unión (fig. 1B-E). Los epítopos mínimos reconocidos por estos anticuerpos se encuentran en el extremo carboxi-terminal de MUC1 SP (Fig. 1C y 1E)
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Más allá de observaciones sugiere que los dominios SP podría proteínas potencialmente directos a ya sea la membrana celular o el compartimiento extracelular [33]. dominios SP no escindido, como en el caso de inhibidores de proteasas, tales como activador de plasminógeno inhibidor-2 [38], o su homólogo de pollo, ovoalbúmina [39], guían la proteína a la ER y no apoya de acoplamiento de membrana, produciendo la secreción de la proteína intacta. En el caso del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) precursor glicoproteína C, la inserción de la proteína en la membrana del RE está mediada por una inusual 58 aminoácidos de longitud SP que lleva una región N-terminal extendida. Aunque el SP se escinde por SPasa, permanece no covalentemente unida a la glicoproteína sin ser procesada por SPP.