Extracto
La irradiación y agentes quimioterapéuticos que deterioran el ADN se utilizan comúnmente en los tratamientos contra el cáncer. A raíz de daño en el DNA niveles de proteína FOXM1 a menudo son elevados. En este estudio, hemos tratado de investigar el papel potencial de FOXM1 en la muerte celular programada inducida por el daño de ADN. las células humanas de cáncer después de la supresión FOXM1 se sometieron a la doxorubicina o tratamiento de γ-irradiación. Nuestros hallazgos indican que la regulación a la baja por FOXM1 caída estable o transitoria utilizando RNAi o por tratamiento con inhibidores del proteasoma que se dirigen a células cancerosas humanas FOXM1 fuertemente sensibilizados de origen diferente a la apoptosis daño de ADN inducido. Demostramos que FOXM1 suprime la activación de JNK pro-apoptótica y positivamente regula anti-apoptótica de Bcl-2, lo que sugiere que la activación de JNK y Bcl-2 baja regulación podría mediar la sensibilidad a la apoptosis inducida por el agente que daña el ADN después de la orientación FOXM1. Desde FOXM1 se expresa ampliamente en los cánceres humanos, nuestros datos apoyan aún más el hecho de que es un objetivo válido para la terapia contra el cáncer combinatoria
Visto:. Halasi M, Gartel AL (2012) La supresión de las células cancerosas humanas FOXM1 sensibiliza a La muerte celular inducida por el daño de ADN. PLoS ONE 7 (2): e31761. doi: 10.1371 /journal.pone.0031761
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 14 Septiembre, 2011; Aceptado 18 de enero de 2012; Publicado: 29 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Halasi, Gartel. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) y subvenciones 1RO1CA1294414 1R21CA134615 al Dr. Gartel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
γ-irradiación y que daña el ADN fármacos quimioterapéuticos juegan un papel clave en la terapia contra el cáncer debido a su capacidad para inducir ADN doble filamento se rompe conducen a la muerte de células de cáncer [1]. Puesto que las células cancerosas a menudo se vuelven resistentes a los agentes que dañan el ADN, es importante para determinar los mecanismos de resistencia a las drogas. Varios estudios han informado de que en respuesta a tratamiento con doxorubicina aumenta el nivel de proteína FOXM1 IR, etopósido, daunorrubicina o de una manera dependiente de la dosis [2] - [4]. FOXM1 se considera que es un regulador maestro de ciclo celular [5], [6] mediante el control de la expresión de genes que son cruciales para G1 /S y G2 /M progresión [7]. FOXM1 se expresa abundantemente en una amplia gama de cánceres humanos [8] - [11], lo que sugiere que la orientación FOXM1 podría ser una estrategia terapéutica contra tumores malignos humanos [12], [13]. FOXM1 se ha implicado en la ruta de respuesta daño de ADN, por ejemplo los genes de reparación de ADN, XRCC1 y BRCA2 fueron identificados como dianas transcripcionales directas de FOXM1 [2]. Además, el papel de FOXM1 en respuesta a daño de ADN se ha investigado en el contexto de células de cáncer humano con p53 de tipo salvaje [2], [11], [14], [15]. Sin embargo, se encontró que p53 supresor de tumor que es un regulador negativo de FOXM1 y el daño de ADN upregulated fuertemente el nivel de FOXM1 en ausencia de p53 [3], [4]. En consecuencia, la hipótesis de que los agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN pueden no ser tan eficiente en ausencia de p53, ya que estabilizan el nivel de proteína FOXM1 que conduce a la protección contra la apoptosis inducida por el daño de ADN. Desde FOXM1 es potencialmente un factor de transcripción oncogénico y también está implicada en la invasión y la angiogénesis [16] - [24], el tratamiento de tumores donde p53 está mutado o inactivado con agentes que dañan el ADN podría ser perjudicial para los pacientes. Nuestro grupo informó previamente que la supresión de FOXM1 por tiazol antibióticos [25] - [28] y por los inhibidores del proteasoma [29] se correlaciona con el grado de apoptosis que sugiere que FOXM1 puede actuar como un inhibidor potencial de la apoptosis [25] - [27]. Por otra parte, se ha demostrado recientemente que las células de cáncer de mama con niveles elevados de FOXM1 se hicieron insensibles a Herceptin, paclitaxel [30] y el cisplatino [11]. Por lo tanto, es evidente que FOXM1 podría inhibir la apoptosis inducida por diversos medicamentos contra el cáncer
c-Jun N-terminal quinasas (JNK; también conocidas como proteínas quinasas activadas por estrés, SAPK). Responder a diversos estímulos extracelulares y ambiental tensiones [31]. La vía de señalización de JNK regula muchos procesos celulares, tales como la proliferación, supervivencia, apoptosis y la diferenciación [32]. FOXM1 se ha demostrado para activar transcripcionalmente JNK1 para controlar la progresión del ciclo celular y la invasión [18]. Sin embargo, el resultado de la activación de JNK está determinada por la duración de la JNK de señalización [33], [34]. la activación de JNK corto plazo está vinculada a la proliferación, mientras que la activación sostenida de JNK por lo general conduce a la apoptosis [33], [34]. linfoma de células B 2 (Bcl-2) es un miembro de antiapoptótica de la familia Bcl-2 [35], [36]. Bcl-2 tiene un papel central en la actuación vía apoptótica intrínseca como el guardián de la mitocondria mediante la inhibición de la activación de Bax [35], [37]. sobreexpresión forzada de Bcl-2 en varias líneas celulares cultivadas confiere resistencia a los agentes quimioterapéuticos y la irradiación [35].
En este estudio, hemos examinado si FOXM1 juega un papel en la muerte celular inducida por el daño de ADN en tumores humanos líneas de células con p53 mutante. Demostramos que desmontables estable o transitoria de FOXM1 utilizando RNAi aumenta la sensibilidad de las diferentes células de cáncer humano a agentes que dañan el ADN incluyendo el tratamiento doxorrubicina y γ-irradiación. Por otra parte, se muestra que la combinación de inhibidores del proteasoma que inhiben FOXM1 con agentes que dañan el ADN induce la apoptosis muy robusto. Nuestros hallazgos sugieren que la activación de JNK-2 y Bcl regulación a la baja pueden explicar el aumento de muerte celular después de la supresión de FOXM1 en combinación con el daño de ADN.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, compuestos químicos y tratamientos
MIA PaCa-2 pancreático (ATCC), Hep3B hígado (ATCC), HCT 116 y HCT 116 shp53 de colon [38] las líneas de células de cáncer humano se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen). MDA-MB-231 (ATCC) línea celular de cáncer de mama humano se cultivó en medio RPMI (Invitrogen). Los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals) y 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO) y las células se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2. Las líneas celulares estables (Fig. 1) utilizando la ATCC obtenerse células parentales fueron generados por la transducción de control y las partículas lentivirales FOXM1 shRNA (Sigma) seguido de la selección con puromicina (Sigma). La doxorrubicina (Fisher Scientific), tioestreptona (Sigma), bortezomib (Velcade) (Millenium Pharmaceuticals) y SP600125 inhibidor de JNK (A. G. Scientific) se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (Fisher Scientific). La irradiación se llevó a cabo utilizando un
cesio 137 γ-fuente (JL Pastor modelo 6810; JL Pastor, San Fernando, CA). A una dosis de 8 y 10 Gy
(A) HCT 116 p53 competente y células de cáncer de colon humano deficientes con FOXM1 caída fueron tratados con doxorrubicina (Doxo) como se indica. Inmunotransferencia para FOXM1, p53, exfoliados caspasa-3, PARP y β-actina como control de carga se llevó a cabo 24 horas después del tratamiento. (B) MIA PaCa-2 control de vectores y células de cáncer pancreático desmontables FoxM1 se trataron con las concentraciones indicadas de doxorrubicina. Veinticuatro horas después de los lisados celulares se inmunotransfirieron tratamiento para FOXM1, exfoliados caspasa-3, PARP y β-actina como control de carga. (C) MDA-MB-231 de control de vectores y las células de cáncer de mama knockdown FoxM1 se trataron con doxorubicina como se indica. El análisis por inmunotransferencia se realizó para FOXM1, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga 48 horas después del tratamiento. (D) Hep3B control de vectores y células de cáncer de hígado FoxM1 desmontables se trataron con las concentraciones indicadas de doxorrubicina. Los lisados celulares se inmunotransfirieron para FOXM1, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga 24 horas después del tratamiento. (E) células de cáncer de páncreas MIA PaCa-2 fueron transfectadas con control y FOXM1 siRNA durante 48 horas, y después se trató como se indica. Veinticuatro horas después de inmunotransferencia tratamiento se llevó a cabo con FOXM1, exfoliados anticuerpos beta-actina caspasa-3 y. (F) células de cáncer de mama MDA-MB-231 se transfectaron con el control y FOXM1 siRNA durante 48 horas, después se trató con las concentraciones indicadas de doxorrubicina. Cuarenta y ocho horas después de lisados de células de tratamiento se inmunotransfirieron para FOXM1, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga.
El análisis por inmunotransferencia
se recogieron y se procesaron para células tratadas inmunotransferencia como se describe en la ref. [27] con (se describió el anticuerpo policlonal de conejo contra FOXM1 anteriormente [45]) anticuerpos específicos para FOXM1, p53 (Santa Cruz), se escindió de la caspasa-3 (Señalización celular), PARP-1/2 (Santa Cruz), Total y fosfo-SAPK /JNK (señalización de la célula), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-xL (señalización de la célula) y β-actina (Sigma). La cuantificación se realizó con el software Image J (NIH). los niveles de proteína relativos se normalizaron a los niveles de actina correspondientes.
La transfección de siRNA y
Control (AACAGUCGCGUUUGCGACUGGUU) pequeños ARN de interferencia (siRNA) y siRNA para FOXM1 (GGACCACUUUCCCUACUUUUU) fueron sintetizados por Sigma. 50 nM de ARNsi dúplex se transfectaron en células usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células fueron tratadas como se indica 48 horas después de la transfección.
Extracción de ARN total y cuantitativa en tiempo real (QRT)-PCR
Para extraer células de ARN total se recogieron mediante reactivo TRIzol (Invitrogen). cDNA se sintetizó usando la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). cuantitativa en tiempo real PCR se realizó usando el HT ABI 7900 (Applied Biosystems) de la máquina. Se utilizaron los siguientes cebadores: humano Bcl-2 (sentido, 5'-TGG GAT GCC TTT GTG GAA CT-3 '; antisentido, 5'-GAG ACA GCC AGG AGA AAT CAA AC-3') [46] y la ciclofilina humana (sentido, 5'-ACG GAC AAG AAG GTC CCA ACA G-3 '; antisentido, 5'-GAC CAC CCT ACA TAA ACC CTG G-3'). [25]
La citometría de flujo - yoduro de propidio tinción
Las células fueron tratadas como se indica y se cosecharon por tripsinización. Luego, las células se lavaron en PBS y se fijaron en etanol helado al 95%. Después de la fijación, las células se tiñeron con yoduro de propidio (50 mg /ml) (Invitrogen) en PBS /ARNasa A /Triton X-100 durante 30 min a temperatura ambiente y se analizaron por citometría de flujo.
ensayo de colonias formadoras
1 × 10
5 células se sembraron en placas de 100 mm en los duplicados y se trataron como se indica por 24 hrs. Las colonias se pueden formar durante 10 días, y luego las células se tiñeron con cristal violeta.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con Microsoft Excel utilizando el Student
t
prueba (dos colas).
Los valores P Red de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados y Discusión
Desmontables de FOXM1 sensibiliza a las células humanas de cáncer a agentes que dañan el ADN
en primer lugar, isogénica HCT 116 de p53 células de cáncer de colon humano deficientes y no deficientes con FOXM1 desmontables fueron tratados con diferentes concentraciones de doxorrubicina (Doxo) y la muerte celular se evaluó por inmunotransferencia para los marcadores de apoptosis incluyendo exfoliados caspasa-3 y PARP (Fig. 1A ). Desmontables de FOXM1 mayor sensibilidad de las células de cáncer de colon a la apoptosis mediada por la doxorrubicina independientemente del estado de p53. Las células capaces de p53 con FOXM1 caída sufrió la apoptosis más fuerte en comparación con sus homólogos deficientes en p53. Esta observación podría explicarse por la presencia de la señalización de apoptosis dependiente de p53 en las células p53-competente, pero no en las células deficientes en p53 tras el daño de ADN.
Sobre 50% de los tumores humanos puerto mutante o inactivada p53; en consecuencia, la vía de apoptosis dependiente de p53 no puede ser explotada para la erradicación de las células del cáncer después del tratamiento contra el cáncer [39]. Para investigar el posible papel de FOXM1 en la apoptosis daño de ADN inducido en líneas celulares con p53 mutante, que son generalmente más resistentes a la quimioterapia que líneas celulares de cáncer con p53 de tipo salvaje, MIA PaCa-2 control de vectores y FOXM1 caída de cáncer pancreático humano líneas de células que albergan mutantes de p53 se trataron con concentraciones crecientes de doxorubicina y la inmunotransferencia se realizó para FOXM1, exfoliados caspasa-3 y PARP (Fig. 1B). De acuerdo con estudios anteriores [2] - [4], [11], [14], [40], también se observó que tras el daño de ADN nivel de proteína FOXM1 es elevado. Pero lo más importante, se encontró que la ausencia de células cancerosas sensibilizado FoxM1 a la muerte celular inducida por la doxorrubicina (Fig. 1B) como se detecta por la escisión de la caspasa-3 y PARP. Para comprobar que este fenómeno no es la línea celular específica, MDA-MB-231 de mama humano (p53 mutante) (Fig. 1C) y de hígado humano Hep3B (p53-null) (Fig. 1D) control de vectores y células cancerosas caída FoxM1 eran tratados con diferentes concentraciones de doxorrubicina. Western blot de la caspasa-3 escinde demostró que desmontables de células de mama y cáncer de hígado también sensibilizados FoxM1 a la apoptosis inducida por doxorrubicina.
Además, hemos probado si la caída transitoria de los resultados FoxM1 en un aumento de la apoptosis después de daños en el ADN. Para alcanzar suficiente caída transitoria de FOXM1 utilizamos pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) contra FOXM1. MIA PaCa-2 de páncreas (Fig. 1E) y MDA-MB-231 de mama control (Fig. 1F) y células de cáncer de caída FoxM1 se trataron con diversas concentraciones de doxorubicina. Encontramos que las células con caída FOXM1 transitoria eran más susceptibles a la apoptosis después de daños en el ADN tal como se detectó por inmunotransferencia para la caspasa-3 escindido, más el apoyo a la idea de que FOXM1 podría desempeñar un papel en la apoptosis inducida por el daño de ADN.
con el fin de confirmar este efecto, MIA Paca-2 y MDA-MB-231 de control de vectores y células FoxM1 desmontables fueron sometidos a radiaciones ionizantes. γ-irradiación también indujo apoptosis robusta como se detecta por la escisión de la caspasa-3 en células FOXM1 desmontables (Fig. 2A, B). Además, para evaluar cuantitativamente el grado de muerte celular inducida por desmontables células γ-irradiación MIA PaCa-2 y MDA-MB-231 de control de vectores y FOXM1 fueron irradiados con gamma con diferentes dosis, se recogieron y se tiñeron con yoduro de propidio. El grado de apoptosis se midió por citometría de flujo (Fig. 2C, D). Tanto las células FoxM1 desmontables de páncreas y de mama mostraron aumento significativo en la muerte celular después del tratamiento en comparación con los homólogos de control irradiados. En conjunto, estos datos sugieren que la supresión de FOXM1 en células de cáncer humano podría hacer más susceptibles a la muerte celular inducida por agentes que dañan el ADN.
(A) MIA PaCa-2 de control y las células de cáncer de páncreas desmontables FoxM1 eran γ- irradiado con 8 y 10 Gy. Setenta y dos horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos para FOXM1 y escindidos de caspasa-3. β-actina se utilizó como control de carga. (B) de control de MDA-MB-231 y las células de cáncer de mama knockdown FoxM1 se sometieron a irradiación? Con las dosis indicadas. Cuarenta y ocho horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se realizó para FOXM1, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga. (C-D) Grado de la muerte celular se evaluó por citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio en MIA PaCa-2 de páncreas y el control de mama MDA-MB-231 y las células de cáncer knockdown FoxM1, respectivamente, 48 horas después de γ-irradiación. El gráfico muestra la cuantificación como un porcentaje de células apoptóticas en comparación con las células no tratadas de control de vector, ± SD de un representante triplicado (C) o duplicados (D) experimento.
El tratamiento con inhibidores del proteasoma sensibiliza a las células de cáncer humano a la apoptosis inducida por el daño de ADN
Nuestro grupo ha informado anteriormente de que tiazol antibióticos tioestreptona y siomicina a son potentes inhibidores de FOXM1 [25] - [28] y actúan como inhibidores del proteasoma [29]. Además, hemos demostrado que los inhibidores del proteasoma bien conocidos, tales como bortezomib (Velcade) y MG132 también apuntar FOXM1 [29]. Regulación a la baja de FOXM1 es uno de los medios, por los que los inhibidores del proteasoma pueden inducir la muerte celular in vitro y in vivo [27], [29], [41], pero hay, por supuesto, de varios mecanismos potenciales FoxM1-independiente de inducida por inhibidor del proteasoma muerte de las células que no estamos discutiendo en este estudio. Para probar inhibidores /proteasoma FoxM1 junto con agentes que dañan el ADN, MIA 2 PaCa-línea celular de cáncer de páncreas se trató con la combinación de doxorubicina y bortezomib (Bor) (Fig. 3A) o tioestreptona (Thio) (Fig. 3B), respectivamente . Hemos encontrado que los inhibidores de FOXM1, tioestreptona y bortezomib suprimen la expresión FOXM1 (datos no mostrados) [27], [29] y en combinación con doxorrubicina mostraron escisión más fuerte de la caspasa-3 o PARP en comparación con los tratamientos con fármacos como agentes únicos. Además, MIA PACA-2 células de cáncer de páncreas se irradiaron-gamma junto con el tratamiento de tioestreptona o bortezomib (Fig. 3C). Western blot para la caspasa-3 escinde demostró que MIA Paca-2 células fueron más sensibles a la combinación de γ-irradiación y tioestreptona o bortezomib, respectivamente, que con el tratamiento individual del medicamento.
cáncer de páncreas células (A) MIA PaCa-2 se trataron con las concentraciones indicadas de doxorrubicina y bortezomib (BOR) solos o en combinación. 24 horas después de lisados de células de tratamiento se analizaron mediante inmunotransferencia con caspasa-3 escindida, PARP y anticuerpos beta-actina. (B) MIA PaCa-2 células de cáncer de páncreas se trataron con doxorubicina y tioestreptona (Thio) solo o en combinación con las concentraciones indicadas durante 24 horas. La inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos para la caspasa-3 escindida y β-actina como control de carga. (C) línea celular de cáncer de páncreas MIA PaCa-2 se expuso a irradiación? Y se trata en combinación con tioestreptona o bortezomib durante 24 horas. La inmunotransferencia se llevó a cabo para la caspasa-3 escindida y β-actina como control de carga. MDA-MB-231 células de cáncer de mama (D) fueron tratados con doxorrubicina en combinación con tioestreptona o bortezomib como se indica durante 24 horas. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos para la caspasa-3 escindida y β-actina como control de carga. células de cáncer de hígado (E) Hep3B se trataron con doxorubicina y tioestreptona solo o en combinación como se indica durante 24 horas. La inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos para la caspasa-3 escindida y β-actina como control de carga. (F) línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 se sometió a irradiación? Y se trata en combinación con tioestreptona o bortezomib durante 24 horas. El análisis por inmunotransferencia se realizó con la caspasa-3 escindido y anticuerpos beta-actina. (G-H) 1 × 10
5 MIA PaCa-2 (G) o MDA-MB-231 (H) se cultivaron y se trataron células de cáncer humano como se indica durante 24 horas. 10 días después de las células de tratamiento se tiñeron con violeta cristal y se muestran placas representativas. El gráfico muestra la cuantificación ± desviación estándar de experimentos por duplicado (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001).
a fin de verificar este efecto, 231-MDA-MB células de cáncer de mama y de hígado Hep 3B se trataron con doxorubicina (Fig. 3D, e) o irradiados (Fig. 3F) en combinación con tioestreptona o bortezomib, respectivamente. Análisis de expresión escindido de la caspasa-3 por transferencia de western reveló que la combinación de agentes que dañan el ADN con inhibidores /proteasoma FoxM1 condujo a un aumento de la apoptosis en células de mama y cáncer de hígado en comparación con el tratamiento con fármacos solos. Dado que el tratamiento con agentes que dañan el ADN en combinación con inhibidores de FOXM1 /proteasoma inducidas tales apoptosis marcada, el efecto de su combinación también se examinó en la supervivencia a largo plazo mediante la realización de ensayo clonogénico. MDA-MB-231 células de cáncer humano MIA PaCa-2 y se trataron con γ-irradiación junto con tioestreptona o bortezomib y la capacidad de formación de colonias se evaluó 10 días después (Fig. 3G, H). Hemos encontrado que la combinación de γ-irradiación y los inhibidores del proteasoma FoxM1 /inhibió significativamente la formación de colonias dando lugar a mucho menos número de colonias en comparación con el tratamiento farmacológico individual. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la combinación de agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN utilizados comúnmente e inhibidores /proteasoma FoxM1 podría considerarse como una estrategia de tratamiento a fin de mejorar la respuesta terapéutica en diversos tratamientos de cáncer.
Sensibilidad a ADN daño después de la supresión de FOXM1 se atribuye en parte a la activación de JNK y Bcl-2 downregulation
es un hecho interesante que FOXM1, un regulador conocido del ciclo celular, puede inhibir la apoptosis inducida por el daño de ADN. Con el fin de aclarar el posible mecanismo subyacente giramos a la vía de señalización de JNK, ya que ha sido implicado en la respuesta a diversos estímulos, incluyendo varios estímulos de apoptosis [32]. Se ha informado de que γ-irradiación conduce a la activación de JNK, que media la radiación inducida por apoptosis [33], [42] - [44]. Para determinar el efecto de daño de ADN en la activación de JNK en presencia o ausencia de FOXM1, control de vectores MIA PaCa-2 y FOXM1 células de cáncer pancreático desmontables eran-γ irradiado y immunoblotted para fosfo-SAPK /JNK (Fig. 4A) . Hemos observado que en las células FoxM1-desmontables de la inducción de muerte celular después de γ-irradiación fue acompañado por la fosforilación elevada de JNK, lo que sugiere que FOXM1 puede inhibir la activación de JNK en presencia de daño de ADN. Con el fin de investigar el papel potencial de la activación de JNK en la apoptosis inducida por el daño de ADN en células de FoxM1 desmontables, MIA PaCa-2 de páncreas y MDA-MB-231 células de cáncer FOXM1 mama desmontables se gamma-irradiado en presencia del inhibidor de JNK específica , SP600125 (Fig. 4B-E). El análisis de transferencia Western para la caspasa-3 escindido mostró que la inducción de apoptosis por irradiación fue atenuada por el tratamiento con el inhibidor de JNK, lo que sugiere que la activación de JNK es parcialmente responsable de la muerte celular programada tras el daño de ADN
.
(A) MIA Paca-2 de control y las células de cáncer de páncreas desmontables FoxM1 se irradiaron-gamma con las dosis indicadas. Setenta y dos horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos para fosfo /Total-SAPK /JNK y escindidos de caspasa-3. β-actina se utilizó como control de carga. Se preincubaron (B) células de cáncer de MIA PACA-2 FoxM1 desmontables pancreáticas durante 1 hora con 10 M de inhibidor de JNK, SP600125 y luego se irradiaron-gamma como se indica. Cuarenta y ocho horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se realizó para la caspasa-3 escindida y β-actina como control de carga. (C) Los gráficos se muestran los valores medios ± SEM de cuatro experimentos independientes. Se preincubaron células de cáncer de mama desmontables (D) MDA-MB-231 FoxM1 durante 1 hora con 10 M de inhibidor de JNK, SP600125 y luego se sometieron a irradiación? con las dosis indicadas. Setenta y dos horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se realizó con la caspasa-3 escindido y anticuerpos beta-actina. (E) Los gráficos se muestran los valores medios ± SEM de dos experimentos independientes. (F) de páncreas MIA PaCa-2 de control y las células de cáncer desmontables FoxM1 fueron sometidas a la radiación ionizante con las dosis indicadas. Treinta y seis horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos para Bcl-2 y Bcl-xL. β-actina se utilizó como control de carga. (G) de mama MDA-MB-231 de control y las células cancerosas caída FoxM1 se irradiaron-gamma como se indica. Setenta y dos horas después de la irradiación las células fueron cosechadas y la inmunotransferencia se realizó para Bcl-2. β-actina se utilizó como control de carga. (H) MIA Paca-2 de control y las células de cáncer de páncreas desmontables FoxM1 se cosecharon para la extracción de RNA. RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo con Bcl-2 y ciclofilina cebadores. El gráfico muestra los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes. (I) para extraer el ARN MDA-MB-231 de control y las células de cáncer de mama knockdown FoxM1 se cosecharon. Uso de Bcl-2 y cyclophlin cebadores de QRT-PCR se realizó. El gráfico muestra los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes.
También buscamos mecanismos adicionales que pudieran estar implicados en la sensibilización de los daños de ADN en ausencia de FOXM1. La familia Bcl-2 de proteínas es uno de los principales reguladores de la apoptosis [35] - [37]. Bcl-2 es el más conocido para prevenir la apoptosis mediante la que rige la integridad de la membrana mitocondrial [35] - [37]. Bcl-2 también se encontró para conferir resistencia a los agentes quimioterapéuticos y la irradiación en diversas líneas de células [35]. El análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bcl-2 y Bcl-xL después de γ-irradiación reveló que Bcl-2 se downregulated en células de cáncer pancreático y de mama FoxM1 desmontables (Fig. 4F, G), mientras que el nivel de proteína Bcl-xL se mantuvo sin cambios (Fig. 4F ). Para examinar si Bcl-2 es un objetivo transcripcional de FOXM1, Bcl-2 la expresión de ARNm se evaluó por cuantitativa en tiempo real (QRT) -PCR en control de vectores y células de páncreas y cáncer de mama FOXM1 caída. knockdown FOXM1 condujo a la reducción de 30 a 40% en Bcl-2 la expresión de ARNm (Fig. 4H, I), lo que sugiere que FOXM1 transcriptionally hasta regula Bcl-2. Se necesitan más experimentos para determinar si Bcl-2 es un objetivo directo de FOXM1. Estos datos sugieren que la supresión de FOXM1 también puede sensibilizar a las células de cáncer humano a daños en el ADN a través de Bcl-2 regulación a la baja.
En resumen, hemos demostrado que FOXM1 supresión por caída estable o transitoria utilizando RNAi (Fig. 1, 2 ) o por tratamiento con inhibidores de FOXM1 /proteasoma (Fig. 3) sensibiliza a las células de cáncer humano de origen diferente a la apoptosis inducida por agentes que dañan el ADN incluyendo la doxorrubicina y γ-irradiación. El efecto de la caída FOXM1 endógena en células de cáncer humano en la apoptosis después de la doxorrubicina y el tratamiento γ-irradiación nunca se ha investigado antes. la activación de JNK y Bcl-2 regulación a la baja como resultado de FOXM1 desmontables pueden explicar la resistencia de FoxM1 células competente para la apoptosis después de daños en el ADN. En general, nuestros resultados de acuerdo con los informes anteriores [11], [14] confirman que la orientación FOXM1 en combinación con fármacos que dañan el ADN o con γ-irradiación podría ser un enfoque terapéutico valioso contra diferentes tipos de cáncer humano. Dado que algunos de los inhibidores de FOXM1 /proteasoma como bortezomib ya están en la práctica clínica, los datos presentados aquí sugieren también que la administración de agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN utilizados comúnmente en conjunción con los inhibidores de FOXM1 /proteasoma o con otros inhibidores potenciales FoxM1 debe estar justificada seria consideración con el fin de mejorar los resultados terapéuticos.
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Nogueira Veronique (Universidad de Illinois en Chicago) por su ayuda para llevar a cabo las mediciones de citometría de flujo. También agradecemos al Dr. Jessica J. Gierut (Harvard Medical School) para leer el manuscrito y por sus valiosos comentarios.