Extracto
Desde hace tiempo se presume, aunque con sorprendentemente poca evidencia, una competición entre Core 1 Gal-transferasa (C1GalT), Core 3 GlcNAc transferasa (C3GnT) y sialil-transferasa (ST6GalNAc-T) para la elongación de los glicanos de tipo mucina O-ligados iniciados con GalNAcα-Ser /Thr. Este estudio probó esta presunción supresión selectiva de una de estas glicosiltransferasas y después se analizó la expresión de los productos enzimáticos de los otros tres glicosiltransferasas. Se encontró que la supresión de siRNA C1GalT reduce notablemente la expresión de Galβ1,3GalNAcα- (Core 1) y, mientras tanto aumenta las expresiones de sialil-GalNAcα- (sialil-Tn), GalNAcα- (Tn) y GlcNAcβ1,3GalNAcα- ( Core 3) -asociado glicanos en células HT29 de cáncer de colon SW620 y humanos. Esto apoya una modificación competitiva de la GalNAcα-Ser /Thr entre C1GalT, C3GnT y ST6GalNAc-T en la biosíntesis de O-glicanos. Como Tn, TF y sialil-Tn son antígenos oncofetales y están sobreexpresados en la mayoría de los cánceres humanos, esta información es útil para el desarrollo de estrategias terapéuticas orientadas glicosiltransferasas para el tratamiento del cáncer
Visto:. Barrow H, Tam B, CA Duckworth, Rodas JM, Yu LG (2013) Supresión de Core 1 Gal-transferasa se asocia con reducción de la TF y Aumentar la recíproca de Tn, sialil-Tn y Core 3 glicanos en células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 8 (3): e59792. doi: 10.1371 /journal.pone.0059792
Editor: Roger Chammas, Universidad de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: 19 Octubre, 2012; Aceptado: February 18, 2013; Publicado: 25 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Barrow et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención (CR777) del Fondo de Investigación del cáncer del Noroeste y un doctorado de la Universidad de beca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.-Lu Yu Gang, es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Los autores confirman que esta membresía consejo editorial no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La biosíntesis de
O
-vinculada glicanos de tipo mucina es un proceso multi-escalonado, secuencial, después de la traducción catalizada por las expresiones y actividades de una variedad de glicosiltransferasas. El proceso de biosíntesis se inicia con la adición de
N
-acetil-galactosamina (GalNAc) a la serina (Ser) o treonina (Thr) los residuos de las proteínas completamente plegadas /ensambladas para formar la inicial O-ligado GalNAcα- Ser /estructura Thr (antígeno Tn) catalizada por uno o dos de una gran familia de hasta 20 distinta UDP-N-acetil-α-D-galactosamina polipéptido GalNAc-transferasas (ppGalNAc-Ts) [1], [2]. Estas isoenzimas ppGalNAc-T tienen diferentes, pero en parte se solapan, las especificidades de péptidos a proteínas en diferentes sitios de Ser y Thr y se expresan diferencialmente en células y tejidos durante las condiciones de desarrollo, la diferenciación y de enfermedad tales como cáncer [3], [4], [5 ]. Este primer paso de la biosíntesis de los glicanos de tipo mucina O-ligados se cree que comenzará en un compartimiento entre ER-Golgi [6], [7], [8] y terminar en el aparato de Golgi [9], [10].
Después de la formación de GalNAcα-ser /Thr, el residuo GalNAc puede ser modificado con un residuo de Gal catalizada por el núcleo 1 Gal-transferasa (C1GalT) [11] para la formación de la estructura del núcleo 1, Galβ1,3GalNAcα - [Thomsen-Friedenreich (TF) antígeno]. El residuo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr también se puede modificar con un residuo de GlcNAc catalizada por la GlcNAc-transferasa Core 3 (C3GnT) para la formación de la estructura del núcleo 3 de GlcNAcβ1,3GalNAcα-. El residuo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr también se puede modificar con un resto de ácido siálico de una sialil-transferasa (ST6GalNAc-T) para formar ácido antígeno-β1,6GalNAcα- (sialil-Tn) siálico [12], [13] . ST6GalNAc-I se cree que es el predominante sialil-transferasa para la formación de sialil-Tn [13]. La formación de sialil-Tn termina la cadena de azúcar mientras que el TF y Core 3 estructuras puede actuar más adelante por otras glicosiltransferasas en forma escalonada para producir hasta 8 centrales complejo estructuras de glicosilación [14]. El núcleo 1 a 3 estructuras de glicano también puede ser modificado por acetilación, fucosilación, sialilación o sulfatación.
Desde hace tiempo se especuló que la competición C1GalT, C3GnT y ST6GalNAc-T para modificar el residuo GalNAc del recién sintetizado GalNAcα-Ser /Thr para la formación de TF, Core 3 o sialy-Tn estructuras en las células vivas [15], [16], [17]. Sin embargo, la evidencia directa que apoya esta modificación competitiva de GalNA-modificación es sorprendentemente ausente. La mutación o inactivación de COSMC, una chaperona molecular ER-localizada que se requiere para la actividad enzimática de C1GalT [18], se ha demostrado que se asocia con el síndrome de Tn, una enfermedad autoinmune rara en la que las subpoblaciones de las células de la sangre llevan la forma incompleta antígeno Tn glicosilada [19]. El tratamiento de células de cáncer humano con el inhibidor de O-glicosilación bencil-GalNAc, un inhibidor competitivo para C1GalT transferasa y alfa-2,3-sialiltransferasa, disminuye la expresión de ácidos siálicos celulares y aumenta la expresión de TF [20].
en este estudio, se evaluó la consecuencia de la supresión selectiva de la C1GalT de siRNA en expresión de TF, Tn, Tn sialil-glicanos y Core 3-asociados en células de cáncer de colon humano.
Materiales y Métodos
Materiales
siRNA construye contra C1GalT y revueltos control no siRNA dirigidos se obtuvieron de Dharmcon (Ciencia Perbio, Northumberland, Reino Unido). Biotinylated-
Griffonia simplicifolia
lectina II (GSL-II) se adquirió de Vector Laboratories (Peterborough, Reino Unido). Los anticuerpos monoclonales contra Tn (clon HB-Tn1) y sialil-Tn (clon HB-STN1) fueron adquiridos de Dako (Productos Patología, Ely, UK). aglutinina de cacahuete conjugado con FITC (FITC-PNA) se obtuvo de Sigma.
Líneas Celulares
cáncer de colon humano HT29 y las células SW620 se obtuvieron a partir del cultivo de células de Colecciones Europeas en el Laboratorio de Salud Pública, Porton Down Wiltshire, UK y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y glutamina 4 mM como se describe anteriormente [21].
represión de C1GalT expresión de siRNA
Las células se cultivaron por triplicado en placas de 96 pocillos (5,0 x 10
3 células /pocillo) en DMEM sin antibiótico que contiene FCS al 5% a 37 ° C durante 24 horas antes incubaron con o sin 100 nM siRNA contra C1GalT o control no revueltos siRNA dirigidos a 37 ° C durante 48 horas. Las células se lavaron y se lisaron para la cuantificación de proteínas y tragamonedas borrones.
Slot Blotting
Los extractos de proteínas celulares se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa con PR600 SlotBlot (Hoeffer Scientific Instruments, CA). Las transferencias se bloquearon con 5% BSA, 0,5% de Tween-20 en PBS a 4 ° C durante la noche antes de la aplicación de anticuerpos monoclonales contra el TF (TF5) (0,2 g /ml) [22], Tn (0,2 g /ml), sialil Tn (0,03 g /ml) o biotinilado GSL-II (0,6 mg /ml) durante 1 hr. Después del lavado y posterior aplicación de conjugado con peroxidasa de anticuerpo secundario (3 ng /ml) o con peroxidasa Extravidin (Sigma, 1:10,000 dilución) durante 1 hora, las transferencias se lavaron y se visualizaron usando un kit de detección de inmunotransferencia Super-señal de quimioluminiscencia (Pierce ; Rockford IL, EE.UU.). Se realizó un análisis de densitometría de las manchas utilizando el software Image Lab (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido).
fluorescencia de inmunohistoquímica
p>
4 células /pocillo) en DMEM sin antibiótico que contiene FCS al 5% a 37 ° C durante 24 horas antes de la incubación con o sin 100 nM siRNA contra C1GalT o control mezclado no siRNA dirigidos a 37 ° C durante 48 horas. Las células se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 10 min. Después de dos lavados con PBS, las células se incubaron con suero de conejo 10% durante 1 hora antes de la aplicación de anticuerpos contra STn, Tn (tanto suero de conejo 1/100 dilución en 10%), FITC-PNA (5 g /ml) o biotinilado GSL-II (5 mg /ml) durante 2 hr. Las células se lavaron con PBS y se aplican con el anticuerpo conjugado con FITC secundario (1:100 dilución) o FITC-estreptavidina (1:1,000 dilución) durante 1 hr. Las células se lavaron con PBS, se montaron con DAPI que contiene medio de montaje de fluorescencia y la imagen con un microscopio de fluorescencia Olympus B51 utilizando un objetivo de 40x.
Resultados y Discusión
represión de la C1GalT se logró por ARNsi tratamiento de células HT29 de cáncer de colon SW620 y humanos. La eficiencia de C1GalT knock-down se controló por la expresión celular de TF con el anticuerpo anti-TF. tratamiento C1GalT siRNA de las células HT29 durante 48 horas causó supresión efectiva de expresión C1Gal1T como se manifiesta por 86 ± 3% (media ± DE) de reducción de la expresión de FT celular (Fig. 1 A y B). Una reducción similar de la expresión TF también se observó en las células SW620 después del tratamiento C1GalT siRNA (Fig 2 A y B).
A:. HT29 expresión glicano en la respuesta celular a C1GalT siRNA o controlar siRNA. Después del tratamiento de las células con siRNA C1GalT o control no siRNA dirigidos (con-siRNA), expresiones celulares de TF, Tn, sialil-Tn y vinculante GSL-II (glicanos GlcNAc-, Core 3-asociado) se evaluaron mediante transferencias de ranura con anticuerpos monoclonales contra TF (TF5), Tn (HB-Tn1), sialy-Tn (HB-STN1) o con biotina-GSL-II. Las transferencias paralelas se probaron con anticuerpos contra la β-actina para la igualdad de la carga de proteínas. evaluaciones duplicados se muestran para cada mancha. B: La cuantificación de la expresión de TF celular, Tn, Tn-sialy y GSL-II de unión (glicanos asociado-3 GlcNAc-, Core) en respuesta de las células HT29 a C1GalT siRNA. Las densidades de las manchas de las ranuras se cuantificaron * y las expresiones de glicano se expresan como porcentaje de cambio a la de control no siRNA después de la normalización con la carga de proteínas. * Las densidades blot de la expresión de FT a partir de células HT29 tratadas y no tratadas C1GalT siRNA fueron 5004 y 715; Tn 1314 y 4345; sialil-Tn 1634 y 4868; GSL-II de unión (Core 3) 489 y 1156 y Tublin 1898 y 1928.
R: SW620 expresión de glicanos en la respuesta celular a C1GalT siRNA o controlar siRNA. Después del tratamiento de las células con siRNA C1GalT o control no siRNA dirigidos (con-siRNA), expresiones celulares de TF, Tn, sialil-Tn y vinculante GSL-II (glicanos GlcNAc-, Core 3-asociado) se evaluaron mediante transferencias de ranura con anticuerpos monoclonales contra TF, Tn, Tn-sialy o con biotina-GSL-II. Las transferencias paralelas se probaron con anticuerpos contra la β-actina para la igualdad de la carga de proteínas. evaluaciones duplicados se muestran para cada mancha. B: La cuantificación de la expresión de TF celular, Tn, Tn-sialy y GSL-II de unión (glicanos GlcNAc-, Core 3-asociado) en la respuesta de las células SW620 de siRNA C1GalT. Las densidades de las manchas de las ranuras se cuantificaron * y las expresiones de glicano se expresan como porcentaje de cambio a la de control no siRNA después de la normalización con la carga de proteínas. * Las densidades blot de la expresión de FT a partir de células SW620 tratados y tratados C1GalT siRNA fueron 5144 y 834; Tn 1437 y 4313; sialil-Tn 1748 y 4792; unión GSL-II (Core 3) 481 y 1229 y Tublin 1984 y 1982.
Tener suprime eficazmente la expresión C1GalT, que luego se compararon las expresiones celulares de sialil-Tn (STN), Tn y Core 3 glicanos. Las expresiones de celular sialil-Tn Tn y glicanos se evaluaron mediante transferencias de ranura con anticuerpos contra sialy-Tn y Tn. No anticuerpo contra Core 3 glicano está disponible actualmente y por lo tanto utiliza el
Griffonia simplicifolia
lectina II (GSL-II) de unión como un indicador de la expresión de glicanos Core 3 asociados. GSL-II es una lectina aislada de
Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia
y reconoce los residuos de GlcNAc alfa- y beta-ligado en el terminal no reductor de los oligosacáridos [23]. Se encontró que la supresión de C1GalT resultó en 198 aumento ± 8% de sialil-Tn y 136 ± 24% de aumento de GSL-II de unión (GlcNA-, Core 3), respectivamente, en HT29 y 174 ± 11% y ± 37 155 % de aumento en las células SW620 (Fig. 1 y Fig. 2). Supresión de C1GalT también se observó que ir acompañado de un marcado aumento de la expresión de Tn en HT29 (231 ± 6%) y SW620 (200 ± 5%) de las células.
Para confirmar estos cambios de glicosilación observadas por transferencia en ranura, además se analizó la expresión de estos glicanos en las células SW620 en su respuesta a C1GalT siRNA por immunohistochemstry. El tratamiento de las células con C1GalT siRNA de nuevo mostró una reducción clara de la expresión de TF celular (PNA de unión) y marcado incremento de Tn, sialil-Tn y Core 3 (GSL-II de unión) expresiones mientras que el tratamiento de las células con siRNA de control mostraron poco efecto sobre las expresiones de estos glicanos (Fig. 3).
Sub-confluente células SW620 cultivadas en 8 pocillos cámara de diapositivas de vidrio fueron tratadas sin o con C1GalT siRNA o control no siRNA dirigidos durante 48 horas antes de que las expresiones de TF celular, Tn, sialil-Tn y GSL-II de unión (Core 3-asociado) glicanos se evaluaron por inmunohistoquímica de fluorescencia utilizando biotina-PNA, biotina-GSL-II o anticuerpos contra Tn (HB-Tn1) o sialil-Tn (HB -STn1). se muestran imágenes representativas.
Estos resultados demuestran que la supresión de la C1GalT que controla la biosíntesis de la estructura del núcleo 1 de tipo mucina glicanos O-ligados se acompaña de un aumento de expresiones de sialil-Tn y GSL- II vinculante (Core 3) en células de cáncer de colon humano. Esto apoya la modificación de larga sospecha competitiva del residuo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr entre C1GalT, C3GnT y ST6GalNAc-T en la biosíntesis de los glicanos de tipo mucina O-ligados complejos. Un diagrama esquemático de la iniciación y elongación de los glicanos de tipo mucina O-ligados, con el apoyo de este estudio, se muestra en la Figura 4.
represión de la C1GalT también se observó en este estudio para dar lugar a marcado aumento de la expresión de Tn celular. Esto indica que la formación última de TF celular, Tn, sialil-Tn y Core 3 glicanos son controlados no solamente por la actividad de estas glicosiltransferasas competitivos. Las concentraciones de nucleótidos de azúcar donante y la tasa de transporte de sustrato a lo largo del Golgi se han mostrado previamente contribuir a las expresiones de glicanos específicos [17]. La posición relativa de las glicosiltransferasas en el aparato de Golgi también se informó a ser un factor determinante. El trabajo de Kellokompu y colegas [24], [25] y por nosotros mismos [26] ha demostrado que Golgi trastorno se produce en los cánceres epiteliales y puede ser imitado por los agentes que bloquean la acidificación de Golgi normales, en ambos casos conduce a una mayor formación de antígenos de carbohidrato oncofetales . Además, la expresión y la acción de chaperones moleculares localizadas-ER también pueden desempeñar un papel en la expresión de los glicanos oncofetales controlando el plegado y por lo tanto la actividad de las glicosiltransferasas pertinentes [18]. Por lo tanto, las expresiones celulares globales de Tn, sialy-Tn, TF y Core 3 estructuras son la consecuencia de una serie de factores complejos que incluyen la competencia entre las glicosiltransferasas relevantes, la disposición espacial de las glicosiltransferasas en el aparato de Golgi, la disponibilidad de azúcar de nucleótido -donors en el aparato de Golgi y acciones de las chaperonas moleculares pertinentes.
los antígenos Tn, TF y sialil-Tn son todos conocidos como estructuras de carbohidratos oncofetales. Se expresan en el epitelio fetal luego convertido oculto por otros residuos de azúcar en el tejido adulto sano pero volver a aparecer en las células displásicas cancerosas y precancerosas. Se estima que hasta un 90% de todos los cánceres humanos llevan estos antígenos de hidratos de carbono oncofetales [27], [28], [29], [30]. Aumento de la aparición de estas estructuras de carbohidratos oncofetales se asocia con el desarrollo y la progresión de diversos cánceres humanos incluyendo cáncer de mama [31], colon [27], [32] y de páncreas [33] cánceres. La evidencia creciente sugiere que la alteración de estos glicanos oncofetales puede desempeñar un papel activo en la metástasis. Supresión de intestinales Core 1 derivado de O-glicanos ha sido recientemente demostrado que causa colitis espontánea en ratones [34]. Baja regulación de la expresión C3GnT6 se asocia con un aumento de la displasia /neoplasia en cáncer colorrectal humano [35]. Más de expresión del antígeno sialil-Tn por las células cancerosas se ha demostrado que causa comportamientos celulares más agresivas, tales como aumento de la adhesión a la matriz extracelular y el aumento de la migración y la invasión
in vitro
[36], [37] y
in vivo
de inmunodeficiencia combinada (SCID) grave [37]. La sobreexpresión de ST6GalNAc-I ha demostrado ser co-localizada con sialil-Tn en metaplasia intestinal humana, así como en el carcinoma gástrico y se ha sugerido que desempeñar un papel importante en sialil-Tn sobreexpresión en condiciones de cáncer [12], [13] . Un aumento de la interacción entre TF expresado en la proteína de mucina asociada a cáncer MUC1 y galectinas circulantes, como consecuencia del aumento de la expresión de /células MUC1 por las células cancerosas y también de la mayor liberación de las galectinas por /estroma /tejido inmune cancerosas que expresan TF-en la circulación, los cuales son características comunes en el cáncer, se ha demostrado que la promoción de célula de cáncer de la diseminación metastásica a los órganos remotos [21], [38], [39]. Este efecto de la TF /interacción MUC1-galectina se produce como resultado del aumento de la adherencia heterotípicos de células de cáncer al endotelio vascular [38], y también como resultado de la agregación homotípica de células de cáncer para formar émbolos micro-tumor que prolonga la supervivencia de células tumorales en el la circulación y permitir que otros dentro de los capilares en el lugar de la metástasis [40], [41]. También se ha informado de que pacientes con cáncer de mama con niveles más altos de anticuerpo anti-TF muestran mejor pronóstico que los pacientes con niveles más bajos de anti-TF [42]. La orientación de estos glicanos oncofetales por la inmunoterapia con péptidos que imitan TF-para el tratamiento potencial de cáncer se ha mostrado resultados prometedores en ratones [43].
Por lo tanto, la competencia entre las glicosiltransferasas para la modificación del residuo GalNAc de GalNAcα-Ser /Thr y sus consecuencias para la expresión de antígenos de carbohidrato oncofetales implica una estrategia potencialmente útil para el desarrollo de terapias de glicosiltransferasa orientada para el cáncer.