Resumen
Los microtúbulos son un objetivo altamente validado en la terapia del cáncer. Sin embargo, el desarrollo clínico de agentes de unión a tubulina (TBA) se ha visto obstaculizada por problemas de toxicidad y quimio-resistencia y ha hecho necesaria la búsqueda de nuevas parteras tradicionales. Aquí, se presenta la identificación de una nueva molécula permeable celular, la tubulina-desestabilizar - 4,5,6,7-tetrahidro-1H-indazol-3-carboxílico [1p-tolil-met (E) iliden] hidracida (denominado como Suprafenacine, SRF). SRF, identificado por
in silico
selección de bibliotecas químicas comentadas, se demostró que se unía microtúbulos en el sitio de la colchicina de unión e inhibir la polimerización. Esto condujo a la detención del ciclo G
2 células /M y la muerte celular a través de una vía de apoptosis mediada por mitocondrias. La muerte celular fue precedida por la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, JNK - mediada por la fosforilación de Bcl-2 y Bad, y la activación de la caspasa-3. Curiosamente, SRF se encontró que inhibe selectivamente la proliferación de células cancerosas y fue eficaz contra las células cancerosas resistentes a los fármacos en virtud de su capacidad para evitar la resistencia a múltiples fármacos transportador de P-glicoproteína. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la SRF tiene potencial como un agente quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer y proporciona un andamio alternativo para el desarrollo de agentes anti-cáncer mejorados
Visto:. Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng L, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, un Agente indazol-hidrazida, dirige a las células del cáncer a través de microtúbulos desestabilización. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10.1371 /journal.pone.0110955
Editor: Ben CB. Ko, La Universidad Politécnica de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 10 Octubre, 2012; Aceptado: September 26, 2014; Publicado: 29 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Salud de Singapur subvención NMRC1177 /2008. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microtúbulos - polímeros largas, filamentosas, en forma de tubo - mediar un papel importante en la señalización celular, el transporte de cargas, el establecimiento de la polaridad celular, mantenimiento de la forma celular, la migración celular y la división celular [1], [2]. Compuesta de heterodímeros alfa y beta tubulina unida de forma de la cabeza a la cola, los microtúbulos no son polímeros simples de equilibrio; sino que son altamente dinámicas y estructuras de la dinámica de montaje y desmontaje rápido es crucial, en gran parte por sus funciones celulares. No es sorprendente que la polimerización de microtúbulos está sujeta a la regulación espacial y temporal apretado y esto se consigue en varios niveles, incluyendo (1) la transcripción de diferentes isotipos de tubulina que tienen diferentes funciones; (2) mediante la regulación de α /β - relaciones de tubulina y heterodímero de plegado (3) a través de varias modificaciones post-traduccionales de la tubulina, que a su vez, altera la localización de los microtúbulos y /o su interacción con las vías de señalización y (4) a través de la interacción con microtúbulos proteínas asociadas (MAP) como dineína y kinesin motor proteínas, stathmina, GOT, EB1, dynactin 1, RAC1, etc. [3] - [5]. Paradójicamente, la misma naturaleza dinámica de los microtúbulos también los hace muy sensibles a los inhibidores. Al alterar el comportamiento afinado de los microtúbulos, fármacos de unión de tubulina-interfieren con el proceso de la división celular y han demostrado ser muy eficaz en pacientes con cáncer [6].
La mayoría de los fármacos de unión a microtúbulos identificado hasta el momento han sido aislados de plantas o los organismos marinos durante pantallas a gran escala de productos naturales. medicamentos anti-mitótico microtúbulos específica se clasifican generalmente en dos grupos - los agentes desestabilizadores de microtúbulos tales como alcaloides de la vinca, la colchicina y agentes estabilizadores de microtúbulos tales como paclitaxel y docetaxel. Aunque los taxanos y alcaloides de la vinca todavía se administran para una amplia gama de tipos de cáncer y, a menudo se integran en los regímenes de quimioterapia de combinación [7], [8], el conjunto actual de fármacos de unión de tubulina-tiene varios inconvenientes. Cuando se compara con otros medicamentos contra el cáncer, fármacos de unión a microtúbulos son estructuralmente compleja, químicamente diversos y tienen baja solubilidad. Además, los fármacos activos se producen sólo en cantidades hora en la naturaleza y la escasez de sus fuentes naturales ha obstaculizado seriamente su desarrollo clínico. Aunque esta cuestión fue abordada por el desarrollo de métodos de síntesis parciales o totales [9] y por medio de la ingeniería metabólica de los compuestos intermedios de la vía [10], el problema todavía persiste en el desarrollo de nuevos compuestos que se unen a los microtúbulos se refiere. Otro inconveniente es la resistencia a fármacos causado por mutaciones y /o expresión de diferentes isotipos de tubulina como βIII-tubulina. La resistencia a fármacos también puede provenir de la sobreexpresión de bombas de eflujo de fármacos, incluyendo la resistencia a múltiples fármacos transportador de la P-glicoproteína (P-gp) o multirresistencia proteína asociada (MRP) [11]. Pacientes que están siendo administrados con agentes de unión a microtúbulos tienden a sufrir de neuropatía axonal periférica que limita la dosis tolerable [12]. A pesar de estas limitaciones, varios fármacos anti-mitóticos con diversos sitios de unión en la tubulina están en diversas etapas de desarrollo clínico. El arsenal de agentes de microtúbulos orientados con una mejor farmacodinámica y perfiles farmacocinéticos, toxicidad neurológica mínima y una eficacia de amplio espectro, sigue creciendo [13] - [15]. Idealmente, estos conductores también deben estar desprovisto de flujo de salida de drogas P-gp mediada y ser susceptible de enfoques de síntesis química fáciles.
En este trabajo se presenta un nuevo compuesto basado en el andamio indazol, 4,5,6 , 7-tetrahidro-1H-indazol-3-carboxílico [1p-tolil-met (E) iliden] hidracida (Suprafenacine o SRF), que muestra potentes propiedades contra el cáncer. Se discute la identificación de SRF usando
in silico
enfoque de cribado de alto rendimiento, su optimización química y la elucidación de su modo de unión a los microtúbulos. SRF desestabiliza microtúbulos que conducen a la detención del ciclo celular en la fase G2 /M y la muerte celular por apoptosis. Por otra parte, nos muestran que la SRF puede pasar por alto la P-glucoproteína transportadora, se dirige específicamente a las células cancerosas y es eficaz contra varios tipos de cáncer diferentes.
Materiales y Métodos
Productos químicos y anticuerpos
Nocodazol, paclitaxel (Taxol), vinblastina, colchicina y se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SRF se adquirió de ChemDiv mientras SB203580, PD98059 y SP600125 eran de Calbiochem (San Diego, CA). Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes empresas: vimentina, α- y β-tubulina, JNK-1, MDR-1, Bcl-2, PBCL-2 (T56), PBCL-2 (S70), PBCL-2 (S87) ( Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); pp38, pERK1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Denver, MA); monoclonal anti P-glicoproteína (MDR) (Sigma, EE.UU.) y monoclonal actina anticuerpos eran de BD Pharmingen (San Diego, CA). [
3H] vinblastina (actividad específica, 11,6 Ci /mmol) y perlas (SPA) de silicato de itrio de ensayo de proximidad de centelleo recubierta con estreptavidina se adquirieron de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). [
3H] colchicina (actividad específica 80,4 Ci /mmol) se obtuvo de Perkin Elmer (Boston, MA, EE.UU.).
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer humano (HeLa, MDA -MB-231, A549, HCT15, Jurkat, PC12 y SH-SY5Y) y líneas celulares de fibroblastos humanos (CCL-116 y WI-38) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). SNU16, línea celular de cáncer de estómago humano, se obtuvo a partir de la célula de Corea Línea de banco (KCLB, Seúl, Corea). El F10 humana línea celular epitelial primario, y la línea celular parental para los mutantes resistentes a los medicamentos, KB-3-1, y resistente a múltiples fármacos línea, KB-V1 fueron un generoso regalo del Dr. Peter Dröge (NTU, Singapur) y El Dr. M. Gottesman (NCI, Bethesda, MD), respectivamente [16]. Las líneas celulares se cultivaron en cualquiera de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, 1% de penicilina /estreptomicina y se mantuvo a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 cámara. Para KB-3-1 y KB-1V, el medio se complementa con un piruvato adicional 1 mM de sodio y 10 g /ml de vinblastina, respectivamente. Todas las líneas resistentes se incubaron en medio libre de drogas antes de los ensayos de proliferación celular.
análisis del ciclo celular
progresión del ciclo celular se monitorizó mediante citometría de flujo de ADN. Las células se sembraron a una densidad de aproximadamente 2 x 10
5 células /pocillo en una placa de 24 pocillos. Cuando las monocapas fueron 50-70% de confluencia, las células se trataron con fármacos como se indica. Después de 24 h de tratamiento, las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se fijaron en etanol al 80% durante 1 hora a -20 ° C. Las células fijadas se volvieron a suspender en yoduro de propidio (PI) tampón de tinción (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 10 mM, 50 mg /ml PI, 10 g /L de RNasa A, 0,1% NP-40) durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. El contenido de ADN se determinó en un citómetro de Sistema (BD Biosciences, San Jose, CA). Para cada análisis, se contaron 10.000 células y el porcentaje de células en cada fase se calculó usando el software ModFit LT.
Apoptosis ensayos
La apoptosis se vigila por medio de la anexina V-yoduro de propidio (PI) doble método de tinción. Las células se tiñeron utilizando el kit de tinción con anexina V-Flous (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron por un citómetro de flujo BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) usando el 488 láser azul nm para la excitación y un 505LP espejo de 530/30 BP filtro y 550LP espejo-575/26 de filtro BP combinaciones para detectar fluoresceína y PI fluorescencia, respectivamente. Para cada muestra, se recogieron 10.000 eventos.
membrana mitocondrial medidas de potencial
Los cambios en el potencial de membrana mitocondrial se detectó usando el kit de detección de potencial de membrana mitocondrial (Stratagene, Cedar Creek, TX) y en base en el uso del colorante catiónico, 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-yoduro tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine (comúnmente conocido como JC-1). JC-1 forma fluorescente agregados rojos en las mitocondrias de células intactas, mientras que en las células apoptóticas, el colapso del potencial mitocondrial causa JC-1 permanezca en el citoplasma en su forma verde monomérica. Brevemente, las células se trataron con SRF, en presencia o ausencia de SP600125 JNK-inhibidor, y se incubaron durante la noche. Las células fueron tripsinizadas, lavadas con PBS y se sedimentaron (400
g
, 5 min, RT). A continuación, gránulos (1 × 10
6 células /muestra) se resuspendieron en 500 l de 1 X solución de tinción JC-1 y se incubó durante 15 min a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera humidificada. Después de 2X lava con tampón de ensayo, las células se resuspendieron en un volumen final de 500 l de tampón de ensayo. intensidades de fluorescencia se midieron en un sistema BD FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) y el software CellQuest se utilizó para el análisis de datos. La pérdida de potencial mitocondrial se mide como la relación de la fluorescencia de rojo a verde; en comparación con las células no tratadas, esta relación disminuirá en las células apoptóticas.
caspasa Ensayo de Activación
Actividad de la caspasa-3 se midió usando el sistema de ensayo CaspACE (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el proveedor de protocolo. En resumen, 2 × 10
5 células /pocillo se sembraron en una placa de 6 pocillos. Cuando las monocapas fueron 50-60% de confluencia, las células se trataron con SRF en la presencia o ausencia del inhibidor de JNK, SP600125 y se incubaron durante la noche a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera humidificada. Después se recogieron las células, los gránulos se lavaron con PBS helado y se resuspendieron en Tampón de Lisis Celular. método de congelación-descongelación se utilizó para lisar las células y los lisados se mantuvieron en hielo durante 15 min. Tras la aclaración de los lisados por centrifugación (15, 000
g
, 20 min, 4 ° C), se utilizó el sobrenadante para determinar la actividad de la caspasa-3. En una placa de 96 pocillos, se añadió 2 l (10 mM) de sustrato Ac-DEVD-pNA a la mezcla de reacción que contiene lisado celular, DTT, caspasa tampón de ensayo y el agua desionizada en un volumen final de 100 l. Las placas se incubaron durante la noche a 20-22 ° C durante 4 h y se midió la absorbancia a 405 nm usando un lector de microplacas Benchmark Plus (Bio-Rad, Hercules). extractos de células no tratadas se utilizaron como control para los experimentos.
inmunofluorescencia Microscopía
Para la inmunohistoquímica, las células se fijaron con 3,7% PFA seguido de incubación en una solución de bloqueo (5% de BSA en PBS) durante 30 min a 4 ° C. Después se lava 3 veces con PBS, las células se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100, se lavaron 3 X con PBS y después se incubaron durante la noche con alfa- o beta-tubulina de anticuerpos a 4 ° C. Después del lavado, las muestras se incubaron con anticuerpo AlexaFluor 488 secundario conjugado (Molecular Probes, Eugene, Oregón) durante 1 h a temperatura ambiente. Las láminas fueron montados usando la solución a prolongar Oro anti-fade (Molecular Probes, Eugene, Oregón) que contiene DAPI y se visualizó en la ampliación 60X de un láser microscopía confocal de barrido Zeiss LSM META510. Todo el procesamiento y análisis de imágenes después de la adquisición se realizó utilizando el software MetaMorph (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA).
in vitro
la polimerización de tubulina Ensayo
polimerización de tubulina se medido
in vitro
utilizando el kit de ensayo de polimerización de tubulina (citoesqueleto, Denver, CO). Tubulina se disolvió en tampón 1 (TUBOS 80 mM, MgCl 2 mM
2, 0,5 mM EGTA pH 6,9, 10 mM reportero fluorescente, mM GTP 1) a una concentración final de 10 mg /ml. Para ensayar la polimerización de tubulina, una mezcla que contiene 85 l de tubulina (concentración final 2 mg /ml), GTP 4,4 l (de la 100 mM), 280 l de tampón 1 y 75 l de tubulina Glicerol Buffer (TUBOS 80 mM, MgCl 2 mM
2, EGTA 0,5 mM, glicerol al 60%, pH 6,9), se hizo y se mantuvieron en hielo. A continuación, 5 l de compuesto de ensayo, paclitaxel, tampón nocodazole o control se dividieron en alícuotas en cada pocillo de una mitad de la superficie de 96 pocillos, negro placa de fondo plano (Corning Costar). La placa se calentó durante 1 min en un lector de placas de 37 ° C pre-calentado. La polimerización se inició con la pipeta 50 l de mezcla de reacción /pocillo y controlada por la medición del cambio en la fluorescencia (E
x = 360 nm; E
m = 420 nm). La medición se realiza utilizando SpectraFluor Plus lector de microplacas (TECAN GmbH, Austria). Se tomaron lecturas cada minuto durante 1 h (total de 61 lecturas).
tubulina Competencia de Unión a proximidad de centelleo Ensayo
Este ensayo se realizó para la competencia de unión a la colchicina y vinculante vinblastina sitios en la tubulina y llevado a cabo en una placa de 96 pocillos. tubulina marcado con biotina (Citoesqueleto, Denver, CO) se disolvió en tampón G-PEM (80 mM TUBOS pH 6,8, mM de MgCl 2
2, EGTA 0,5 mM, GTP 1 mM y 10% de glicerol) a una concentración final de 0,8-1 mg /ml. [
3H] colchicina o [
3H] vinblastina (concentración final de 50 nM y 100 mM, respectivamente), 50 mM de SRF y 1,0 g de tubulina marcada con biotina se mezclaron en un volumen final de reacción de 100 l del G-PEM tampón y se incubaron durante 45 minutos a 37 ° C. Estreptavidina perlas de SPA (80 mg /pocillo) se añadió a cada mezcla de reacción y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 4 ° C. Las cuentas radiactivas se midieron usando un contador de centelleo Wallac Microbeta (PerkinElmer, Waltham, MA). Para las reacciones de control, la SRF fue omitido de la mezcla de reacción.
En Vivo
estudios de eficacia
inmunodeficiencia combinada severa (SCID) los ratones hembras, de 4-6 semanas de edad, se obtuvieron de Centro de Recursos Animales (Murdoch, Australia). Los ratones se implantaron subcutáneamente en el flanco con 1 x 10
7 HCT15 células de adenocarcinoma de colon humano. El tratamiento se inició cuando el tamaño del tumor alcanzó un 100-200 mm
3 o mayor. Los animales se trataron por vía intraperitoneal (i.p.) con 20 mg /kg SRF /dosis en la formulación de dosificación final o un vehículo de solución salina al 0,9%. Compuesto se le dio a los ratones portadores de tumores en los días 1, 4 y 7 después de la puesta en escena, y la masa tumoral [(longitud x anchura
2) /2] se determinó una vez por tres días durante 9 días.
análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron de forma independiente un mínimo de tres veces. Todos los datos cuantitativos se presentan como medias ± SEM. Las comparaciones entre los dos grupos se analizaron a través de los estudiantes de
t
de prueba, y los valores de
P
. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Identificación de SRF como una novela pequeña molécula de unión a tubulina-
para identificar nuevas moléculas contra el cáncer que actúan a través de la unión a tubulina, se inició un objetivo basado en
in silico
detección de pequeñas moléculas usando una biblioteca ChemDiv . Los éxitos iniciales identificados a partir de la pantalla virtual se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir tanto la proliferación celular y la polimerización de tubulina. De todos los compuestos sometidos a prueba, un derivado de hidrazida indazol - ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-indazol-3-carboxílico [1- (3-hidroxi-4-metoxi-fenil) met- (E) - iliden] hidrazida, se encontró que inhibe potentemente la polimerización de microtúbulos (IC
50 = 0,77 M). Para identificar adicionalmente los análogos con la mejora de potencias, estructura-actividad (SAR) Relación estudios se realizaron [Métodos S1] y una biblioteca enfocada de 72 análogos se sintetizó y se seleccionaron por su capacidad para inhibir la polimerización de microtúbulos. Este esfuerzo identifica el análogo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-indazol-3-carboxílico [1-
p-
tolil-met (E) iliden] hidracida (analógica 4; en adelante, SRF), como una molécula potente (IC
50 = 0,38 M) [Figura 1A].
(a) estructura química de SRF. (B) Efecto de la SRF en la polimerización de microtúbulos
in vitro
. tubulina purificada se incubó a 37 ° C en ausencia (DMSO) o en presencia de fármacos como taxol (3 M), nocodazol (10 mM), SRF y la absorbancia se midió a 420 nm cada 1 min durante un período de 60 min. SRF inhibe la polimerización de microtúbulos de una manera dependiente de la concentración como se indica por una disminución de la absorbancia con el tiempo. (C) micrografías confocal de células HeLa expuestas a la SRF, taxol y nocodazole. Las células se marcaron con el anticuerpo anti-tubulina conjugado con FITC. SRF tratamiento destruye por completo la intrincada red de microtúbulos. Barra de escala = 10 mM.
SRF inhibe la proliferación celular de diversos tipos de células cancerosas
Se utilizó un ensayo colorimétrico para evaluar el efecto antiproliferativo de la SRF en las células cancerosas derivado de una amplio espectro de tipos de tumores representativos - adenocarcinoma cervical (HeLa, KB-3-1, KB-V1), linfoma de células T (Jurkat), carcinoma gástrico (SNU-16), el cáncer de mama (MDA-MB-231), pulmón cáncer (A549), adenocarcinoma colorrectal (HCT-15) y neuroblastoma (SH-SY5Y) [Tabla 1]. Todas las líneas celulares de cáncer de prueba mostraron susceptibilidad a la SRF con IC
50 valores en el rango submicromolar (83-381 nM). Curiosamente, cuando se compara con el taxol, SRF exhibió mayor potencia hacia los HCT-15 líneas celulares de neuroblastoma SH-SY5Y y adenocarcinoma colorrectal. Por otra parte, también a prueba el efecto de la SRF en las células normales como la línea celular de fibroblastos de la piel CCL-116 y F10 línea celular epitelial humana primaria. Tanto CCL-116 y F10 mostraron mayor que 80% de supervivencia después de una exposición de 24 h a SRF mientras que la supervivencia sólo el 60% se observó cuando las mismas células se trataron con taxol en condiciones idénticas [Figura S1]. Tomados en conjunto, nuestros datos confirman que la SRF se dirige selectivamente a las células cancerosas y es eficaz contra varios tipos de cáncer diferentes.
SRF puede pasar por alto los p-glicoproteína de la bomba de eflujo de drogas
El éxito clínico de los fármacos utilizados en el tratamiento del cáncer ha sido obstaculizado por el desarrollo de resistencia a las drogas. El fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos se asocia a menudo con un aumento en la expresión de
MDR1
gen, que codifica P-glicoproteína (P-gp), una bomba de eflujo dependiente de energía. Para ser clínicamente relevante, SRF debe ser capaz de pasar por alto el flujo de salida de la P-gp mediada. Por lo tanto, se determinó el efecto de la SRF en la proliferación de la línea celular de carcinoma epidérmico KB-V1, una sublínea resistente a la vinblastina derivado de la generación parental KB-3-1 células [16] [Tabla 2]. Las células KB-V1 son altamente enriquecido en P-gp y muestran resistencia cruzada a la colchicina y adriamicina [Figura S2]. Comparación del efecto anti-proliferativo mediado por SRF y taxol reveló que SRF es 35 veces más potente que el taxol contra la línea celular KB-V1 mientras que ambos compuestos mostraron una eficacia similar contra las células KB-3-1, ya que estas células no son conocidos por sobreexpresan P-gp [17]. La capacidad de SRF a pasar por alto la P-gp probablemente explica por qué es más potente que el taxol en el neuroblastoma SH-SY5Y y HCT-15 células de adenocarcinoma colorrectal, ya que estos dos tipos de células cancerosas expresan niveles de la proteína P-gp [17] elevado - [19].
SRF desestabiliza ensamblaje de los microtúbulos por unión a la colchicina sitio de unión
para evaluar el modo de acción principal de la SRF, perfilamos su efecto sobre la polimerización de tubulina
in vitro
[Figura 1B]. Los resultados muestran que SRF inhibe la polimerización de tubulina de una manera dependiente de la concentración con una CI
50 de 0,38 M. Además, el efecto de los microtúbulos de alteración de SRF se comparó con fármacos dirigidos dos microtúbulos diferente, taxol, Nocodazol, conocidos como agentes anti-neoplásicos al interferir la polimerización de la tubulina. Notablemente, SRF afectado el inicio de la polimerización (fase de nucleación) y su tasa (fase de elongación) que resulta en masa de polímero de tubulina reducida. También se estudió el efecto de la SRF en el ensamblaje de los microtúbulos a nivel celular mediante inmunohistoquímica. Las células HeLa expuestas a SRF durante 24 h se fijaron y tiñeron con anticuerpos microtúbulos alfa- o beta-tubulina. En comparación con las células control no tratadas, que mantienen una intrincada red de microtúbulos y organizado, el tratamiento SRF causó una destrucción completa de esta red del citoesqueleto y la aparición de abundantes paquetes cortos, característicos que fueron distribuidos por todo el citoplasma de estas células [Figura 1C]. interrupción similares de los microtúbulos se observó con la exposición nocodazole mientras que el tratamiento con taxol producido más corto, pero los microtúbulos más densas consistente con su papel como agente de estabilización de microtúbulos [Figura 1C].
Los compuestos que inhiben la polimerización de tubulina en su mayoría se unen a la conocida distinta sitios, a saber, taxol, vinblastina, sitios orcolchicine de tubulina. Un ensayo de proximidad de centelleo de unión competitiva (SPA) se utilizó para probeSRF sitio de unión en la tubulina. SRF no redujo los recuentos de SPA específicos estimulados mediante la conjugación de la tubulina marcado con biotina con [
3H] taxol o con [
3 H] vinblastina, pero fuertemente compitió por la unión de [
3H] colchicina a la tubulina [Figura 2A y 2B]. A continuación, se realizaron estudios de modelos moleculares y de conexión para comprobar aún más el modo de unión de SRF. Usando la estructura cristalina de la tubulina-colchicina: dominio stathmina-como (PDB 1SA0), tanto la colchicina [Figura 2C] y SRF [Figura 2D] se acopló en el bolsillo de unión a la colchicina de la tubulina. A pesar de la disimilitud estructural, SRF comparte el mismo espacio cartesiano como colchicina. A diferencia de la colchicina, la SRF carece de interacciones de enlace de hidrógeno con Cys241 de la cadena β. En lugar de ello, el anillo de indazol de SRF forma la interacción de enlaces de hidrógeno con Asn349, Lys352 de la cadena β, así como Val181 y Thr179 de la cadena α mientras que el grupo 4-metilo de las formas de anillo de fenilo distal interacciones hidrófobas con la cadena β Lys 254. en conjunto, los estudios de acoplamiento ponen de manifiesto que a pesar de SRF y colchicina se unen al sitio idéntico en la tubulina, SRF tiene un modo de unión ligeramente diferente de la de la colchicina [Figura 2E].
(a) SRF compite con colchicina para la unión a los microtúbulos como se determinó utilizando el ensayo de proximidad de centelleo de unión competitiva-(SPA). En comparación con el control (sin competidor), SRF disminución de la unión en 2,5 veces la colchicina. Los datos se muestran como medias ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 frente al control. (B) SRF y vinblastina tienen distintos sitios de unión de tubulina como SRF no compite con vinblastina. Los resultados mostrados son la media (± DE) de tres experimentos independientes. Los datos se muestran como medias ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05 frente al control. (C-E) la representación de la historieta de modo de la colchicina (C) y SRF (D) de unión a la tubulina. El modo de unión de los fármacos a la tubulina se examinó mediante estudios de acoplamiento utilizando ORO programa de acoplamiento molecular (optimización genética para el ligando de acoplamiento, Cambridge cristalográfica Data Centre, Reino Unido) [Métodos S1]. Los compuestos (colchicina o SRF) se acoplan en el bolsillo de unión a la colchicina de la tubulina usando la estructura cristalina de la tubulina-colchicina: stathmina-como dominio [código PDB: 1SA0]. se resaltan las interacciones H-enlace entre el anillo de indazol de SRF y N349 y K352 de la cadena β (verde), así como el T179 y V181 de la cadena α (azul). Panel E muestra la superposición de SRF y colchicina destacando la diferencia en los patrones de estas moléculas de unión.
detenciones SRF del ciclo celular en /M-fase G2
Desde dinámica de los microtúbulos tiene un papel importante en la progresión del ciclo celular, parada mitótica puede dar lugar a diversos resultados quimioterapéuticos incluyendo la muerte mitótico, la salida de mitosis, la apoptosis o la aneuploidía [11], [20]. Para estudiar el efecto de SRF en la progresión del ciclo celular, las células HeLa se trataron con diferentes concentraciones de SRF por 24 h y el ciclo celular se monitorizó mediante citometría de flujo. tratamiento SRF causó un colapso completo de todas las células en el G
1 de fase en una forma dependiente de la dosis y el aumento dramático en el G
2 /población M de las células tratadas con 10 mM de SRF [Figura 3A y Figura S3]. Se observaron efectos similares sobre los microtúbulos con nocodazol y el taxol. detención del ciclo celular fue acompañado por el fracaso del huso mitótico para segregar en las células que se dividen rápidamente [Figura 3B]. Sin embargo, ningún aumento significativo en el G se observó
2 /M fase en líneas de células normales (CCL-116, WI-38 y F10) por tratamiento SRF [Figura S4]. Desde la detención del ciclo celular, invariablemente, desencadena la apoptosis, se realizó la anexina V-PI doble tinción en las células tratadas con SRF con el fin de monitorear la exposición de fosfatidilserina, una señal de apoptosis temprana. Después de una breve exposición de 7 h, la población de células apoptóticas tempranas (anexina V
+ /PI
-) aumentó dramáticamente desde el 2,4% al 21,7% [Figura 3C], lo que indica que la SRF induce una rápida apoptosis en células proliferantes .
análisis de citometría de (A) de flujo del contenido de ADN de las células tratadas con SRF (10 mM), nocodazol o taxol. Histogramas mostrados son representativos de un parámetro de las células tratadas. Como taxol y nocodazol, la inhibición mediada por SRF de la dinámica de microtúbulos resultó en la detención del ciclo celular en el G
fase de transición 2 /M. (B) Las micrografías de fluorescencia de células mitóticas que había sido pre-tratadas con los compuestos indicados. En comparación con las células tratadas de vehículos, SRF y de otros tipos inhibe la PT y la segregación del huso mitótico. Los microtúbulos (verde) se tiñeron con anticuerpo anti-tubulina conjugado con FITC; núcleo (azul) fue teñido con DAPI. Las imágenes fueron adquiridas en la ampliación 60X. Barra de escala = 5 M. (C) SRF-tratamiento induce apoptosis rápida en células proliferantes. Después de una breve exposición SRF 7 hr (10 M), la progresión de la apoptosis se controló por las células de doble tinción con anexina V-FITC (FL-1) /PI (FL-2). Durante este período, el porcentaje de anexina V
+ /PI
- (indicando principios de la apoptosis) de las células aumentó de 2,4% (en el control) al 21,7%. La cinética de este incremento es similar a la observada con nocodazol y el taxol. Tanto estos compuestos inducen la apoptosis en aproximadamente el 25,4% (nocodazole) y el 33,2% (taxol) de células dentro de este período de tiempo. Los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3) y se promedió el valor de datos.
SRF induce la apoptosis a través de la fosforilación de JNK mediada de Bcl-2 y Bad
El Bcl 2 familia de protooncogenes es reguladores maestros de la apoptosis y funcionar como reóstatos moleculares para el control de la supervivencia celular [21]. Dado que los fármacos anti-mitótico como paclitaxel, vincristina, vinblastina, inducir la Bcl-2 en la hiperfosforilación de la región del bucle [22] - [26], se investigó el efecto de la SRF en Bcl-2. Los extractos de células HeLa tratadas con SRF 10 mM durante 24 h se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2. Los resultados muestran que, junto con un Bcl-2, células tratadas con SRF tienen banda (s) adicional que tiene la tasa de migración más lenta en comparación con Bcl-2 [Figura 4A, panel superior]. En contraste con las células HeLa, las células tratadas con vehículo carecían completamente la banda extra. Asimismo, el estado de fosforilación de Bcl-2 en la línea celular de fibroblastos diploides normales de pulmón WI-38 se mantuvo sin cambios incluso después del tratamiento 24 h SRF [Figura 4A, el panel medio]. Para confirmar que la banda (s) son de hecho formas fosforiladas de Bcl-2, blots fueron sondadas con fosfo-Bcl-2 anticuerpos específicos. SRF indujo la fosforilación de Bcl-2 en múltiples residuos (T56, S70 y S87), todos los cuales se encuentran dentro de una región bucle flexible [Figura 4B]. En conjunto, estas observaciones reiteran aún más el hecho de que las células cancerosas SRF objetivos selectivos. Además de Bcl-2, un 24 h de exposición al tratamiento SRF también indujo la fosforilación del miembro de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos - Bad [Figura 4C], mientras que Bcl-x
L, Bak y Bax no se vio afectado [Figura S5].
(a) Western blot de extractos de células HeLa y WI-38 tratadas con SRF 10 mM durante 24 horas y se sondearon con el anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2. Una banda de migración más lenta que corresponde a la forma fosforilada de Bcl-2 está presente en HeLa extractos pero ausente de WI-38 lisados, mostrando que SRF induce la fosforilación selectiva de Bcl-2 en células de cáncer. (B) SRF media Bcl-2 hiperfosforilación. Drogas tratados lisados HeLa se resolvieron en 12% SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizó mediante fosfo-anticuerpos específicos contra T56, S70 y S87 residuos de Bcl-2; todos estos aminoácidos se encuentran en la región del bucle flexible de la proteína. Curso de Análisis (C) Tiempo de la fosforilación inducida por el tratamiento inadecuado SRF. lisados de células HeLa se analizaron por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal anti-Bad. SRF (10 mM) de tratamiento alteración del estado de fosforilación de la proteína pro-apoptótica de Bad como se indica por la aparición de una banda de fosfo-Bad de migración más lenta en 24 h. La banda estaba ausente de control (DMSO tratada) las células, incluso después de 24 h.
Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), expresados en todos los tipos celulares, la transducción de señales desde la membrana celular al núcleo en respuesta a una variedad de estímulos y también regulan un amplio espectro de procesos biológicos críticos para la homeostasis celular [27]. Entre las diferentes vías mediadas por miembros de la familia MAPK, la señal extracelular regulada quinasa-1 y 2 (ERK1 2 /), c-Jun N-terminal quinasa /estrés proteína quinasa activada (JNK /SAPK) y MAPK p38, se sabe que