Extracto
Algunos virus oncolíticos explotan activan la señalización de Ras con el fin de replicar en las células cancerosas. La activación constitutiva de la vía Ras /MEK es conocido para suprimir la eficacia de la respuesta antiviral de interferón (IFN), que puede contribuir a la oncolisis viral Ras-dependiente. Aquí, hemos identificado 10 líneas celulares de cáncer humano (de 16) con una mayor sensibilidad a los efectos antivirales de IFN-α después del tratamiento con el inhibidor de MEK U0126, lo que sugiere que la vía de Ras /MEK subyace a su menor sensibilidad a la IFN. Para determinar cómo Ras /MEK suprime la respuesta de IFN en estas células, se utilizó micromatrices de ADN para comparar la transcripción inducida por IFN en células SKOV3 IFN-sensibles, las células HT1080 moderadamente resistentes, y las células HT1080 tratados con U0126. Se encontró que 267 genes fueron inducidos por IFN en las células SKOV3, mientras que sólo 98 genes fueron inducidos en las células HT1080 en el mismo punto de tiempo. Además, la expresión de un subconjunto distinto de los genes inducibles de IFN, que incluían RIGI, GBP2, IFIT2, BTN3A3, MAP2, MMP7 y STAT2, fue restaurada o aumenta en las células HT1080 cuando las células fueron co-tratados con U0126 y IFN. El análisis bioinformático de los procesos biológicos representados por estos genes reveló aumento de la representación de genes implicados en la regulación de la respuesta anti-viral, de la apoptosis, la diferenciación celular y el metabolismo. Además, la introducción de Ras constitutivamente activa en células SKOV3 sensible IFN reduce su sensibilidad IFN y la capacidad para activar la transcripción de IFN-inducida. Este trabajo demuestra por primera vez que activa Ras /MEK en células cancerosas humanas induce regulación a la baja de un subconjunto específico de genes de IFN-inducible
Visto:. Cristiano SL, Zu D, M Licursi, Komatsu Y, T Pongnopparat , Codner DA, et al. (2012) La supresión de la transcripción inducida por IFN subyace defectos generados por IFN activado Ras /MEK en células de cáncer humano. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10.1371 /journal.pone.0044267
Editor: Elankumaran Subbiah, Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de mayo de 2012; Aceptado: 31 de julio de 2012; Publicado: 7 Septiembre 2012
Copyright: © Christian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (www.cihr-irsc.gc.ca), los números de subvención MOP74429 y ROP99020. SLC fue apoyado por un premio en prácticas del cazador Instituto de Investigación del Cáncer Beatrice con fondos proporcionados por el Programa de Formación de Investigación del Cáncer, como parte del programa de formación Terry Fox Fundación de Investigación Estratégica en Salud Investigación del Cáncer en CIHR (www.bhcri.ca). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
virus oncolítico replicar específicamente en las células cancerosas, pero no en células normales, mediante la explotación de las diferencias en el entorno intracelular de las células tumorales que promueve el crecimiento celular anormal [1], [2], [3], [4] . se informó originalmente activación constitutiva de la señalización de Ras para ser utilizado por reovirus oncolítico para aumentar su capacidad replicativa [5]. Tras el descubrimiento de la oncolisis del reovirus, otros virus, como el de tipo salvaje del virus del herpes simplex (HSV) [6], vesicular virus de la estomatitis (VSV) [4], virus de la gripe (cepa delNS1) [7], adenovirus (VAI mutante) [ ,,,0],8], poliovirus [9], y el virus de la enfermedad de Newcastle [10] se encontró que de manera similar explotar activado vía de señalización Ras para oncolisis. Ras es una proteína de unión a GTP unido a la membrana que actúa como un interruptor molecular para activar las vías descendentes para regular la proliferación, la diferenciación y la transformación [11]. En la vía de Ras canónica, unido a GTP Ras activa su mediador aguas abajo, la quinasa Raf. Raf activada fosforila y activa las MEK1 /2 quinasas, que fosforilan y activan la señal extracelular regulada quinasa (ERK) 1 y 2. ERK1 /2, entonces se puede activar o inhibir los factores de transcripción para promover la supervivencia y la proliferación [12] celular. La activación de mutaciones de Ras se han encontrado en aproximadamente el 30% de todos los tumores humanos [13]. Por otra parte, en ausencia de la mutación de Ras activa, vía de Ras es a menudo inapropiada activado por la activación de sus componentes de señalización aguas arriba, tales como el receptor de factor de crecimiento epidérmico, HER2 /neu y Src [14].
múltiple celular se han identificado los mecanismos que subyacen a la oncolisis viral dependiente de Ras. La inhibición de la antiviral de doble cadena de ARN-proteína quinasa activada (PKR) por Ras se describió originalmente como un mecanismo importante para la replicación del virus oncolítico en células tumorales [5], [6]. También se ha demostrado que activa Ras promueve la uncoating y liberación de reovirus oncolítico que aumenta la producción de virus de progenie [15]. la activación de Ras también mejora la eficiencia de la traducción independiente de caperuza de poliovirus oncolíticos [9]. Por otra parte, y otro grupo han informado de que la activación de la vía Ras puede evitar la activación efectiva de interferón de tipo I (IFN) respuesta anti-viral en las células humanas cancerosas y las células de fibroblastos de ratón [16], [17], [18], lo que sugiere que el defecto de la respuesta de IFN inducido por Ras activado es uno de los mecanismos comunes de la oncolisis viral.
IFNs se secretan citoquinas que tienen múltiples efectos en el cuerpo incluyendo funciones anti-viral, anti-proliferativas e inmunomoduladoras. Como tal, IFNs se utilizan en el tratamiento de enfermedades virales tales como infección por el virus de la hepatitis C, el tratamiento de cáncer y la esclerosis múltiple. IFN une al receptor de IFN-α (IFNAR) [19] conduce a la activación de dos tirosina quinasas, Janus quinasa 1 (Jak1) y la tirosina quinasa 2 (Tyk2) que están asociados con el IFNAR [20], [21]. Jak1 y Tyk2 entonces fosforilan transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) 1 y STAT2, que luego se asocian con la proteína de unión a ADN IFN factor regulador 9 (irf9), para formar un factor de transcripción heterotrimérico denominado IFN-estimulado factor de gen 3 (ISGF3) [22], [23]. La unión de ISGF3 al elemento de respuesta IFN-estimulado (ISRE) en los promotores de genes de IFN-inducibles induce la expresión de cientos de genes conocidos como genes estimulados con IFN (ISG), muchos con anti-viral, anti-proliferativa y inmunomodulador funciones [24]. Sin embargo, la eficacia de IFN puede ser limitado por anti-IFN proteínas codificadas por los genomas virales o por supresores celulares endógenos que regulan IFN señalización [21].
Anteriormente, hemos demostrado que un virus sensible IFN, VSV, era capaz de replicarse en las células NIH3T3 con activado Ras /MEK, mientras que el IFN prevenir la infección de las células control NIH3T3 [16]. Noser et. Alabama. [25] también informó de que la inhibición de Ras /MEK en líneas celulares de cáncer humano restaurado respuestas antivirales inducidos por IFN. Estos estudios demuestran claramente que la activación de Ras /MEK subyace deterioro IFN en células de cáncer. En un estudio de seguimiento, se encontró que se activa Ras /MEK suprime la transcripción de STAT2, que es uno de los de señalización de IFN componentes esenciales [17]. protección mediada por IFN contra la infección por virus fue restaurada sólo parcialmente en las células NIH3T3 transformadas RasV12 con sobreexpresión de STAT2. Sin embargo, cuando la vía Ras /MEK fue inhibida por el inhibidor de MEK U0126 en células RasV12, IFN fue tan eficaz en la inducción de una respuesta antiviral como en las células de control de vector. Por lo tanto, es poco probable que la regulación a la baja de la expresión de STAT2 es el único mecanismo implicado en la supresión mediada por IFN Ras /MEK. Aquí, para identificar aún más el mecanismo de la inhibición mediada por Ras de la respuesta de IFN, se analizó la participación de la vía Ras /MEK en la regulación de la transcripción inducida por IFN en líneas celulares de cáncer humano.
Resultados
Sensibilidad del cáncer humano líneas celulares a la antiviral Respuesta
en primer lugar, se seleccionaron 16 líneas celulares de cáncer derivan de diferentes tipos de tumores (3 mama, cuello uterino 1, 4 puntos, 1 fibrosarcoma, 2 melanoma inducida por IFN , 3 de ovario y de próstata 2 líneas de células) y se midió su capacidad de respuesta al efecto antiviral inducida por IFN. Las células fueron tratadas con IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 y 5000 U /ml) durante 16 horas y luego desafiadas con VSV a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 por 24 horas. El nivel general de oncolisis se evaluó mediante tinción con cristal violeta. Sobre la base de la dosis eficaz (efecto citopático (CPE) 50) de IFN, que se define como la concentración efectiva de IFN que provoca un 50% de protección contra la infección por VSV, las líneas celulares se dividieron en los tres grupos siguientes: IFN sensible: líneas celulares con CPE50 menos de 10 U /ml, IFN moderadamente resistente: líneas celulares con CPE50 entre 10 a 5000 U /ml, y IFN completamente resistente: líneas celulares con CPE50 por encima de la concentración máxima de IFN probamos (5000 U /ml) (Fig . 1). Como se muestra en la Tabla 1, tres líneas celulares (HeLa, SKBR3 y SKOV3) fueron sensibles a IFN, mientras que 9 líneas celulares (A375, DLD-1, HT29, HTB129, HT1080, MCF-7, MDAH, MDA-MB468 y SW48) mostraron resistencia moderada al tratamiento con IFN. Por el contrario, 4 líneas de células (DU145, HCT116, LNCaP y PA-1) no respondieron a IFN dentro del intervalo de concentraciones de IFN examinado.
IFN sensible (A), moderadamente resistente (B) y completamente resistente líneas celulares (C) se identificaron por las células pretratamiento con IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 y 5000 U /ml) durante 16 horas y luego desafiadas con VSV a una MOI de 1 durante 24 horas. La viabilidad celular se determinó usando tinción con cristal violeta y se expresó como porcentaje medio en comparación con los pocillos de control no infectados (n = 3 pocillos). Se muestra un experimento representativo.
Restauración de IFN Sensitivity de MEK inhibición de IFN Moderadamente o completamente líneas de células cancerosas resistentes
Se determinó a continuación si la activación de Ras /vía MEK reduce la respuesta antiviral inducida por IFN en el IFN moderadamente o completamente líneas celulares de cáncer resistentes. sensibilidades de IFN de las líneas celulares se examinaron en presencia de un inhibidor de MEK U0126. Las células fueron tratadas con IFN (0, 12.5, 25, 50, 200, 500 y 2000 U /ml) y U0126 (0, 2,5, 5, 10 y 20 mM) durante 16 horas y luego desafiadas con VSV a una MOI de 1 por 24 horas. La infección se evaluó cualitativamente por Western blot de la proteína VSV-G viral. La eficacia de U0126 sobre la inhibición de MEK se verificó mediante análisis de la fosforilación de ERK, el objetivo principal de MEK [13]. inhibición MEK aumento de la sensibilidad de 10 líneas celulares de cáncer de IFN (A375, DLD-1, DU145, HCT116, HT1080, HT29, HTB129, MDA468, MDAH y-1 PA) (líneas U0126 célula sensible), pero no tuvo efecto en 3 líneas celulares de cáncer (LnCap, MCF7 y SW48) (líneas celulares U0126 que no responden) (Fig. 2 y la Fig. S1). Por ejemplo, VSV replicado en células HT1080 en presencia de IFN (50 y 200 U /ml), mientras que la replicación del VSV se inhibió en las células tratadas con la misma cantidad de IFN en combinación con el tratamiento con U0126 (Fig. 2A). células HT1080 también habían reducido ligeramente la infección por VEV en presencia de 20 mu M U0126 solo. Del mismo modo, la respuesta antiviral inducida por IFN fue restaurada en HT29, células HCT116 y MDAH cuando la vía Ras /MEK es inhibida por U0126. En contraste, no se observó la restauración de la respuesta antiviral inducida por IFN en cualquier combinación de concentraciones de U0126 y IFN en las células LNCaP y MCF7 que sugieren que su resistencia IFN se regula por factores celulares distintos de la vía Ras /MEK activada. Se realizó el mismo análisis para examinar la promoción de la respuesta antiviral inducida por IFN en las otras líneas celulares (A375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, PA-1 y SW48) (Fig. S1).
Las líneas celulares (a) se infectaron con VSV (MOI = 1) durante 24 horas después del tratamiento con IFN (0-5000 u /ml) con o sin U0126 (0-20 mM) durante 16 horas. se utilizó el análisis de transferencia Western para detectar la proteína viral (VSV-G) los niveles, el nivel de ERK fosforilada (p-ERK) con GAPDH utilizado como control de carga. Las muestras se analizaron en dos membranas simultáneamente utilizando condiciones idénticas para la incubación y la detección. Se muestra un experimento representativo de 3. (B) la producción de progenie viral se determinó después de la infección con VSV (MOI = 1) durante 24 horas después del tratamiento con IFN (50 o 2000 U /ml) y con U0126 (0, 5, 10 o 20 mM) durante 16 horas.
La restauración de la respuesta antiviral de la inhibición de MEK en las cuatro líneas celulares U0126 que responden se confirmó mediante el ensayo de la progenie del virus (Fig. 2B). células HT1080, infectadas con VSV, mostraron una reducción significativa en la producción de virus progenie con el tratamiento combinado con IFN (50 U /ml) y todo concentración de U0126 (5, 10 y 20 mM). Por otra parte, U0126 (20 M) por sí solo mostró una modesta pero estadísticamente significativa reducción en la progenie viral. En las otras líneas celulares (HT29, HCT116 y MDAH), el tratamiento con IFN y U0126 combinada mostró una reducción sustancial y estadísticamente significativa en la producción de progenie viral en comparación con IFN indicando solamente o U0126 único tratamiento mayor capacidad de respuesta a IFN a la inhibición de MEK.
Estos resultados indican que la activación de la vía Ras /MEK suprime actividades antivirales inducidos por IFN en algunas líneas celulares de cáncer. No se encontró correlación entre la capacidad de respuesta ya sea IFN o la capacidad de respuesta U0126, y tipos de células cancerosas.
Efecto de Ras /MEK inhibición de IFN-inducida por la transcripción
Para estudiar cómo se activa Ras /MEK suprime el IFN respuesta en células de cáncer humano, se realizó un análisis global de la expresión génica y genes identificados con estadísticamente aumento de la expresión en comparación con el control de tiempo con ajuste sin tratar (ver la información de apoyo [archivo S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] para listas completas de los genes expresados diferencialmente). En primer lugar, se comparó la expresión de IFN inducible genes en las células sensibles SKOV3 IFN y las células HT1080 moderadamente resistentes (Fig. 3A). Tras la estimulación IFN durante 6 horas, 267 genes se upregulated en SKOV3 células mientras que sólo 98 genes fueron inducidos en las células HT1080. Setenta genes fueron inducidos comúnmente tanto en células HT1080 SKOV3 y mientras 197 IFN inducible genes se upregulated sólo en las células SKOV3 y 28 IFN inducible genes sólo en las células HT1080. Estos resultados demuestran que la transcripción inducida por IFN se suprime en IFN células HT1080 moderadamente resistentes en comparación con las células SKOV3 sensible IFN.
diagramas (A) de Venn de análisis de microarrays de ADN que muestran supresión mundial de genes regulados por IFN en células HT1080 compararon a SKOV3 células. Demuestra el número de genes regulados por incremento significativamente (FDR & lt; 0,01) a las 6 horas después del tratamiento con IFN en las líneas celulares SKOV3 vs. HT1080. (B) diagramas de Venn que muestra el número de genes significativamente upregulated (FDR & lt; 0,01) en células HT1080 después del tratamiento con IFN, U0126 o ambos IFN y U0126 durante 6 horas o 12 horas como se indica. (C) diagramas de Venn comparando los genes regulados positivamente por los tratamientos "protectores" en cada tipo de célula (IFN de células SKOV3 y IFN /U0126 de las células HT1080).
Se determinó entonces si la inhibición de Ras /MEK podría cambiar la respuesta transcripcional de las células HT1080 a IFN. IFN único tratamiento activa la transcripción de 98 genes en 6 horas y 167 genes a las 12 horas, mientras U0126 único tratamiento indujo la expresión de 636 genes en 6 horas y 97 genes a las 12 horas (Fig. 3B). El tratamiento combinado de IFN y U0126 indujo la transcripción de 652 genes a las 6 horas y 354 genes a las 12 horas. Estos resultados demuestran que se activa MEK suprime la transcripción inducida por IFN en células HT1080 IFN resistentes moderadamente. Curiosamente, encontramos 111 genes a las 6 horas (Tabla S1) y 135 genes a las 12 horas (Tabla S2) fueron inducidos de manera significativa por el tratamiento combinado con IFN y U0126 mientras que cualquiera de los tratamientos por sí solo no indujo la expresión, lo que demuestra la verdadera regulación sinérgica de la expresión génica por la supresión de IFN y Ras /MEK. Estos genes incluyen mediadores de la función anti-virales (por ejemplo. [27], [28], [29], RSAD2 (viperina) [30], GBP2 [31] y MAP2 [32], [33 Apobec3 [26], IFIT2 ], [34]), activadores de la transducción de señales anti-viral, (por ejemplo. RIGI [35]), los reguladores de procesamiento y presentación de antígenos (por ejemplo. IFI30 (GILT) [36], BTN3A3 [37] y PSME1 [38] ), y reguladores de la génesis tumoral (por ejemplo. MMP7 [39]). Desde VSV replica más de 30 veces menos eficazmente en células HT1080 tratados con IFN y U0126 en comparación con los tratados con IFN solamente o U0126 solamente (Fig. 2B), creemos que algunos de los genes regulados positivamente por el tratamiento combinado en las células HT1080 (111 genes en 6 horas 135 genes en 12 horas) tienen una función anti-viral significativa. Por último, comparamos los genes inducidos en HT1080 por el tratamiento combinado de IFN y U0126 a los inducidos en las células SKOV3 por único tratamiento IFN para reducir aún más el que los genes pueden ser los genes esenciales necesarios para una respuesta IFN anti-viral de protección (Fig. 3C ). Se encontró que 36 genes fueron inducidos comúnmente a las 6 horas, y 26 genes en 12 horas, en los dos grupos experimentales (Tabla S3).
Gene ontología se realizó (GO) el análisis para determinar el proceso biológico asociado con los genes identificados como cambiado significativamente en células HT1080 tratados con IFN solamente, U0126 solamente, y tanto IFN y U0126 (Tabla 2 y Fig. 4). El tratamiento con U0126 única o ambos IFN y U0126 durante 6 horas agrupados indican que estos tratamientos cambiaron la expresión de genes con funciones similares (IR exceso de representación). Del mismo modo, los tratamientos de 12 horas con U0126 solo o el tratamiento combinado dio lugar a los más similares GO grupos de más de representación. grupos de tratamiento IFN-sólo (6 y 12 horas) agrupados juntos probablemente debido a que un número relativamente pequeño de categorías GO cambió en comparación con los otros grupos de tratamiento. En general, los genes cayeron en 312 GO categorías que se asociaron con 3 a repasar representación conglomerados donde el grupo 3 podría ser dividida en 11 sub-grupos. Los grupos 1, 3A, 3B, 3D y 3I mostraron una mayor GO sobrerrepresentación en respuesta a U0126 combinado y tratamiento con IFN en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo. Estos grupos incluyen GO categorías asociadas con NF-kB de señalización, la respuesta anti-viral, la respuesta inmune, la regulación de la apoptosis, la señalización de quimiocinas, el desarrollo celular y el metabolismo. En contraste, los grupos 3C, 3E, 3F, 3H y 3K habían reducido categorías GO-sobre-representación en el tratamiento combinado, indicando que la adición de la estimulación IFN resultó en la pérdida de la regulación génica de los genes que pertenecen a GO categorías asociadas con la motilidad celular, la reparación del ADN y la división celular. Por lo tanto, la inhibición de MEK cambia los tipos de genes que pueden ser inducidos por el tratamiento con IFN además de aumentar el número total de genes inducidos.
Los genes con niveles de expresión upregulated o downregulated significativamente en comparación con el control se analizaron para exceso de representación de categoría GO comparación con la observada en el genoma. Excesivamente representados GO categorías (FDR & lt; 0,05) se muestran con el más alto FDR = 0 muestran en rojo y categorías con FDR ≥0.05 o ausente muestran en azul
En conjunto, estos análisis indican que. la vía Ras /MEK suprime la expresión de ISGs implicados en la respuesta antiviral a múltiples niveles incluyendo la detección de los patrones de patógenos asociados, la activación de la cascada de señalización anti-viral y genes efectores anti-virales directos.
Validación de Restauración de IFN inducida por la expresión génica por MEK inhibición
Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) se llevó a cabo para confirmar los cambios en la expresión génica observados en el análisis de microarrays utilizando células HT1080 tratados con IFN y /o U0126 (Fig. 5 ). Se seleccionaron ocho genes (IFIT2, GBP2, MAP2, RIGI, STAT2, BTN3A3, MMP7 y ID2) en base a sus funciones biológicas y los cambios de expresión génica en respuesta a IFN y tratamiento /o U0126. IFIT2, GBP2, MAP2 y MMP7 se upregulated sólo en las células HT1080 tratados tanto con U0126 y IFN a las 6 horas, mientras que la inducción de genes se observó en sólo IFN y U0126 únicos grupos en el punto de tiempo más tarde (12 horas). BTN3A3 fue inducida por el tratamiento combinado en ambos puntos de tiempo, pero no por solamente U0126 o IFN único tratamiento. Además, la inhibición de Ras /MEK U0126 por era capaz de promover la expresión de genes de RIGI y STAT2 a las 12 horas en ausencia de IFN, como se describe anteriormente [17], [40]. Se encontró que el ID2, que no es un gen de IFN-inducible, se upregulated solamente por tratamiento U0126 y el tratamiento combinado, pero no por el tratamiento con IFN. La mayoría de los cambios en la expresión génica fueron confirmados por RT-qPCR, pero debido a la diferencia en la sensibilidad y el poder estadístico de las dos técnicas diferentes, no se identificaron todos los cambios de genes como estadísticamente significativo en ambos análisis. Por ejemplo, se encontró RIGI ser inducida en las células HT1080 por único tratamiento IFN mediante RT-qPCR, pero no en el análisis de microarrays.
El nivel de expresión génica en células HT1080 no se trata, tratados con IFN (50 se determinó u /ml), con U0126 (20μM) o con IFN y U0126 durante 6 horas o 12 horas por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión relativa se calculó en comparación con el control sin tratar 6 horas después de la normalización contra los niveles de expresión GAPDH. (N = 3, * P & lt; 0,01 en comparación con el control de tiempo de concordancia, ** P & lt; 0,05 en comparación con todos los otros grupos).
Efectos de la activación de Ras sobre la transcripción de IFN-inducida en IFN SKOV3 Sensitive las células
Para examinar aún más la represión de la transcripción de IFN por Ras activados, se generan células SKOV3 (IFN-sensible) que expresan el mutante Ras constitutivamente activa (SKOV3-RasV12; clones 10 y 15). Ras /MEK de activación en las células mutantes se confirmó mediante análisis de transferencia Western usando anti-fosforilados ERK, y los anticuerpos Ras (Fig. 6A). las células de control de vector SKOV3 y SKOV3-RasV12 fueron tratados con IFN (0, 12.5, 25, 50 y 100 U /ml) durante 16 horas y luego desafiadas con VSV a una MOI de 1. El análisis de transferencia Western de la proteína VSV-G en 24 horas después de la infección demostró que VSV claramente replica de manera más eficiente en transformados por ras mutantes SKOV3 (clon 10 y 15) que en las células SKOV3 de control en presencia de IFN (Fig. 6B). También medimos los niveles virales de la progenie de 48 horas después de la infección para cuantificar el grado de infección viral (Fig. 6C). De acuerdo con el análisis de transferencia Western, se encontró que la producción de virus progenie fue significativamente mayor en el mutante SKOV3 transformado-Ras que en el control SKOV3 células tratadas con IFN (50 y 100 U /ml). A fin de determinar si la disminución en la sensibilidad de IFN por la introducción de Ras activa es inducida por la regulación a la baja de la transcripción inducida por IFN, se examinaron los cambios en la transcripción inducida por IFN de 5 genes (GBP2, IFIT2, MAP2, STAT2 y RIGI), que hemos identificado anteriormente a estar regulados a la baja por Ras /MEK en células HT1080 (figura 5). células SKOV3 transformadas Ras La inducción de GBP2, IFIT2, MAP2 y RIGI se inhibió en las compararon con las células control SKOV3 a las 12 horas después de la estimulación IFN mientras que la inducción STAT2 no se vio afectada significativamente (Fig. 7). Estos resultados demuestran que la señalización de Ras activado suprime la transcripción de ciertos genes de IFN-inducible que conducen a la disminución de la sensibilidad celular a IFN.
(A) análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-Ras, fosforilados de anticuerpos ERK o GAPDH para determinar la activación de Ras /MEK en control SKOV3 y Ras transformó SKOV3 (clon 10 y 15). Control de SKOV3 y células SKOV3 Ras transformadas fueron tratados con IFN (0, 12.5, 25, 50 y 100 U /ml), y luego desafiados con desafiadas con VSV (MOI de 1). La infección se evaluó por (B) Análisis de transferencia western de la proteína VSV-G y GAPDH momento de la infección de 24 horas y mediante el ensayo (C) la progenie del virus a las 48 horas después de la infección.
La expresión de GBP2, IFIT2 , las células SKOV3 MAP2, RIGI y STAT2 en control SKOV3 y Ras transformadas (clon 15) a las 12 horas después de la estimulación con IFN (0, 12.5, 50 y 100 U /ml) se determinó mediante RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión relativa se calculó en comparación con las células de control no tratados después de la normalización SKOV3 contra los niveles de expresión GAPDH. (N = 3, * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 en comparación con el control de la concentración de IFN-emparejado).
Discusión
Como se ha demostrado anteriormente, el deterioro de la respuesta de IFN en las células cancerosas se considera uno de los mecanismos comunes para oncolisis viral [3], [10]. La activación de la vía Ras /MEK se ha informado a suprimir las respuestas antivirales inducidos por IFN [4], [16], [17], [25], [40]. En este estudio, primero inspeccionamos un panel de líneas celulares de cáncer humano y se determinó 1) su capacidad de respuesta a IFN en la producción de un estado antiviral y 2) la capacidad del inhibidor de MEK, U0126, para restaurar la sensibilidad de IFN. Se encontró que 13 de las 16 líneas celulares ensayadas eran moderadamente o completamente resistentes a la respuesta antiviral del IFN. En 10 de estos 13 líneas celulares, la sensibilidad a IFN fue restaurada tras el tratamiento con el inhibidor de MEK. Estos resultados sugieren que la vía Ras /MEK activada subyace resistencia de las células del cáncer a los efectos antivirales inducidos por IFN. Para investigar más a fondo el mecanismo subyacente para el efecto supresor de la vía Ras /MEK en respuesta a IFN, se realizó un análisis global de la expresión génica para determinar las actividades de la transcripción de IFN-inducida en IFN SKOV3 sensible y IFN células HT1080 moderadamente resistentes. Se encontró que hubo una reducción sustancial en el número de genes inducidos por IFN en las células HT1080 en comparación con la de las células SKOV3 (276 genes en SKOV3, 98 genes en las células HT1080; Fig. 3A). Además, la inhibición de MEK restauró la capacidad de IFN para activar su transcripción en células HT1080, como se encontró que 111 genes adicionales a las 6 horas y 135 genes en 12 horas se expresaron en células HT1080 tratados tanto con IFN y U0126 (Fig. 3B), lo que indica que activado Ras /MEK suprime la transcripción de un grupo de genes inducidos por el IFN. Por último, hemos sido capaces de demostrar que la expresión de Ras constitutivamente activa en las células SKOV3 sensible IFN reducción de su capacidad para activar la transcripción inducida por IFN y establecer la respuesta antiviral inducida por IFN. Estos resultados demuestran claramente que activa la vía Ras /MEK suprime la transcripción de los genes inducibles de IFN determinado para establecer deterioro IFN en células de cáncer humano.
puede plantear la hipótesis de varios mecanismos subyacentes posibles para la supresión generalizada de la transcripción de IFN-inducida por la vía Ras /MEK. 1) Ras /MEK regula la actividad de un co-transcripcional regulador para ISGF3, tales como los co-reguladores positivos IRF1 [41], [42], y Sp3 [43] o los negativos co-reguladores de NF-kappa B [44] , y la secuencia de la proteína IFN-consenso [45] vinculante. En este caso, los genes de IFN-inducible que requieren la altura o baja regulación de un co-regulador para su expresión sería suprimida en las células con Ras activada /MEK. 2) Ras /MEK suprime los niveles basales de expresión de los componentes clave de la vía de señalización de IFN. La insuficiencia de los niveles de expresión de estos componentes da lugar a la alteración global de la respuesta antiviral inducida por IFN similar a la regulación a la baja de la expresión de STAT2 que se observa en las células NIH3T3 que sobreexpresan Ras constitutivamente activa [17]. 3) La expresión de genes de IFN-inducible puede ser suprimida por mecanismos epigenéticos. Por ejemplo, la interacción de STAT2 con BRG1 [46], un componente clave del complejo ATP-dependiente de remodelación de la cromatina SWI1-SNF2 [46], puede alterar la expresión de un subconjunto de los genes regulados por IFN. Si bien la regulación de BRG1 por Ras no se ha demostrado, regulación a la baja de la proteína relacionada, Brm1, ha informado [47]. Del mismo modo, la regulación de la metilación del ADN [48] o la modificación de las histonas [49] Ras mediada, si se dirigen a los genes de IFN-regulada, podría suprimir su expresión a nivel mundial. 4) Por último, la vía Ras /MEK puede activar o regular por incremento los reguladores negativos de la vía de IFN, como SOCS [50] o [51] PIAS. Estos reguladores negativos pueden suprimir la transcripción de los genes inducibles de IFN identificados ser downregulated por Ras /MEK en este estudio
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Análisis de los procesos biológicos representados en los conjuntos de genes reveló que el número de procesos biológicos afectados por IFN y U0126 fue mayor que cualquiera de U0126 o IFN solo. Además, el número de diferentes categorías GO representados fue mayor a 6 horas frente a 12 horas en ya sea solo U0126 o el tratamiento combinado que sugiere que la estimulación a largo plazo limita el número de procesos biológicos que se pueden llevar a cabo por los genes que se expresan . Como era de esperar, IFN fue capaz de regular los genes conocidos para la respuesta a virus y la señalización de NF-kappa B, sin embargo, el tratamiento combinado aumentó la representación de más categorías GO anti-virales, así como genes importantes para la regulación de citoquinas. Además, en comparación con el tratamiento solo U0126, U0126 combinado y tratamiento IFN disminuyó la representación de los genes responsables de la replicación y reparación del ADN, regulación del ciclo celular y la motilidad celular. En general, el tratamiento combinado aumentó la respuesta anti-viral /inflamatoria expresión génica en concierto con la representación reducida de genes que promueven la división celular éxito.
Curiosamente, un subconjunto de los genes se indujo comúnmente por los dos tratamientos de protección, el tratamiento con IFN en SKOV3 células y el tratamiento con IFN y U0126 combinada en las células HT1080 (Tabla S3). Estos genes incluyen el gen C14orf159 que ha sido recientemente demostrado tener la función anti-viral ancho, y el MOV10 y genes IFI44 demostrado tener actividad anti-viral más restringido [52]. Del mismo modo, los miembros de la anti-retroviral APOBEC3 [53] y el asiento [53] familias de genes fueron inducidos por ambos tratamientos de protección. IFIT2 Recientemente se ha demostrado que tiene la función anti-viral [27], [28], [29] y la función anti-proliferativa [54]. Además, IFIT2 interactúa con los microtúbulos [27] lo que sugiere que IFIT2 puede asociarse con MAP2 IFN-upregulated para interferir con el ensamblaje del virión y /o transporte mediante la regulación de la dinámica de microtúbulos [32], [33], [34]. Además también hemos identificado los genes antivirales críticos, como la proteína de unión a guanilato (GBP) -2 [31] y RIGI [35], que se inducen de forma sinérgica en las células HT1080 tratados con U0126 e IFN. Por lo tanto, estos datos proporcionan evidencia adicional de la importancia de estos genes para el establecimiento de una respuesta anti-viral éxito. Los estudios futuros se buscan identificar las funciones precisas de estos genes, ya sea solos o en combinación, por mediación de la respuesta antiviral del IFN de protección y regulación de la oncolisis viral.
No hubo correlación entre el origen del tejido del cáncer humano células utilizadas en este estudio y la sensibilidad a IFN o la capacidad de U0126 para restaurar la capacidad de respuesta IFN.