Extracto
La hipoxia y el agotamiento de suero son características comunes de tumores sólidos que se producen en la antiangiogénesis , la irradiación y la quimioterapia a través de una amplia variedad de tumores malignos. Aquí mostramos que las células tumorales que expresan CD133, un marcador para el cáncer colorrectal iniciar o las células madre, se enriquecen y sobrevivir en condiciones de hipoxia y el agotamiento de suero, mientras que las células experimentan apoptosis CD133-. las células tumorales CD133 + aumentan cáncer de células madre y las propiedades de transición epitelio-mesénquima. Por otra parte, a través de la detección de un panel de tirosina y serina /treonina quinasa vías, hemos identificado Hsp27 es constitutivamente activado en las células CD133 + en lugar de células CD133- en condiciones de hipoxia y el agotamiento de suero. Sin embargo, no hubo diferencia en la activación de Hsp27 entre las células CD133 + y CD133- en condiciones de crecimiento normal. activación Hsp27, que fue mediada por la vía de p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27, se requiere para las células CD133 + para inhibir la caspasa 9 y 3 de escisión. Además, la inhibición de la señalización de Hsp27 sensibiliza a las células CD133 + a la hipoxia y el agotamiento de suero apoptosis inducida. Por otra parte, la vía antiapoptótica también se activa en las células madre de cáncer CD133 + de cultivo enriquecido con esferoides de una variedad de células tumorales sólidos, incluyendo de pulmón, el cerebro y el cáncer oral, lo que sugiere que es una vía común activado en las células madre de cáncer de varios tipos de tumores. Por lo tanto, la activación de PP2A o inactivación de la vía de p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 puede desarrollar nuevas estrategias para la terapia del cáncer por la supresión de su población TIC
Visto:. Lin SP, Lee YT, Wang JY, Miller SA, Chiou SH, Hung MC, et al. (2012) La supervivencia de cáncer de las células madre en condiciones de hipoxia y Suero de agotamiento a través de Disminución de la actividad PP2A y activación de p38-MAPKAPK2-Hsp27. PLoS ONE 7 (11): e49605. doi: 10.1371 /journal.pone.0049605
Editor: Marianne Koritzinsky, Red de Salud de la Universidad, Canada |
Recibido: Abril 29, 2012; Aceptado: 11 Octubre 2012; Publicado: noviembre 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Consejo Nacional de Ciencia (97-3111-B-010-001, y 99-3111-B-010-005-), Taipei hospital general de Veteranos (V98E1-002), el MD Anderson Cancer Center /china Universidad de Medicina y el hospital Fondo institución hermana, y la Universidad Nacional Yang-Ming, Ministerio de Educación. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los rasgos fenotípicos y moleculares heterogéneas de los cánceres humanos son una función de su iniciación del tumor o cáncer de células se deriva (TIC) contenido [1]. La población CD133 + de células representan aproximadamente el 2,5% de los tumores de células de cáncer de colon [2], y los estudios previos han demostrado que esta población de células contiene una serie de TICs tumorigénicas no diferenciadas [2], [3]. Ellos demostraron que la inyección subcutánea de células de cáncer colorrectal CD133 +, pero no las células CD133-, fueron capaces de reproducir fácilmente el tumor original en ratones inmunodeficientes. La desregulación de TIC auto-renovación es un requisito probable para el desarrollo del cáncer [4], [5], [6], y la supervivencia de tics pueden ser responsables de la resistencia a terapias contra el cáncer y la recurrencia de tumores [7]. Los mecanismos subyacentes de la supervivencia TICs de terapias antitumorales son en gran parte desconocidos. Sin embargo, se ha informado de un aumento en los transportadores ABC [8], la capacidad de reparación del ADN activa [7], y la resistencia a la apoptosis por la producción de citocinas o la activación de vías específicas. Por lo tanto, la identificación de las vías de señalización de las propiedades de supervivencia y la auto-renovación de las TIC ha atraído recientemente una gran cantidad de atención, debido a la promesa de una diana celular novedoso para el tratamiento de cánceres.
proteínas de choque térmico ( Hsps) juegan un papel esencial como chaperones moleculares por ayudar al plegamiento correcto de las proteínas mal plegadas estrés acumulado, y de interactuar directamente con varios componentes de la maquinaria de muerte celular programada estrechamente regulado. Entre ellos, el nivel basal Hsp27 es generalmente alta en las células o tejidos a partir de una amplia gama de tumores [9]. Además, se ha demostrado que la Hsp27 mejora la resistencia a la quimioterapia con cisplatino y doxorrubicina, y aumenta el potencial tumoriogenic de células de cáncer de colon de rata [10].
hipoxia y el agotamiento de suero son características comunes de tumores sólidos que se producen en antiangiogénesis, la irradiación y la quimioterapia a través de una amplia variedad de tumores malignos [11], [12]. La hipoxia y la anemia (que contribuye a la hipoxia tumoral) pueden conducir a la radiación y resistencia a la quimioterapia ionizante al privar a las células tumorales de lo esencial de oxígeno para las actividades citotóxicas de estos agentes [13], [14]. La hipoxia también puede reducir la sensibilidad del tumor a la terapia de radiación y la quimioterapia a través de uno o más indirectos mecanismos que incluyen cambios proteómicos y genómicos. Estos efectos, a su vez, pueden conducir a un aumento de la invasividad y el potencial metastásico, la pérdida de la apoptosis y la angiogénesis caótico, aumentando así aún más la resistencia al tratamiento. Sin embargo, la respuesta de las células tumorales a la hipoxia y el agotamiento de suero y el mecanismo subyacente media esta respuesta aún no se han aclarado. En el estudio actual, hemos demostrado que la mayoría de las células de cáncer de colon sufren apoptosis después de la exposición a la depleción de suero y la hipoxia, y la población CD133 + de células de cáncer de colon es más resistente a la apoptosis a través de la activación constitutiva de una vía de señalización anti-apoptótica implica Hsp27. Por otra parte, se muestra que las TIC pueden sensibilizarse a someterse a la apoptosis y muerte celular a través de la inactivación de la vía de Hsp27.
Materiales y Métodos
Cultivo de células hipóxicas y Condiciones
La línea celular de cáncer colorrectal humano HT-29 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC). El CCS y células de cultivo primario de TS fueron dotados por el Dr. K. Wen Yang (Laboratorio de celular /Terapia Genética, Hospital de la Universidad Médica de China, Taichung, Taiwán). Las células de CCS fueron aisladas de un tumor primario de una mujer con Duke C
3 adenocarcinoma de colon. Las células HCW fueron aisladas de la muestra de la metástasis del hígado de un varón con adenocarcinoma de colon. Todas las células se cultivaron en DMEM (Gibco, Grand Island, NY), que contiene 10 unidades /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina, 2 mmol /L de glutamina, y suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco), en 37 ° C atmósfera húmeda con 5% de CO
2. Para condiciones de hipoxia, las células se cultivaron en una mezcla de gases compuesta de 94% N
2, 5% de CO
2, y 1% O
2, que se mantuvo usando una incubadora con dos sensores de aire, uno de CO
2 y el otro para O
2; O
2 concentración se logra y se mantiene mediante la entrega de gas nitrógeno (N
2). Si se eleva O
2 porcentuales por encima del nivel deseado, N
2 de gas se inyectaron automáticamente en el sistema para desplazar el exceso de O
2. Para el cultivo de esferoides, las células se resuspendieron en medio libre de suero DMEM /F12 suplementado con suplemento N2, EGF humano recombinante (20 ng /mL; PeproTech), y FGF (10 ng /mL; PeproTech), y se sembraron a una densidad de 10
4 células /pocillo en una microplaca de 6 pocillos Adjunto ultra-bajo (Corning, Lowell, MA).
Los ensayos para la apoptosis
la apoptosis fue ensayada con un colorante celular que detecta la membrana alteraciones (fosfatidilserina flip) y manchas de células apoptóticas (APOPercentage; Accurate Chemical & amp; Scientific Corporation, Nueva York, Nueva York). Las células teñidas se analizaron utilizando un lector de microplacas Spectramax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Alternativamente, las células se recogieron por tratamiento con tripsina, se tiñeron con ensayo de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche), y se visualizaron mediante microscopio de fluorescencia. Para la detección de las formas escindidos de caspasa 3 y 9, los lisados de proteínas se prepararon y un Western blot se realizó con los anticuerpos primarios comprados de Tecnologías de Señalización Celular (Beverly, MA).
migración celular y la invasión de ensayo
Para el ensayo de migración, 4 × 10
4 células, suspendidas en 200 l de DMEM suplementado con 0,5% de FBS, fueron sembradas en el pocillo superior de transwell de 24 pocillos que contenía un filtro de 8 micras poros ( Corning, Costar, EE.UU.). En la parte inferior, así, se añadieron 600 l de DMEM suplementado con FBS al 15%. Las células se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Las células aquellos retenido en el pocillo superior se eliminaron por hisopo y los migrado hacia el lado opuesto del filtro se tiñeron con DAPI y se contaron bajo un microscopio de fluorescencia a 200 × magnificación. La capacidad invasiva de las células se determinó con Matrigel (Becton Dickinson) de filtros de policarbonato recubiertas con 8 micras poros de transwell 24 pocillos. La densidad de células de siembra, medio de cultivo, período de cultivo, y el método de evaluación fueron los mismos con el ensayo de migración.
Real-time RT-PCR
Se realizó el método de tiempo real RT-PCR como se describe [15]. Brevemente, el ARN total (1 g) de cada muestra se transcribió inversamente en 20 l utilizando 0,5 g de oligo dT y 200 U superíndice III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). La amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 20 l que contenía 0,5 mM de cada cebador, MgCl 4 mM
2, 2 l de LightCycler ™ -FastStart ADN Maestro SYBR Green I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA) y 2 l de 110 diluyó cDNA. Las reacciones de PCR se prepararon por duplicado y se calienta a 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 60 ° C durante 1 min, y extensión a 72 ° C durante 20 seg. Las curvas de calibración (valores de ciclo umbral frente a la concentración de plantilla) se prepararon para cada gen diana y para la referencia endógena (GAPDH) en cada muestra. La cuantificación de las muestras desconocidas se realizó mediante la versión del software de cuantificación relativa LightCycler 3.3 (Roche).
Análisis de citometría de flujo, clasificación y separación MACS-
Las suspensiones de células cancerosas levantadas con EDTA se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante 30 min a 4 ° C con FITC o PE-conjugados anticuerpos monoclonales para marcadores CD humanos en 50 l de tampón de lavado (PBS, 2% de FBS). Después de la incubación, las células con los anticuerpos unidos se lavaron dos veces con tampón de lavado y se fijaron en paraformaldehído al 1% (en PBS). Los anticuerpos de isotipo de ratón sirvieron como controles respectivos. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan software CellQuest de rodadura (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células usadas para la clasificación se preparó como el método para la citometría de flujo con toda la aséptico reactivos y sin ninguna fijación. la separación celular magnética (MACS) de las células CD133 + se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx). Después de la incubación con CD133-microperlas inmunomagnéticas (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania) durante 30 min a 4 ° C, las células se lavaron en PBS más 0,5% de BSA más EDTA 2 mM, se filtró a través de un filtro de células de 40 m, y de ejecución más de un dispositivo de separación celular magnética (Auto-MACS; Miltenyi Biotec). para la selección positiva de las células CD133 +
Análisis Western Blot
Los extractos celulares se prepararon con M-PER (Pierce, Rockford, IL ) más cóctel inhibidor de proteasa (Halt ™; Pierce) y las concentraciones de proteína se determinaron usando el ensayo BCA (Pierce). Las alícuotas de los lisados de proteínas se separaron en% geles de poliacrilamida-10 de SDS y se transfirieron a filtros de membrana de PVDF, que se bloquearon con 5% de leche grado Blot (Bio-Rad, Hercules, CA) en TBST (20 mM Tris-HCl [pH 7,6] , NaCl 137 mM, 1% de Tween 20). Membranas fueron sondearon con los anticuerpos primarios indicados, se hacen reaccionar con anticuerpos secundarios correspondientes, y se detectaron usando un ensayo de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA). Las membranas se expusieron a una película de rayos X para visualizar las bandas (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Los anticuerpos contra pPP2A (# 12615; Santa Cruz), PP38 (# 9216; Señalización Celular), pMAPKAPK2 (# 3007; Señalización Celular), pHsp27 (AF2314, R & amp; D), β-tubulina (# 05-661; Millipore), e-cadherina (# 4065; Cell Signaling), N-cadherina (# 4061; Cell Signaling), vimentina (MAB3400; Millipore), fibronectina (sc-8422; Santa Cruz), pJak2 (# 3771; Cell Signaling) y PC- se utilizaron; (Señalización celular#2101) src en Tyr416. PP2 y PP3 se adquirieron de Calbiochem.
inmunofluorescencia y tinción inmunohistoquímica
Por inmunofluorescencia, las esferas se trataron con tampón de bloqueo, se incubaron con anticuerpos de ratón o de conejo contra CD133 humana (IgG de ratón AC133, Miltenyi) , CK 20 (Ks20.8 ratón IgG2a, GeneTex, San Antonio, TX), CDX2 (Chemicon, Temecula, CA), y β-catenina (H-102, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA), a diluciones apropiadas durante la noche a 4 ° C, se lavaron extensamente con PBS, y se hace reaccionar con el correspondiente isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con anticuerpos secundarios. La inmunofluorescencia se observó con el microscopio de fluorescencia. Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones de tumor embebidas en parafina fueron desparafinados, rehidratada y el antígeno recuperados mediante la colocación de las secciones en Declere solución de trabajo (Cell Marque, Austin, TX) en un horno microondas durante 20 min. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3%. actividad enzimática residual se eliminó por lavados en PBS, y la tinción no específica fue bloqueada con V Bloque Ultra para 5 min (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). A continuación se hicieron reaccionar las secciones con primeros anticuerpos durante la noche a 4 ° C, se lavaron extensamente con PBS, y se hicieron reaccionar con anticuerpos secundarios biotinilados correspondiente (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 15 min a temperatura ambiente y se trató con estreptavidina-peroxidasa (LSAB Kit; Dako, Carpinteria, CA), seguido de tinción con diaminobencidina. Contratinción se realizó con hematoxilina de Mayer
Detección detección de la fosforilación de RTK y Familia de la MAPK
Las membranas de la matriz Kit humano fosfo-tirosina quinasa del receptor (número de catálogo ARY001;. R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y el Kit de matriz humano fosfo-MAPK (número de catálogo ARY002; R & amp; D Systems) se bloquearon con la matriz del separador I por 1 h. Diluidas lisados de proteínas en la matriz del separador que se incuba durante la noche a 2-8 ° C (o 2 horas a temperatura ambiente). Las membranas se lavaron tres veces con 1 x tampón de lavado a temperatura ambiente, y se incubaron con anticuerpos de detección recién diluido durante 2 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron y se detectaron usando un ensayo de quimioluminiscencia. Las membranas se expusieron a una película de rayos X para visualizar los puntos
Producción de Lentiviral del vector y la infección de la célula
Los plásmidos de expresión y los clones de bacterias para Hsp27 shRNA. (ShRNA1: TRCN0000008753, shRNA1: TRCN0000011466) fueron proporcionados por el núcleo de ARNi Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán. Los vectores lentivirales de ARNhc se produjeron por transfección de 293FT células utilizando Lipofectamine 2000 (LF2000; Invitrogen, Carlsbad, CA). Los sobrenadantes se recogieron 48 h después de la transfección y después se filtraron. células subconfluentes se infectaron con lentivirus en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich). A las 24 h post-infección, retiramos medio y se reemplaza con medio de cultivo fresco que contenía puromicina (4 mg /ml) y se seleccionan las células infectadas durante 48 h.
fosfatasa PP2A Ensayo de actividad
PP2A la actividad se ensayó usando el kit de fosfatasa V2460 (Promega, Madison, WI). Brevemente, las células separadas por MACS o enriquecidos para los tics se lisaron en tampón de almacenamiento de la fosfatasa, seguido de la eliminación de fosfato endógena utilizando columnas de centrifugado por el sistema de ensayo de fosfatasa serina /treonina. 1 mg de proteína en muestras por triplicado se incubaron con fosfopéptido en tampón de reacción PP2A durante 2 h a temperatura ambiente. Después del lavado, las muestras se colorized por mezcla de colorante durante 15 min, seguido de parada de la reacción, y se midieron los valores de DO a 600 nm. Los datos se normalizaron con las células de control como el 100%.
Análisis estadístico
Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre los dos grupos fueron analizados por la prueba t de Student. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
La hipoxia y Suero agotamiento aumentar la población de células CD133 +
La exposición de células de cáncer de colon que tanto la hipoxia y suero. medio libre resultó en un gran número de muerte celular, lo que sugiere la mayoría de las células tumorales no sobrevivir en estas condiciones. Sin embargo, se encontró que el porcentaje de células de células HT-29 de cáncer de colon CD133 + aumentó algunas veces en condiciones de hipoxia y también con medio libre de suero, en comparación con condiciones de normoxia. Sin embargo, en ambos hipoxia y suero condiciones medio libre, la población CD133 + se aumentó hasta casi 30 veces (Figura 1A). El aumento en el porcentaje de células CD133 + se observó después de 2 días y aún más dramáticamente en el día 4 o 6. Este aumento en las células CD133 + también se observó en las CCS y cultivos primarios de células de cáncer de colon de TS (fig. 1B). El aumento en el porcentaje de las células CD133 +, sin embargo, no se debió a un aumento en el número total de células CD133 +, ya que el número real de células CD133 + se redujo ligeramente junto con el aumento de la cultura en condiciones de hipoxia y suero condiciones medio libre (Figura 1C) o en comparación con el número de células CD133 + en virtud de medio de suero-contenido y /o condiciones de normoxia (Figura 1D). Dado que las células CD44 + y CD166 + también son considerados como los tics en el cáncer colorrectal [16], también preguntamos si estos marcadores se asociaron con CD133 y afectadas por la hipoxia y el agotamiento de suero. La mayoría de las células CD133 + se encontraron para ser negativos tanto para CD44 y CD166, sin embargo, con la hipoxia y suero agotamiento se observó un aumento en las células CD166 +, pero no CD44 + y la población de CD166 + era mucho más pequeña que la de CD133 + (Figura 1E) , lo que sugiere que la mayoría de la población CD133 + es distinta de las células + /CD44 + CD166. Como era de esperar, las células CD133 + se tiñeron negativo para CD29, CD90 y CD105, marcadores de células madre mesenquimales y CD45, marcador de células hematopoyéticas (Figura 1F). No hay células se tiñeron positivas para CD105 y CD45, y ninguno de estos marcadores se aumentaron bajo el agotamiento de suero y condiciones de hipoxia (Figura 1f).
(A) HT-29, se sembraron células de CCS y HCW (B) con medio de crecimiento normal (FBS) bajo normoxia (Nor). Las células se expusieron al agotamiento de suero (SF), hipoxia (Hyp), la hipoxia y el suero de agotamiento, o, como control, bajo la misma condición, y 2, 4 o 6 días después, las células se recogieron para el ensayo de porcentaje CD133 por el flujo de citometría. (A la izquierda del panel C) El número total de células para cada condición y (panel derecho C) el número de células de CD133- y CD133 + de las células HT-29 en el período indicado en condiciones de hipoxia y el agotamiento de suero se midieron. (Panel de la izquierda D) Total número de células y (D panel de la derecha) el número de CD133 + y células CD133- de CCS y las células de TS a los 4 días bajo cada condición. (E y F) Citometría de flujo para los perfiles de proteínas de superficie de las células cultivadas bajo control o bajo la hipoxia y el agotamiento de suero durante 4 días.
CD133 + células poseen propiedades de TIC colorrectal
Para abordan, además, si el CD133 + población son bona fide TIC colorrectales hemos utilizado las siguientes propiedades asociadas con tics colorrectales en la literatura para caracterizar el CD133 + población. Dado que una característica esencial de la capacidad de las TIC es formar esferas indiferenciadas (esferoides) [2], nos preguntamos si las células CD133 + aisladas de la hipoxia y el agotamiento de suero poseen la capacidad. Encontramos que las células CD133 + fueron capaces de formar esferas más fácilmente que las células CD133- cuando se cultivan en medio libre de suero suplementado con EGF y FGF2 (Figura 2A). Como era de esperar, las células en las esferas fueron positivas para CD133, pero negativo para marcadores diferenciadas de los tumores colorrectales, es decir, β-catenina nuclear (activa β-catenina), citoqueratina 20 (CK20) y el caudal tipo homeobox factor de transcripción 2 (CDX2) (Figura 2B y 2C), que indican estas esferas eran esferas indiferenciadas. Para investigar si la población enriquecida CD133 + en las esferas posee la capacidad de formar marcadores diferenciadas de los tumores colorrectales, esferas CD133 + se sembraron en matrigel y se expusieron a medio que contenía suero. Después de cultivar en estas condiciones durante 2 semanas, empezaron a formar esferas diferenciadas que se vieron reducidos en la tinción CD133 positivas para β-catenina nuclear, CK20 y CDX2 (Figura 2B y 2C). Es importante destacar que, para las células CD133 +, la inyección de menos de 1.000 células fue suficiente para formar tumores cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes, pero incluso con 100.000 células, CD133- no fueron capaces de formar tumores (Figura S1A). De esperar, tumores formados por células CD133 +, similares a tumores formados por células a granel, se tiñeron positivamente para los marcadores de cáncer colorrectal (Figura S1B). Por otra parte, los tumores de xenoinjertos formados por CD133 + también contenían CD133 + y células CD133- (Figura S1B), y el CD133 + población aislado de tumores de xenoinjertos formado una población de células mezcladas con células CD133 + y CD133-
ex vivo
, mientras que el CD133- población todavía dio lugar a CD133- células (Figura s1c). Estos datos demostraron células CD133 + xenoinjertos de tumores formados y dieron lugar a dos células CD133 + y CD133-, sugiriendo que estas células CD133 + poseían las propiedades de los tics. Además, RT-PCR cuantitativa demostrado que las células CD133 + tuvieron un aumento de la expresión de genes relacionados con varios de células madre, incluyendo, Oct4, Nanog, nestina, KLF4, Notch1, Notch 2 y Notch 3, c-myc, Gil1, Wnt5a y VEGF (Figura 2D y Figura S2). Oct4 y Nanog se expresan exclusivamente en las células madre embrionarias [17], nestina se expresa en células madre neurales pluripotentes [18], mientras que KLF4, c-myc, y genes de Notch, SHH, y vías de Wnt se expresan en TICs de una variedad del cáncer [19], [20], [21]. VEGF es uno de los supuestos objetivos de la hipoxia inducible factores-1α (HIF-1α) [22]. HIF1-α también se ha demostrado que induce la transición epitelial-mesenquimal (EMT) [23], que recientemente ha demostrado ser capaz de generar células con propiedades de células madre en el cáncer de mama [24]. Curiosamente, también se encontró que las células CD133 + disminuyeron en E-cadherina y el aumento de los marcadores de EMT tales como N-cadherina, vimentina y fibronectina por RT-PCR cuantitativa y análisis de Western blot (Figura 2E). Es importante destacar que, el aumento de los marcadores de EMT en las células CD133 + también se asoció con un aumento de la capacidad para la migración celular y la invasión, características de las células con un aumento de EMT (Figura 2F). Así, las células CD133 + poseen características EMT y aumentan los marcadores de células madre embrionarias y un gen diana HIF.
(A) Esfera capacidad de formación de las células CD133 + y CD133-. células CD133 + y CD133-, separadas por MACS después de 4 días cultivadas en hipoxia y el agotamiento de suero, se cultivaron bajo condiciones libres de suero en presencia de EGF (10 ng /ml) y FGF2 (10 ng /ml). formación de esferas se calculó a las 2 semanas (& gt; 25 o & lt; 25 indica el número de células de cada esfera.). Las barras de error representan la desviación estándar. (* P & lt;. 0.05 en comparación con las células CD133 según lo determinado por la prueba t de Student) (B) CD133 + células después de la separación MACS en día 4 de la exposición a la hipoxia y el agotamiento de suero, se cultiva en suero condición libre en presencia de EGF (10 ng /ml) y FGF2 (10 ng /ml), las esferas formadas en 2 semanas. La inmunofluorescencia muestra que estas esferas son esferas indiferenciadas (no diferenciadas), que son positivos para CD133, y negativo para β-catenina nuclear, CDX2 y CK20. Las esferas fueron luego sembradas en matrigel y se exponen a condiciones que contiene suero durante otras 2 semanas. La inmunofluorescencia muestra que estas esferas se diferencian (diferenciado), que disminuyen en la expresión de CD133, aumento en la expresión de β-catenina nuclear, CDX2 y CK20. Barra de escala, 20 micras (C) Los porcentajes de células positivas para CD133, β-catenina nuclear, CDX2 y CK20 se contaron. (D) y (E superior de dos paneles) RT-PCR cuantitativa para los niveles de ARNm, análisis de inmunotransferencia (E panel inferior). (F) la migración celular y la invasión de ensayo para las células CD133 + y CD133- después de la separación MACS en el día 4 de la exposición a la hipoxia y el agotamiento de suero. Los datos de las células HT-29 se muestran como resultados representativos.
CD133 + células son resistentes a la hipoxia y Suero de la apoptosis inducida por agotamiento
A continuación, investigaron si las células CD133 + podrían ser resistentes a la hipoxia y agotamiento de suero indujo apoptosis. De hecho, se encontraron células CD133 + a ser resistentes a la apoptosis como se mide por el ensayo de TUNEL, mientras que las células CD133- fueron positivas para la tinción de TUNEL (Figura 3A). Esta idea fue apoyada además cuando se recogieron las células HT-29 después de tres días de la hipoxia y el agotamiento de suero, y luego las poblaciones de células CD133 + y CD133- se volvieron a sembrar, respectivamente, para más de 16 h en las mismas condiciones y se analizaron usando el ensayo de APOPercentage. Aquí encontramos que en la población CD133- no fue significativamente más apoptosis que en las células CD133 + (Figura 3B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las células CD133 + que son resistentes a la hipoxia y suero agotamiento muerte celular inducida. Para dilucidar el mecanismo de CD133 + células resistencia a la apoptosis, nos preguntamos primero si esta resistencia se produjo a través de una vía de apoptosis dependiente de caspasas. Hemos encontrado que la expresión de genes de caspasas como la caspasa 9 y 3 se redujo en las células CD133 + en comparación con las células CD133- tanto en ARNm y los niveles de proteína, utilizando RT-PCR cuantitativa (Figura 3C) y análisis de transferencia Western (Figura 3D), respectivamente. Además, las células CD133 + también mostraron una cantidad reducida de las formas escindidas activas de la caspasa 9 y caspasa 3 (Figura 3D). Sin embargo, no se encontró ninguna diferencia aparente entre CD133 + y células CD133- en los niveles de proteína de fósforo IKK, nuclear NF-kB y de los objetivos, como las proteínas de survivina (Figura S3) Bcl-2 y. Estos resultados sugieren que la supervivencia de las células CD133 + de la hipoxia y el agotamiento de suero es mediada principalmente por la falta de la falta de la caspasa 9 y caspasa 3 de activación, pero independiente de NF-kappa B, BCL-2 y survivin.
(A ) tinción TUNEL para apoptosis se realizó después de la separación MACS de CD133- y las células CD133 + en condiciones de hipoxia y suero agotamiento durante 4 días. (B) CD133- y CD133 + células en condiciones de hipoxia y suero agotamiento durante 3 días se recogieron por separación MACS, se sembraron de nuevo en condiciones de hipoxia y suero de agotamiento, y el ensayo se llevó a cabo APOPercentage 16 h más tarde. (C) RT-PCR cuantitativa para los niveles de mRNA. (DF) se prepararon y utilizaron para (D, F) análisis de inmunotransferencia de los niveles de proteína, y (E) MAPK fosfo-anticuerpo matriz para lisados celulares de las células CD133 + y CD133- después de la separación MACS en día 4 de la exposición a la hipoxia y suero agotamiento el análisis de los niveles de las vías de señalización indicados. Los gráficos muestran cada una señalización normalizada después con el control. células CD133 + se redujeron en la expresión y la activación de la caspasa 9 y 3 y el aumento en la expresión de fosfo-Hsp27. Las barras de error representan desviaciones estándar. (* P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01, determinada por la prueba t de Student). Los datos de las células HT-29 se muestran como resultados representativos
Hsp27 es necesario para la supervivencia de las TIC bajo. la hipoxia y suero agotamiento
Como hemos constatado que había menos de la forma activa de la caspasa 9 y 3 (Figura 3D), el próximo investigado los mecanismos moleculares responsables de la falta de activación de la caspasa 9 y 3 en CD133 + Células. Con este fin, se utilizó rápido y sensible fosfo-RTK (fosfo-Tyr) y Arrays fosfo-MAPK (fosfo-Ser /Thr), y se compara la fosforilación de proteínas en varias rutas diferentes en las células CD133 + para CD133- células, bajo la condiciones de hipoxia y el agotamiento de suero. En general, no hubo diferencias significativas en la fosforilación de la tirosina entre el CD133 + y células CD133- (figura S4). Por otro lado, había varios Ser /Thr quinasa fosforilaciones que se incrementaron en las células CD133 +, el ser obvio Hsp27 (8,6 veces), en comparación con las células CD133- (Figura 3E). Por lo tanto, se evaluó adicionalmente la implicación de Hsp27 en CD133 resistencia + células a la apoptosis. La fiabilidad de fosfo-MAPK matrices se confirmó mediante análisis de transferencia de Western y CD133 + en efecto el aumento en la activación de la Hsp27, mientras que los niveles de fosforilación de ERK y Akt no cambiaron (Figura 3F). Por lo tanto, estos datos sugieren que la resistencia de las células CD133 + a la apoptosis está asociada con la activación de la Hsp27.
Hsp27 es necesario para la supervivencia de las TIC en condiciones de hipoxia y Suero agotamiento
Para investigar si la actividad Hsp27 es de hecho importante proteger CD133 + población de la apoptosis, se utilizó primero dos Hsp27-shRNAs y demostramos que la represión de Hsp27 (Figura 4A) de hecho sensibilizado apoptosis en la población CD133 + en respuesta a la hipoxia y el agotamiento de suero. Además, Hsp27 específica shRNA indujo una disminución en el aumento del porcentaje CD133 + en condiciones de hipoxia y las condiciones de medio libre de suero, en comparación con el shRNA revueltos (Figura 4B). Un aumento de la apoptosis también se observó con dos shRNAs Hsp27-específicas en las células CD133 + de HT-29 (Figura 4C). Resultados similares se observaron también en el cultivo primario CCS (Figura S5A). El análisis de transferencia Western también reveló un aumento en la escisión de la caspasa 9 y 3 por Hsp27 específica shRNAs (Figura 4A). Además, dos inhibidores de Hsp27 estructuralmente distintas, quercetina y KRIBB3 (específico para la fosforilación Hsp27) [25], también aumentaron la escisión de las caspasas 9 y 3 en las células HT-29 (Figura 4D) y células de CCS (Figura S5B) e indujeron una disminuir en el aumento del porcentaje de células CD133 + en condiciones de hipoxia y suero de agotamiento (Figura 4E) y dio lugar a la apoptosis en las células CD133 + (Figura 4F), como se esperaba, el inhibidor de PI3K-Akt, LY294002 y ERK inhibidor, U0126 no indujo estos efectos ( Figura S5C y S5D). Se debe mencionar que la quercetina es conocida para inhibir Hsp27, Hsp70 y Hsp90. Por lo tanto, hemos examinado también la activación de Hsp90 y Hsp70 en el CD133 + y poblaciones CD133- (Figura 3F). Los resultados demuestran que no hay diferencia en el pHsp70 y pHsp90 entre las dos poblaciones de células. Así, entre las tres proteínas Hsp, Hsp27 parece ser el único que se activa en las células CD133 +, por lo tanto el efecto quercetina es probablemente causado por la inhibición de Hsp27. En conjunto, estos resultados sugieren que la Hsp27 es necesaria para la supervivencia de TIC en condiciones de hipoxia y suero agotamiento.
Las células fueron transfectadas con lentivirally Hsp27 shRNA (shR1 y SHR2) o revueltos shRNA, entonces expuestos a la hipoxia y el agotamiento de suero . CD133 + y células CD133- se aislaron utilizando separación MACS 4 días más tarde.