Extracto
El glutatión peroxidasa selenoproteína-2 (GPx2) parece tener un doble papel en la carcinogénesis. Si bien protegido los ratones de cáncer de colon en un modelo de carcinogénesis inflamación desencadenada (azoximetano y tratamiento dextrano sulfato de sodio), se promovió el crecimiento de las células tumorales xenoinjertados. Por lo tanto, analizamos el efecto de GPx2 en un modelo de ratón imita el cáncer colorrectal (sólo azoxymethane-tratamiento) esporádica. GPx2 knock-out (KO) y ratones de tipo salvaje (WT) se ajustaron a una ya sea algo deficiente (-se), adecuada (+ Se), o supranutritional (++ Se) el nivel de selenio y fueron tratados seis veces con azoximetano (AOM ) para inducir el desarrollo de tumores. En los grupos -se y ++ Se, el número de tumores fue significativamente menor en GPx2-KO que en ratones WT respectivos. En la dieta + Se, el número de criptas displásicas se redujo en ratones GPx2-KO. Esto puede explicarse por más basal y la muerte celular apoptótica inducida por AOM en ratones GPx2-KO que elimina las células epiteliales dañadas o pre-malignas. En WT criptas displásicas GPx2 fue hasta reguladas en comparación con criptas normales que podrían ser un intento de suprimir la apoptosis. En contraste, en los números tumorales Grupos + Se fueron similares en ambos genotipos, pero el tamaño del tumor fue mayor en ratones GPx2-KO. Este último se asocia con un ambiente inflamatorio y promotor de tumores como obvio a partir de las células inflamatorias infiltradas en la mucosa intestinal de los ratones GPx2-KO incluso sin ningún tratamiento y se caracterizó como la inflamación de bajo grado. En los ratones WT el número de tumores tendía a ser más baja en comparación con + Se -se y ++ alimentación Se indica que el selenio podría retrasar la tumorigénesis sólo en el estado adecuado. En conclusión, el papel de GPx2 y, presumiblemente, también de selenio depende de la etapa del cáncer y, obviamente, relativo a la participación de la inflamación
Cita:. Müller MF, Florian S, S Pommer, Osterhoff M, Esworthy RS, Chu FF , et al. (2013) La supresión del desarrollo del cáncer El glutatión peroxidasa-2 inducida por azoximetano inhibe el colon. PLoS ONE 8 (8): e72055. doi: 10.1371 /journal.pone.0072055
Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 3 Junio, 2013; Aceptado: July 8, 2013; Publicado: 19 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Müller et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación alemana de Investigación (Br 778 /8-1). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. Los estudios epidemiológicos vinculados un nivel de selenio sub-óptima a un mayor riesgo de desarrollar CCR [1]. Esto es relevante para las poblaciones fuera de Norteamérica como Europa, donde los niveles de selenio en plasma promedio son de 90 mg /L (revisado en [2]). Las diferencias en los niveles de selenio en plasma iniciales de los sujetos participantes pueden haber contribuido a los resultados inconsistentes de los ensayos de intervención llevadas a cabo para estudiar las propiedades anti-cancerígenas putativos de los suplementos de selenio. En consecuencia, tanto la Prevención Nutricional del Cáncer (APN) y el selenio y la vitamina E para el Cáncer (SELECT) revelaron que los participantes entrar en el estudio con los niveles de selenio en plasma de ≥120 mg /L no beneficiarse de la administración de suplementos [2]. Desde selenoprotein P, el marcador más sensible para el estado de selenio [3], se satura a 120 mg de selenio /L de plasma, se sugiere que la prevención del cáncer mediada-Se depende de la expresión óptima selenoprotein [2].
El selenoproteome consiste en proteínas codificadas por 25 genes en los seres humanos [4]. Entre ellos se encuentran cinco peroxidasas selenio dependiente de hidroperóxido de reducción de glutatión (GPx), a saber GPx1-4 y GPx6. GPx1-4 se expresan en el epitelio intestinal murino [5], pero sólo GPx2 está predominantemente situada en la base cripta [6], [7], donde también las células madre intestinales residen. Además, GPx2 es altamente expresado en tumores colorrectales [6], [8], [9]. El papel de GPx2 durante el desarrollo CRC todavía no está claro. Por un lado, GPx2 disminución del número de tumores en un modelo de carcinogénesis de colon inflamación desencadenada después de la aplicación de azoximetano (AOM) y sulfato de dextrano sódico (DSS) actuando anti-inflamatoria [10]. Esto es consistente con la ileocolitis espontánea y el cáncer intestinal en /GPx2 ratones doble knockout GPx1 [11], [12]. Ambos podrían ser casi completamente rescatados por un alelo WT de GPx2 pero no de GPx1 [13]. Por otro lado, GPx2 parece apoyar la proliferación. Los tumores producidos por tratamiento OMA /DSS fueron menores en GPx2-KO que en ratones WT [10] al igual que xenoinjertos de tumores derivados de las células deficientes en GPx2 HT-29 en comparación con células de control [14]. Además, GPx2 está regulado por la β-catenina [7], [15] y ΔNp63 [16], tanto la proliferación inductor.
Los objetivos de este estudio fueron analizar el papel de GPx2 y selenio en un modelo en el que CRC es inducida únicamente por AOM, imitando así la carcinogénesis de colon esporádico en los seres humanos [17]. el desarrollo tumoral se controló en GPx2-KO y ratones WT alimentados con una dieta moderada deficiente en selenio (-se), -adequate (+ Se) o -supranutritional (++ Se). Desde OMA induce la activación de mutaciones en β-catenina (revisado en [18]), se analizó la co-localización de β-catenina nuclear y la expresión GPx2 mejorada.
Métodos
Animales y diseño experimental
ratones C57BL /6J WT y GPx2-KO, generados como C57BL /6J; 129SV /J híbridos habían sido backcrossed a los ratones C57BL /6J durante cinco generaciones [19] antes de entrar en el estudio como sus compañeros de camada. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente bajo condiciones específicas libres de patógenos con 12 h de ciclo de luz-oscuridad y acceso libre a comida y agua. Los ratones fueron alimentados con una dieta basada en la levadura torula (No. C1045, Altromin, Lage, Alemania) con un contenido de selenio basal de 0,054 mg por kg de dieta (-se). + Se y ++ dietas de Se se produjeron mediante la adición de L (+) - selenometionina (Acros Organics, Geel, Bélgica) para alcanzar una concentración de selenio final de 0,15 mg (+ Se) y 0,6 mg (++ Se) por kg de dieta, respectivamente [20]. El contenido de selenio se midió fluorimétricamente tal como se describe anteriormente [21]. los ratones recién destetados fueron alimentados con las dietas experimentales durante 4 semanas para ajustar el nivel de selenio antes de AOM-tratamiento y luego durante todo el experimento (fig. 1A). se inyectaron 10 mg /kg de peso corporal AOM (Sigma, Steinheim, Alemania) o un volumen igual de solución salina (Sigma) por vía intraperitoneal una vez a la semana durante seis semanas. Los efectos agudos de la OMA se analizaron en ratones 5 8 h después de la primera inyección de AOM (experimento a corto plazo). Los tumores se analizaron 16 semanas después de la última inyección de AOM (experimento a largo plazo). 20 AOM-tratada y 10 ratones tratados con solución salina por grupo se analizaron para la tumorigénesis y 5 animales adicionales se usaron para histología. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Gubernamental (MLUV 32-2347 /4 + 68). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones fueron anestesiados con Isofluran® y mataron por dislocación cervical. pesos del bazo se determinaron y muestras de tejidos se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
(A) los ratones recién destetados fueron alimentadas con una dieta experimental que era o selenio-deficiente (-se), -adequate (+ Se) o -supranutritional (++ Se) durante un mínimo de 4 semanas antes de la inyección de AOM. AOM se inyecta una vez a la semana durante seis semanas y los ratones fueron sacrificados 16 semanas después de la última inyección de AOM (experimento a largo plazo). Para estudiar los efectos agudos de AOM, los ratones fueron asesinados 8 h después de la primera inyección de AOM (experimento a corto plazo). Se determinó la actividad (B) Total GPx 8 h después de una sola inyección de solución salina (grupo de control del experimento a corto plazo) en el yeyuno y el hígado de los ratones GPx2-KO y WT. Los valores son medias + SD, n = 5. La significancia se calcula utilizando 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni. *** P≤0.001 vs. WT,
#P £ 0,05,
## p≤0.01, y
### p≤0.001 vs. + Se.
la histopatología de los tumores de colon y lesiones preneoplásicas
Para identificar tumores y lesiones preneoplásicas, el colon se abrió longitudinalmente y aplanado sobre papel de filtro y se fijaron en buffer fosfato formalina al 4%, pH 7,0 (Roth, Karlsruhe, Alemania). Para la identificación de tumores y focos de criptas aberrantes (FCA), el colon se tiñó con azul de metileno al 0,1% [22]. Posteriormente focos mucina empobrecido (MDF) se identificaron en el mismo tejido del colon mediante tinción secuencial con alto contenido de hierro diamina (HID) y 1% de azul de Alcian (AB). Las muestras se analizaron usando un microscopio estéreo (Olympus SZH10, Olympus Corporation, Tokio, Japón). La ubicación y el diámetro de las lesiones y el número de criptas en un ACF o MDF (multiplicidad cripta) se registraron. Todo MDF consta de más de dos criptas y todos los tumores fueron extirpados y verificado por hematoxilina y eosina (H & amp; E).
Secciones teñidas
La inmunohistoquímica e histoquímica
Los dos puntos de cinco animales tratados con AOM en el largo plazo experimento se preparó en forma de brazo de gitano para los análisis inmunohistoquímicos. Para estudiar el efecto a corto plazo de la OMA, inmunohistoquímica (IHC) se realizó en el colon distal de acuerdo con el protocolo descrito [20] con algunas modificaciones. tejidos de colon fijados en formalina se incluyeron en parafina y de sección delgada (2 micras). Después de la rehidratación, las secciones de tejido fueron calentados en tampón de citrato pH 6,0 (Dako, Glostrup, Dinamarca) para recuperar antígenos. La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en 3% H
2O
2 y las muestras se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios y sus diluciones fueron: anti-β-catenina (# 610153, BD Transducción Laboratories ™, Lexington, KY, EE.UU., 1:8.000), anti-ki-67 (M7249, Dako, 1:60), anti- antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA,#2714-1, Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU., 1:20.000), anti-p53 (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido, 1:1.600), anti-GPx2 antisuero [23] (1:12.000), y anti-F4 /80 (MCA497, Serotec, Kidlington (Oxford), Reino Unido, 1:8.000). anticuerpos o kits secundarios (N-Histofine® Mousestain kit, N-Histofine® simple mancha de ratón MAX PO para tejidos de ratón, anti-rata o anti-conejo, todos de Nichirei Biosciences, Tokio, Japón), se aplicaron durante 30 minutos en la sala de temperatura. Unión de los anticuerpos se visualizó con diaminobencidina (Dako). La inmunorreactividad se obtuvo de una manera ciega. La longitud de la zona de PCNA-positivas y longitud total cripta se midió utilizando Mirax Visor de Software (Versión 1.12.22.0, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) a partir de 100 criptas por animal. células F4 /80-positivas en la lámina propia a lo largo de criptas seccionadas transversalmente se anotó en 10 criptas por animal.
La cuantificación de células apoptóticas se realizó mediante criterios morfológicos en secciones teñidas con hematoxilina del colon distal en 200 longitudinalmente abierto criptas por animal como se describe [20]. Para identificar MDF en secciones de tejido, las mucinas se visualizaron por tinción secuencial con 1% AB, pH 2,5 y ácido periódico-Schiff (PAS) y la contratinción con hematoxilina. Serial secciones fueron teñidas con PAS /AB, H & amp; E, β-catenina, Ki-67, y GPx2 individualmente. β-catenina y la inmunorreactividad GPx2 se puntuó con respecto a la localización subcelular y la posición en la cripta. Un inmunorreactividad mejorada se define como una intensidad de tinción máxima mayor en comparación con el tejido normal adyacente o una ampliación de la zona positiva en las células o criptas o ambos.
Total GPx Actividad
La actividad GPx era medido en un ensayo de glutatión reductasa acoplados a [24] que se modificó para placas de microtitulación de 96 pocillos como se describe [20] usando un lector de placas de absorbancia (Synergy2 lector de microplacas, BioTek, Bad Friedrichshall, Alemania) a 340 nm. La actividad total GPx se calculó a partir del consumo mol de NADPH por minuto según la ley de Lambert-Beer y se expresa como proteína mU /mg.
Análisis estadístico
La comparación de dos grupos, diferencias significativas fueron calculados por el estudiante de desapareado t-test. Para la comparación de más de dos grupos, de 2 vías ANOVA seguido de post-test de Bonferroni se utilizó (GraphPad Prism versión 5.0, San Diego, CA, EE.UU.). la incidencia de tumores se analizaron mediante tablas de contingencia utilizando la prueba exacta de Fisher (SPSS, versión 16, IBM). Para tener en cuenta el número de tumores, tablas de contingencia se calcularon para la incidencia de tumores ponderado por el número de tumores. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
GPx2-KO ratones desarrollan menos tumores de AOM inducida que los ratones WT Bajo Ambos, un selenio-pobres y -supplemented. dieta
Después de alimentar a los ratones con dietas -Se ++ y se, la actividad GPx yeyunal y hepática se redujo significativamente y aumentó, respectivamente, en comparación con los grupos + se (Fig. 1B). Mayor actividad GPx se encontró en el yeyuno de GPx2-KO en comparación con los ratones WT en ++ Se dieta (Fig. 1B), presumiblemente causada por un compensatoria sobre regulación de GPx1 como hemos descrito anteriormente para íleon y el colon [20]. La localización intestinal de GPx2 se analizó mediante IHC en el colon de los ratones WT (Fig. S1A). GPx2 fue más alta en las bases de las criptas y no detectable en el tercio superior de las criptas. Se detectaron niveles similares de proteína GPx2 en el colon de los ratones WT en + Se ++ y dietas Se, mientras que la expresión GPx2 se había reducido regulado en dietas -SE.
Con el fin de probar el efecto de un GPx2- KO en el desarrollo de tumores, los ratones fueron retados seis veces con OMA y analizado 16 semanas después de la última aplicación de la OMA. Aunque la incidencia de tumores no fue significativamente diferente entre los grupos experimentales, los ratones -Se y ++ Se GPx2-KO tenía números tumorales significativamente más bajos que los ratones WT en las mismas dietas (Fig. 2A). Mientras que los números de los tumores fueron igualmente baja en ratones GPx2-KO con independencia del nivel de selenio (-Se: 5, + Se: 5, ++ Se: 3), número de tumores en ratones WT fueron mayores en el -Se ++ y grupos de Se que en el grupo + Se (-Se: 14 y ++ Se: 13 vs. + Se: 7). El nivel de selenio no afectó significativamente la incidencia de tumores o el número total de tumores. Todos los tumores fueron adenomas no invasivos localizados desde el colon transverso al recto [25].
16 semanas después de la última inyección de AOM se analizaron los ratones WT y GPx2-KO para la incidencia de tumores y el número total del tumor por grupo ( a) y para ACF que consiste en & lt; 4 criptas (B) o ≥4 criptas (C) por tinción con azul de metileno. MDF (D) se contaron en el colon manchado HID /AB. el número de FCA y MDF se muestran como gráficos de puntos de dispersión con media. diámetro del tumor se representa como caja y bigotes del mínimo al máximo (E). P-valores para (A) se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher. Para probar importancia para el número total de tumores, la incidencia de tumores fue ponderada con el número de tumores. P-valores para (B-E) se calcularon utilizando la prueba t de Student para datos independientes. * P £ 0,05 y ** p≤0.01 vs. WT,
#P £ 0,05 vs. -Se. No se observaron ACF, MDF o tumores en los controles tratados con solución salina (n = 10).
cuantificaron ACF y MDF, que ambos son considerados como marcadores preneoplásicas [26]. Nos diferenciamos entre ACF mínima (& lt; 4) y un alto (≥4) multiplicidad cripta ya que este último se supone que es un mejor biomarcador para el desarrollo de tumores que el anterior [26]. Números de ACF no se vieron afectados por las dietas de selenio (Fig. 2B y C). Mientras que los ratones WT -Se tendido (p = 0,06) a tener menos ACF con baja multiplicidad cripta de respectivos ratones GPx2-KO (Fig. 2B), los ratones WT -Se tuvo significativamente más ACF con multiplicidad alta cripta que los ratones GPx2-KO (Fig . 2C). También cuantificado MDF, que se caracterizan por cambios en la composición celular de la cripta incluyendo la pérdida de células caliciformes. En contraste con ACF, MDF siempre consisten en criptas displásicas probable que se conviertan en tumores [26], [27]. Sólo + Se WT ratones tenían significativamente más MDF comparación con los ratones GPx2-KO (Fig. 2D), mientras -Se y ++ ratones WT Se tuvieron más tumores que los ratones KO-GPx2 (Fig. 2A). Por lo tanto, en selenio-suficiencia de la diferencia entre genotipos sólo se detectó en el nivel de MDF. números tumorales fueron igualmente baja en ambos genotipos bajo + Se que podría implican que las condiciones para el desarrollo de tumores eran más apropiadas en -Se y ++ Grupos Se WT.
diámetro del tumor se midió como un parámetro para el crecimiento tumoral. GPx2 ratones KO y WT-sobre -Se ++ y dietas de Se tuvieron el tamaño del tumor similares, mientras que los tumores fueron significativamente mayores en + Se GPx2-KO que en ratones WT + Se (Fig. 2E). ++ Se GPx2-KO ratones tenían tumores más pequeños en comparación con los ratones -se GPx2-KO. En los grupos de WT, selenio en la dieta no afectó significativamente el tamaño del tumor.
GPx2 y β-catenina fueron elevados en las lesiones preneoplásicas
GPx2 expresión se incrementa especialmente durante las primeras etapas de la transformación neoplásica en el intestino humano [6], que podría estar mediado por β-catenina [7]. Para probar si la expresión GPx2 también se incrementa en las lesiones preneoplásicas de los ratones tratados con AOM, GPx2 se analizó mediante IHC en ratones + Se WT 16 semanas después de la última aplicación AOM. El /AB tinción PAS identificó 67 de MDF en cinco ratones. Serial secciones fueron teñidas con β-catenina, GPx2, y Ki-67. ß-catenina inmunoreactividad se incrementó en el 85% (57/67) del MDF en comparación con el tejido normal circundante, de acuerdo con los datos publicados [27]. inmunoreactividad GPx2 se incrementó en 67% (45/67) del MDF en comparación con criptas normales.
MDF se caracteriza además en función de su grado de displasia y multiplicidad cripta para determinar si GPx2 y β-catenina co-localizar . MDF con un grado menor de displasia tenía una morfología casi normal cripta, una baja multiplicidad, algunas células caliciformes restantes (Fig. 3A-I), y una distribución normal de las células Ki-67-positivas (Fig. 3A-IV). Estos MDF exhibió más localizado en la membrana β-catenina, que se detectó predominantemente en la parte luminal (Fig. 3A-II flecha azul) de la cripta o en criptas enteras en comparación con las criptas normales. inmunoreactividad GPx2 se aumentó ligeramente en la base cripta de los MDF en comparación con criptas normales y se extendía hacia el lado luminal (Fig. 3A-III flecha negro). Por lo tanto, en MDF con menor GPx2 displasia y β-catenina se encuentra elevado en diferentes células epiteliales.
Serie tinción IHC de los dos puntos brazos de gitano se realizó para PAS /AB, β-catenina, GPx2, y Ki-67 en cinco ratones + Se WT 16 semanas después de la última AOM-tratamiento (A-C). tinciones representativas de un MDF caracterizado por un grado menor de displasia y baja multiplicidad cripta (A), un MDF con displasia avanzada y más alta multiplicidad (B), y uno microadenoma (C). inflamación Florid en, los ratones -Se GPx2-KO tratada con AOM fue identificado por PAS /AB, F4 /80, y H & amp; E tinción (D). los pesos del bazo se normalizaron con el peso corporal (E). Medios + SD, n = 10 en tratado con solución salina y n = 20 en los grupos tratados con AOM. La significación se determinó a través de 2 vías ANOVA con post-test de Bonferroni. * P £ 0,05 vs. WT,
xP≤0.05 vs. solución salina.
MDF con displasia avanzada se caracteriza por una mayor multiplicidad, células epiteliales engrosadas, pérdida casi completa de las células caliciformes y mejorada ki-67 tinción (Fig. 3B-I y IV) y exhibió tanto β-catenina y la inmunorreactividad GPx2 más en toda la cripta (Fig. 3B-II y III). A nivel celular, GPx2 y β-catenina co-localizada en medio de MDF con displasia avanzada, lo que sugiere que los altos niveles de ambas proteínas eran sólo es detectable en un área específica de la cripta durante un tiempo específico de transformación displásica.
por otra parte, uno microadenoma se caracteriza por la pérdida completa de células caliciformes, perturbado arquitectura de las criptas (Fig. 3C-I), masiva sobre regulación de β-catenina nuclear y citoplasmática (Fig. 3C-II), y un alto número de células Ki-67-positivas (Fig. 3C-IV). En esta estructura, la expresión GPx2 se perdió completamente en la zona con elevada β-catenina, mientras que se mantuvo hasta reguladas en criptas que rodean menos indiferenciadas (Fig. 3C-II y III, puntas de flecha) con características similares a las de MDF con displasia avanzada.
AOM-ratones tratados GPx2-KO con selenio pobres Se desarrolló un florido inflamación en el colon
tratado con AOM
-Se ratones KO-GPx2 desarrolló una inflamación claro que van desde un moderado a un estado florida , que no se observó en ningún otro grupo (Fig. 3D). En el colon distal, la inflamación fue moderada tal como se caracteriza por la degeneración cripta, infiltración de células inmunes (que se muestra por las células mieloides F4 /80-positivas), y un aumento en el tejido conectivo. Al comienzo del colon transverso una inflamación florido (Fig. 3D) con una infiltración masiva de células inmunes se observó. arquitectura de las criptas se distorsionó en las zonas afectadas, probablemente debido a la falta de renovación de las células epiteliales.
Un indicador bien establecido para la inflamación sistémica es el peso del bazo. Spleen peso tendía a ser aumentado en todos los grupos tratados con AOM (Fig. 3E) y fue significativamente mayor en los ratones GPx2-KO -se tratados con AOM que en respectivos ratones WT. Esto se correlaciona con la inflamación del colon. Debido a la distorsión masiva en epitelial morfología, β-catenina y GPx2 co-localización en ratones GPx2-KO -se no podía ser comparado con los otros grupos. No se observaron diferencias evidentes en las estructuras displásicas o los correspondientes niveles de β-catenina entre + Se y ++ Se GPx2-KO y ratones WT (datos no mostrados).
AOM-apoptótica tratamiento aumentó la muerte celular en las células epiteliales de Los ratones KO-GPx2
OMA se sabe que inducen aductos de alquilación de ADN que el pico 8 horas después de su aplicación [28]. La capacidad para eliminar aductos de ADN por la reparación del ADN o la apoptosis dependiente de p53 de las células dañadas es crítico para la prevención del desarrollo del cáncer [29]. Como se informó anteriormente, el número de células apoptóticas en la base cripta es significativamente mayor en GPx2-KO que en los ratones WT y se disminuye dependiendo de la dosis al aumentar el suministro de selenio [20]. Está bien establecido que a corto plazo AOM-tratamiento aumenta la apoptosis [28]. Contamos el número de células apoptóticas (Fig. 4A-D) y se analizaron la localización nuclear de p53 (Fig. S1B y C) 8 h después de la inyección de AOM. Como era de esperar, la tinción nuclear de p53 en la base cripta se incrementó en todos los ratones tratados con AOM (Fig. S1B y C), mientras que fue indetectable en ratones sin AOM-tratamiento (Fig. S1C). AOM no modificó la actividad de GPx (datos no presentados) o expresión GPx2 en ratones WT (Fig. S1A).
(A-D) 8 h después de AOM o inyección de solución salina, se contaron las células epiteliales apoptóticas en 200 criptas por animal utilizando perfiles en H-manchada del colon distal. Las criptas fueron divididos en 4 trimestres. El primero indica la parte superior de la cripta y el cuarto la base cripta. Los datos se muestran como medios + SD, n = 5. La significación se determinó a través de 2 vías ANOVA con post-test de Bonferroni. * P £ 0,05, *** p≤0.001 vs. WT,
#P £ 0,05,
## p≤0.01,
### p≤0.001 como se ha indicado,
xxP≤0.05 ,
xxxP≤0.001 vs. solución salina.
AOM-tratamiento no afectó el número de células apoptóticas en el luminal 1
er trimestre cripta (Fig. 4A), independientemente del genotipo o selenio estado. GPx2-KO ratones tenían significativamente más células apoptóticas AOM inducida en grupos y -se + SE de la 2
segundo trimestre cripta (Fig. 4B) y en el grupo -Se del 3
er trimestre cripta (Fig . 4C) que respectivos ratones WT. En el 4
º trimestre cripta, el número de células apoptóticas inducidas por OMA fue igualmente alta en ambos genotipos (Fig. 4D). El aumento del número de células apoptóticas en la base cripta de los ratones no tratados GPx2-KO se pudo confirmar (Fig. 4D, solución salina). En resumen, los ratones GPx2-KO tenía más células apoptóticas de AOM inducida por que los ratones WT que se encuentran específicamente en el medio de la cripta, el 2
nd y 3
er trimestre cripta. De este modo las células, iniciado por la OMA podrían haber sido eliminados de manera más eficiente en ratones KO-GPx2 que resulta en el desarrollo de un menor número de tumores.
Longitud de la cripta y de la zona proliferativa se amplían en el colon de los ratones KO-GPx2
Para analizar si los cambios en las células apoptóticas podrían afectar aún más la morfología de la cripta, su longitud y la altura de la zona de PCNA positivas proliferativa. Ambos se incrementaron significativamente en los ratones KO-GPx2 con independencia del nivel de selenio o AOM-tratamiento (Fig. 5). La ampliación de la zona de PCNA positivas persistió después de la normalización para la longitud de la cripta (datos no presentados), lo que significa que en ratones GPx2-KO la zona proliferativa cubierto ~ 10% más de la longitud total cripta que en el WT. Desde la OMA sólo induce la apoptosis en las células proliferantes [28], las células apoptóticas AOM inducida deben ser co-localizada con células PCNA positivas proliferativas. La IHC para PCNA de los ratones GPx2-KO reveló que las células que proliferan no sólo residen en la 4
ª y 3
er trimestre cripta como se observa en los ratones WT, sino también en el 2
segundo trimestre cripta (Fig. 5B). Esto correlaciona con células apoptóticas más en el 2
segundo trimestre cripta y -Se + ratones Se GPx2-KO (Fig. 4B).
La longitud de las criptas y la zona de PCNA-positivas en el distal de colon de GPx2-KO y ratones WT alimenta las diferentes dietas de selenio se determinó 8 h después de una sola dosis de AOM o solución salina. (A) La longitud de la zona de PCNA positivas (color gris) y la zona libre de PCNA (color blanco) se midieron en el colon distal. barras enteras representan longitud total cripta. Los valores son medias + SD, n = 5. La significancia se calcula utilizando 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni. * P £ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. WT. Símbolos encima de las barras grises indican diferencias en la zona de PCNA-positivas. Símbolos encima de las barras blancas indican diferencias en la longitud total de la cripta. (B) tinción Representante de PCNA, ratones WT y -Se GPx2-KO tratados con solución salina.
Ratones GPx2-KO se caracterizan por un bajo grado de inflamación intestinal
Los análisis previos han demostrado que un doble knockout de GPx1 y GPx2 resultados en ileocolitis espontánea [11]. Para caracterizar el estado de inflamación intestinal basal en ratones KO no tratados GPx2-, se contaron las células mieloides /80-positivas F4 que invaden la lámina propia del epitelio del colon. diferencias genotípicas fueron de nuevo más alta en los grupos -se, disminuyeron en + Se y desaparecieron en ++ Se grupos (Fig. 6A). Además, los ratones -Se GPx2-KO tenía más células T CD3 positivas en la lámina propia de los ratones WT (datos no mostrados). Mientras que los ratones tratados con AOM GPx2-KO -se desarrollaron una inflamación florido con arquitectura de las criptas perturbada (Fig. 3D), -se ratones GPx2-KO no tratados mostraron una inflamación menos grave y mantienen una morfología cripta intacta (Fig. 6B). En resumen, los ratones GPx2-KO desarrollaron una inflamación de bajo grado basal, que fue más alta en -Se.
F4 /80-positivas las células mieloides se analizaron en ratones GPx2-KO y WT no tratadas después de 7 semanas en la Las dietas de selenio. células /80-positivas F4 en la lámina propia adyacente a una cripta se contaron en el colon (A). Medios + SD, n = 4. Representante F4 /80 tinción de la -Se WT y colon GPx2-KO (B). La significación se determinó a través de 2 vías ANOVA con post-test de Bonferroni. * P £ 0,05, ** p≤0.01 vs. WT,
## p≤0.01 vs. -Se.
Discusión
Iniciación y desarrollo del tumor
ratones GPx2-KO desarrollaron menos tumores en -Se o ++ dietas de Se y menos MDF en la dieta + Se que respectivos ratones WT (Fig. 2A y D). Esto indica que los ratones GPx2-KO son más resistentes al cáncer de AOM inducida. En contraste, los ratones GPx2-KO desarrollaron más tumores en un modelo OMA /DSS inducida por el cáncer de colon [10], lo que correlaciona con una más severa DSS-colitis a la supresión GPx2. Por lo tanto, la actividad anti-cancerígeno de GPx2 en el cáncer de colon inflamación desencadenada es causada principalmente por su papel anti-inflamatorio. La actividad pro-cancerígeno de GPx2 después de AOM-tratamiento solo pone de relieve el impacto crucial de la DSS-colitis como una fuerza de accionamiento de tumor en el modelo /DSS OMA. OMA induce G /A conversiones de base que dan lugar principalmente en la activación de mutaciones en β-catenina. Estas mutaciones son contrarrestados por los mecanismos de defensa como la reparación de bases de ADN o apoptosis. Por lo tanto, la apoptosis juega un papel predominante en la prevención del cáncer inducida por AOM. En 6-8 h de tratamiento post-AOM, las células epiteliales de las criptas se someten a apoptosis de una manera dependiente de p53 [30], [31] (Fig. S1B y C). Si las células progenitoras dañados evadir la apoptosis, pueden producir criptas aberrantes, que pueden convertirse en tumores [32]. Los ratones deficientes en los genes pro-apoptóticos como
p53
[33],
Bak
[34], y
Puma
[35] tienen un mayor número de ACF o tumores y una menor tasa de apoptosis inducida por AOM-.
Hemos demostrado aquí y anteriormente que la deficiencia de GPx2 aumenta la tasa de apoptosis basal en las bases de las criptas del epitelio intestinal, independientemente del nivel de selenio, aunque la mayoría, evidentemente, en el estado -Se (Fig . 4D, solución salina) [20]. Otra característica del epitelio intestinal GPx2-KO es una zona ampliada de proliferación (Fig. 5), que presumiblemente es un intento de contrarrestar la pérdida de las células apoptóticas. 8 h después de la OMA-tratamiento, se contaron más células apoptóticas AOM-inducida en la región central de la cripta (2
ª y 3
er trimestre cripta; Fig. 4B y C) del -Se y + Se GPx2- KO en comparación con los ratones WT. Sólo los ratones GPx2-KO tienen un mayor número de células proliferantes en esta región. Se pretende que los niveles más altos de basal y la apoptosis inducida por AOM en ratones GPx2-KO para eliminar eficazmente las células iniciadas por AOM. En los ratones WT, criptas displásicas se caracterizan por aumento de los niveles GPX2 (Fig. 3A y B) que presumiblemente suprimir la apoptosis. En criptas displásicas GPx2-KO una tasa mejorada de apoptosis podría contrarrestar la progresión maligna. Sobre la base de estos resultados, GPx2, obviamente, es capaz de mejorar el desarrollo del cáncer mediante la supresión de la apoptosis que de otro modo elimina las células dañadas o transformadas.
El tamaño del tumor y Promoción
De forma inesperada, los tumores eran mayores en + Se GPx2- KO que en ratones WT (Fig. 2E). Esto no encaja con la función pro-proliferativa de GPx2 como se postula a partir de un modelo de xenoinjerto con siRNA desmontables mediada por GPx2 [14] y ratones OMA /DSS tratados GPx2-KO [10], lo que habría dado lugar a los tumores más grandes en el WT en lugar de en el GPx2-KO. En el presente estudio, el tamaño del tumor fue igual en el sureste de los ratones y -se + GPx2-KO y disminuyó significativamente con ++ Se (Fig. 2E). Esto correlaciona con la cantidad de células inflamatorias infiltradas (Fig. 6) en los no tratados de colon GPx2-KO, que sólo se incrementó en -Se y + Se, pero no en ++ Se GPx2-KO en comparación con los ratones WT. Los ratones deficientes en tanto GPx1 y GPx2 desarrollar espontáneamente ileocolitis [11] y la colitis inducida por DSS-es más grave en los ratones deficientes en GPx2 [10]. Aquí, nos demuestran que los ratones KO-GPx2 impugnados tienen una colitis bajo grado, que se caracteriza por el aumento de peso del bazo (fig. 3E), la infiltración de células inflamatorias (fig. 6), y el alargamiento cripta (Fig. 5A). Además, los niveles de TNF en plasma se incrementaron en ratones + Se GPx2-KO (observación no publicada).