Extracto
Objetivos
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1), un miembro de la familia de la proteína activadora de RhoGTPase (GAP), se sabe que tiene actividades de supresión de tumorigenicidad y metástasis del cáncer. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de cómo DLC1 suprime la motilidad celular no han sido completamente aclarada. Rho-quinasa (ROCK) es un efector aguas abajo inmediata de RhoA en la mediación de los acontecimientos del citoesqueleto celular y la motilidad celular. En el presente estudio, que tuvo como objetivo investigar los efectos de DLC1 en vía de señalización Rho /ROCK en el carcinoma hepatocelular (HCC).
Metodología /Principales conclusiones
Hemos demostrado que DLC1 regulada negativamente ROCK la contractilidad actomiosina dependiente. De immumofluorescence estudio, se encontró que la expresión ectópica de DLC1 abrogada Rho /reorganización del citoesqueleto mediada por ROCK incluyendo la formación de fibras de estrés y adhesiones focales. También downregulated fosforilación cortical de la cadena ligera de la miosina 2 (MLC2). Estos eventos inhibitorios por DLC1 eran RhoGAP-dependiente, como mutantes deficientes en RhoGAP de DLC1 (DLC1 K714E) abolió estos eventos inhibitorios. Además, a partir del estudio occidental, DLC1 inhibe la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina relacionados ROCK-1 unidad de focalización (MYPT1) fosforilación en treonina 853. Al examinar la morfología celular bajo el microscopio, se encontró que la expresión ectópica de ROCA dominante-activa las células de los inducida DLC1-lanzado colapso del citoesqueleto y la contracción de la célula.
Conclusión
Nuestros datos sugieren que DLC1 regula negativamente la Rho /ROCK /MLC2. Esto implica una vía mediada por ROCK de DLC1 en la supresión de la metástasis de las células de HCC y enriquece nuestra comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la progresión del carcinoma hepatocelular
Visto:. Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, LK Chan, Ching YP, Yam JW-P, et al. (2008) Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) regula negativamente la Rho /ROCK /MLC Camino en el carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10.1371 /journal.pone.0002779
Editor: Neil Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 20 Abril, 2008; Aceptado: 30 de junio de 2008; Publicado: 23 de julio 2008
Derechos de Autor © 2008 Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por Hong Kong Consejo de Ayudas a la Investigación (HKU 7436 /04M), RGC colaboración Fondo Reseaarch (HKU 1 /06C), Michael y Programa de Investigación de Genética del cáncer Betty Kadoorie 2004. LIO Ng es Loke Yew Profesor de Patología
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La migración celular implica ciclos de pasos que comienzan a partir del. formación de protuberancia de células en el borde de ataque. En los sitios de protuberancia, se forman adhesiones focales para unir el citoesqueleto, principalmente actina y miosina, a la matriz extracelular. El citoesqueleto genera la tensión que resulta en la contractilidad actomiosina de trasladar el cuerpo celular. Finalmente, la tensión libera las adherencias de borde de salida de la célula [1]. La desregulación en cualquiera de los pasos implicados en la migración de células puede resultar en el movimiento celular aberrante y, en células de cáncer, metástasis [2]. El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los cánceres más frecuentes en todo el mundo. metástasis intrahepática es la principal causa de mortalidad en pacientes con este cáncer. Por lo tanto, creemos que una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la migración celular HCC puede arrojar luz para el desarrollo de nuevos dirigido la intervención terapéutica.
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1), un gen supresor de tumores, se identificó por primera en HCC primaria como un homólogo p122RhoGAP rata [3]. En HCC, DLC1 se ha encontrado que poseen capacidades supresores de tumores [4] - [6] y se underexpressed principalmente a través de la supresión de genes y la metilación del ADN [7] - [9]. Disminución en la expresión de DLC1 también está implicado en otros tipos de cáncer como el de mama, pulmón y próstata [9] - [14]. DLC1 también ha demostrado ser downregulated en las células metastásicas en comparación con células no metastásicas en mama y modelos de HCC [15], [16]. Se encontró la expresión ectópica de DLC1 para suprimir la migración celular y la invasión en HCC, no pequeñas de cáncer de pulmón de células, cáncer de mama, cáncer de pulmón, los modelos de línea celular de cáncer de ovario [4], [15], [17] - [21], y la sobreexpresión de DLC1 en línea celular de cáncer de mama metastásico podría atenuar el tamaño y la incidencia de metástasis pulmonares [15]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a esta supresión de movimiento de las células y la metástasis del cáncer siguen sin estar claros.
DLC1 es un miembro de la RhoGTPase activación de la proteína de la familia (RhoGAP) y posee una actividad específica para RhoGAP RhoA [8]. DLC1 regula negativamente la actividad de RhoA mediante la mejora de la actividad hidrolítica GTP intrínseca de RhoA, catalizando así la conversión de RhoA desde su estado activo unido a GTP a estado inactivo unido a GDP [22]. Rho-quinasa (ROCK) es el efector aguas abajo más conocido de RhoA [23], [24]. La unión de RhoA lanzamientos de rock de su estructura autoinhibitory y activa los eventos mediada por ROCK celulares [23], [25] - [27]. ROCA se sabe que regulan los procesos celulares relacionados con la motilidad celular. Por ejemplo, ROCK fue mostrado para controlar la polaridad celular mediante la regulación de PTEN /Akt vía de señalización en los neutrófilos [28] y controlar la retracción de la cola en monocitos y células de cáncer de próstata [29] - [31]. ROCA contractilidad mejorada también actomiosina, un paso principal de la migración de células como se describe anteriormente [32]. Es importante destacar que el rock es una quinasa que fosforila y activa a muchos sustratos tales como aguas abajo LIMK y la cadena ligera de la miosina 2 (MLC2). La fosforilación de estos sustratos es importante en la regulación de la reorganización del citoesqueleto y la migración celular [33], [34]. Hiperactivación de la vía Rho /ROCK se sabe que está asociada con propiedades más agresivos del tumor, tales como la metástasis y la invasión [35] - [41]. La desregulación de la vía Rho /ROCK en consecuencia puede ser relacionado con su vía de regulación aguas arriba aberrante. Hemos demostrado anteriormente que es una proteína DLC1 RhoGAP y por ello es lógico especular que DLC1 suprime la metástasis de las células cancerosas a través de la regulación negativa citoesqueleto reordenación mediada por ROCK. Sin embargo, esta hipótesis no se ha probado experimentalmente y la base mecánica de cómo DLC1 suprime la metástasis de células de cáncer no se ha delineado. Por lo tanto, es estratégica para examinar las posibles relaciones funcionales entre DLC1 y vía de rock y sus implicaciones en el CHC.
En este estudio, hemos demostrado que DLC1 inhibidos eventos citoesqueleto mediada por ROCK, incluyendo la formación de fibras de estrés y el contacto focal red y la fosforilación de MLC2 en corteza celular. Significativamente, estos efectos inhibitorios de DLC1 dependía de su actividad RhoGAP. Además, hemos demostrado que DLC1 funcionó como un regulador negativo de la roca en el control de la morfología celular. En general, hemos demostrado que DLC1 regulada negativamente ROCK en suprimir el movimiento celular en el CHC.
Resultados
DLC1 abolida formación de fibras de estrés mediada por ROCK y la red de adhesión focal
En primer lugar, nos preguntó si la formación de fibras de estrés y adhesiones focales en células de HCC fue ROCA dependiente. Se encontró que, la fibra de estrés agrupación de arrays (teñido con colorante faloidina) y adherencias focales (paxillin), en particular los de la región central que fueron asociadas con el estrés fibras, se suprimirán a partir de un tratamiento inhibidor de roca (Figuras 1A). Este hallazgo indica que la formación de las fibras de estrés y adhesiones focales en células de HCC es ROCK-dependiente.
(A) inhibidor ROCA suprimida de fibras de estrés y la formación de adhesión focal en células de HCC. células SMMC-7721 se sembraron en cubreobjetos un día antes del tratamiento. las fibras de estrés se tiñeron con tinción phalloidin (rojo) y las adhesiones focales con tinción de paxillin (verde). las fibras de estrés pudieron observarse claramente como manojos extiende a través de las células y las adhesiones focales estaban unidos a la fibra de estrés agrupación de arrays en SMMC-7721 de control tratado de forma simulada. El tratamiento con inhibidor Y27632 roca en 10 mM durante 60 minutos formación de fibras de estrés y de la red de adhesión focal suprimidas en SMMC-7721. (B) y (C) DLC1 suprimida de fibras de estrés mediada por ROCK y la formación de adhesión focal en células de HCC. células SMMC-7721 (i) y BEL7402 (ii) se transfectaron con etiqueta myc plásmidos de expresión, pCS2 + MT, pCS2 + MT /DLC1, y pCS2 + MT /DLC1 K714E, y reconocidos por los anticuerpos anti-myc (9E10). las fibras de estrés y adhesiones focales se tiñeron con faloidina-TRITC y el anticuerpo anti-paxillin, respectivamente. De tipo salvaje DLC1, pero no mutante RhoGAP deficientes (DLC1 K714E), la formación de fibras de estrés suprimido y reducido el número de fibras de estrés ligado a adhesiones focales formados en células SMMC-7721. Porcentaje de diferentes construcciones DLC1 transfectadas células que presentan las fibras de estrés o adhesiones focales se presentaron en un gráfico de barras en consecuencia. Para cada constructo, el total de 67-170 células transfectadas se contaron bajo el microscopio. Las barras de error representan la desviación estándar (DE) de los datos obtenidos a partir de dos experimentos independientes.
Para investigar la función reguladora del DLC1 de fibras de estrés mediada por ROCK y la formación de adhesión focal en el CHC, transitoriamente overexpressed en DLC1 se estudiaron las células deficientes en DLC1 SMMC-7721 y BEL7402 HCC y sus efectos sobre la red de fibras de estrés y adhesiones focales. La sobreexpresión de tipo salvaje DLC1 suprimió significativamente la formación de fibras de estrés y adhesiones focales en estas células, como se indica por faloidina (Figura 1B) y las manchas paxillin (Figura 1C-i y 1C-ii), respectivamente. Análogo a la inhibición de roca (Figura 1A), DLC1 abolió principalmente las adhesiones focales de fibra ligado estrés situados en la región central de las células (Figura S1A). La pérdida de adherencias focales se agrava aún más con la expresión ectópica de SAM mutante suprimido dominio de DLC1 (ΔSAM) (Figura S1B), una DLC1 truncado constructo que causó un encogimiento celular más severa y pérdida de fibras de estrés [4]. Por el contrario, un mutante deficiente en RhoGAP (DLC1 K714E) fue incapaz de inhibir tanto de fibras de estrés y la formación de adhesión focal (Figuras 1B y 1C). Estos resultados demostraron que DLC1 ROCA inhibe el estrés de fibra dependiente y la formación de adhesión focal a través de su actividad RhoGAP.
DLC1 abolida la cadena ligera de la miosina cortical mediada por ROCK 2 fosforilación
Active Rock fosforila específicamente la cadena ligera de la miosina 2 (MLC2) en Ser 19; Por lo tanto, esta fosforilación-ROCK específico ha sido ampliamente utilizado como un marcador sustituto de la actividad ROCA [36], [42] - [45]. La fosforilación de Ser19 en MLC2 es importante para la actividad de la miosina que es responsable de la contractilidad actomiosina y por lo tanto la migración de células [46]. En este estudio, se observó que fosfo-MLC2 tinción de las células BEL7402 HCC fue especialmente prominente en la corteza celular. Sin embargo, cuando la actividad de Rock fue bloqueado ya sea por Y27632 (Figura 2A) o la expresión ectópica de un mutante dominante negativo ROCA (Figura 2B), esta fosforilación periférica de MLC2 era completamente abolido y la fosforilación de MLC2 se convirtió en un patrón predominantemente citoplasmática. Por el contrario, la expresión ectópica de ROCA dominante-activo culminó en un aumento sustancial de la fosforilación MLC2 en haces de actina (Figura 2B). Estos hallazgos indican que este patrón de fosforilación distintivo de MLC2 en la corteza celular está estrechamente regulada y positivamente por la actividad roca.
línea (A) BEL4702 HCC células tratadas con el control de maqueta o un inhibidor de roca (Y27632) se probaron con monoclonal de ratón anticuerpo contra fosfo-MLC2 (Ser 19). Fosfo-MLC2 (verde) se detectó principalmente en la corteza celular de las células BEL7402 (como se indica por las flechas) y este patrón de tinción cortical fue abolida por tratamiento con Y27632 inhibidor de roca. (B) BEL7402 células fueron transfectadas con la roca dominante negativo myc-etiquetados o construcciones de escombros activos dominantes y se detectaron con el anticuerpo policlonal de conejo contra-myc epítopo (A14) (rojo). Dominant activo (DA) oscile causó intensa fosforilación de MLC2 (Ser 19) a los haces de actina (PRECENTAGE de células que muestran este fenómeno: 94,0% de las células transfectadas-ROCK DA en comparación con 0% de las células transfectadas vector). Las flechas señalan los haces de actina de la célula transfectada ROCA activo dominante en el que se la fosforilación potenciada de MLC2 (Ser 19). dominante negativo (DN) ROCA suprimió la fosforilación cortical del MLC2 (Ser 19) (Porcentaje de células que presentan este fenómeno: el 87,5% de las células transfectadas DN-ROCK en comparación con el 7,3% de las células transfectadas vector). Las flechas apuntan en la corteza celular de la célula transfectada ROCA dominante negativo donde se perdió la fosforilación de MLC2 (Ser 19). Como se muestra, se pidió a una regulación estricta y un nivel óptimo de actividad de roca para mantener la fosforilación cortical del MLC2 (Ser 19) en BEL7402 células.
A continuación se investigó si DLC1 podría abolir esta MLC2-ROCK específica patrón de fosforilación en células de HCC. En primer lugar, evaluamos si el patrón de tinción de fosfo-MLC2 cortical estaba relacionada con los niveles de expresión endógenos de DLC1 en diferentes líneas celulares. Hemos observado visible tinción de fosfo-MLC2 en la corteza celular en SMMC-7721, BEL7402, y las líneas WRL HCC de células (Figura 3C), y la línea HeLa cervical de células de cáncer (Figura 3C), que no tenía expresión de DLC1 (Figura 3A). Por otro lado, HepG2 y Hep3B, las dos líneas celulares de HCC con expresión DLC1 (Figura 3A), muestran difusa tinción citoplásmica fosfo-MLC2 sin ninguna fosforilación cortical distinta de MLC2 en la periferia de células (Figura 3B).
(a) la expresión del ARNm DLC1 y proteínas en líneas celulares de HCC. (B) y la expresión DLC1 (C) se asoció con un patrón de tinción de fosfo-MLC2. Representante imágenes de células DLC1-positivos y negativos DLC1, respectivamente. DLC1 positivo Hep3B y HepG2, muestran la fosforilación difusa de MLC2, mientras que DLC1 que no expresa BEL7402 y HeLa, representada pronunciada fosforilación cortical del MLC2 en la corteza celular.
Para comprobar que la inhibición de la cortical fosfo-MLC2 estaba directamente relacionado con DLC1, que a continuación expresa transitoriamente de tipo salvaje y mutante DLC1 DLC1 RhoGAP deficientes (K714E), respectivamente, en las células BEL7402 DLC1 nulo. DLC1 Wildtype reduce sustancialmente el número de células que tienen fosfo-MLC2 tinción cortical (figuras 4A & amp; 4B), lo que significa el papel de supresión de DLC1 sobre la actividad de roca. Por otro lado, mutante DLC1 RhoGAP deficientes (K714E) no pudo abolir fosfo-MLC2 tinción cortical (figuras 4A & amp; 4B). Por lo tanto, nuestra observación sugiere DLC1 inhibido-ROCK específica MLC-2 fosforilación en células de HCC, a través de su actividad RhoGAP.
(A) pCS2 + MT vector solo, pCS2 + MT DLC1, y pCS2 + MT DLC1 K714E, respectivamente , se transfectaron en células BEL7402. Reconocimiento de células transfectadas se realizó mediante el sondeo células con c-myc anticuerpo (A14) de conejo seguido de tinción con anticuerpo anti-conejo conjugado con Rojo Texas. Las células transfectadas con pCS2 + MT vector solo muestran la fosforilación cortical pronunciada de MLC2 como se indica por las flechas. Las células transfectadas con DLC1 muestran pérdida de fosforilación cortical de MLC2. Las células transfectadas con DLC1 K714E, el mutante deficiente en RhoGAP, todavía muestran la fosforilación cortical pronunciada de MLC2 como se indica por las flechas. (B) Porcentaje de diferentes construcciones que muestran la fosforilación DLC1 cortical del MLC2 en la Ser 19 se calcula y se presenta en un gráfico de barras. Para cada constructo, se contaron 80-100 células transfectadas y se registró cortical fosforilación MLC2. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de los datos obtenidos a partir de tres experimentos independientes.
DLC1 atenuada miosina actividad de la fosfatasa mediante la reducción de la fosforilación de la miosina fosfatasa objetivo subunidad 1 (MYPT1) en Thr 853
además de la fosforilación de la miosina, ROCK también aumenta la fosforilación de la miosina por fosforilación de la miosina fosfatasa objetivo subunidad 1 (MYPT1) en Thr 696 y Thr 853 y por lo tanto la inactivación de la misma. Aunque Thr 696 de MYPT1 puede ser fosforilados por otras proteínas quinasas, Thr 853 de fosforilación, por otra parte, se regula de forma selectiva por la roca [32]. Por otra parte, MYPT1 Thr 853 fosforilación se ha mostrado ser un marcador sustituto prometedor que a la inversa se correlaciona con la actividad de la miosina fosfatasa [36], [42] - [45]. En este estudio, se encontró que, al Y27632 tratamiento, los niveles de fosforilación de Thr 853 MYPT1 () se redujeron en todas las líneas celulares de HCC prueba (Figura 5A), mientras que los niveles totales de MYPT1 mantuvo sin cambios. Del mismo modo, la sobreexpresión de DLC1 atenuada fosforilación de MYPT1 en Thr853, lo que indica la pérdida de actividad de roca (Figura 5B). La inactivación de la fosfatasa de miosina (como se refleja por un aumento de la fosforilación MYPT1) y la activación de MLC2 son efectos ROCK combinado, y estos efectos podría ser suprimida por DLC1, dando lugar a una disminución total de la fosforilación de la miosina y una reducción de la contractilidad celular.
(a) Y27632 inhibidor ROCA suprimió la fosforilación en Thr 853 MYPT en todas las líneas celulares de HCC. (B) DLC1 suprimió la fosforilación en Thr 853 MYPT en 293 células T. intensidad de la banda fue analizado por AlphaEaseFC ™ y el porcentaje se calculó a partir de la comparación con su control de acuerdo.
ROCA inhibidor suprime la motilidad celular HCC
Por la expresión ectópica de DLC1 en la línea celular HCC, nos anteriormente mostró que DLC1 reprimió significativamente la migración de células HCC y la invasividad [4]. Para corroborar nuestra hipótesis de que DLC1 suprimió la migración celular a través de la actividad ROCA regulando negativamente, se examinó el efecto del inhibidor de la roca sobre la migración de las células HCC con transwell ensayo. Hemos observado que el inhibidor de Y27632 ROCA suprimió la migración de células de HCC, SMMC-7721 (Figura 6A panel izquierdo) y BEL7402 (panel izquierdo Figura 6B), como se demuestra por la disminución del número de células migradas en el ensayo transwell. Este hallazgo indica que la actividad roca es crucial para la migración de células HCC. Para eliminar cualquier mala interpretación debido a la muerte celular causada por la toxicidad del fármaco, se realizó el ensayo de proliferación celular en las células de HCC. Ensayo de proliferación celular demostró que Y27632 no afectó el crecimiento celular, que confirmó que la inhibición de la ROCA sólo afectó la migración celular HCC (Figura 6A y 6B panel de la derecha).
Y27632 inhibidor ROCA suprimió la migración de células HCC. Y27632 disminución del número de emigrado (A) células SMMC-7721 (
P Hotel & lt; 0,0001,
t-test
) y (B) BEL7402 células (P & lt; 0,0001,
t
-test). Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de los datos obtenidos a partir de tres campos microscópicos. Los experimentos se han repetido tres veces. Ensayo de proliferación celular se muestra a la derecha para comparar la tasa de crecimiento de las células de control simuladas y Y27632 células tratadas.
Roca invierte la célula alteración morfológica de DLC1
previamente demostrado que era DLC1 capaz de inducir células cambio morfológico con la formación de fibras reducida estrés en células de HCC y fibroblastos [4]. Dado que la roca es un modulador principal en la señalización del citoesqueleto y la organización del citoesqueleto es un determinante clave de la morfología celular, especuló que los cambios morfológicos celulares inducidos por DLC1 fueron a través de roca. Con este fin, se observó la morfología celular de las células cotransfectadas DLC1 y rock por tinción de inmunofluorescencia. también Se contó el número de células que mostraban colapso celular o la contracción causada por el colapso de la red de citoesqueleto (Figura 7C), como se describe en otro lugar [4], [47] - [49]. En este estudio, se observó que la sobreexpresión de DLC1 en células COS7 induce el colapso del citoesqueleto o la contracción celular (Figura 7A-i), similar a nuestro hallazgo anterior [4]. la contracción de las células se intensifica por la expresión ectópica de SAM mutante suprimido dominio de DLC1 (ΔSAM) (Figura 7B-i). La co-transfección del vector vacío pEGFP no pudo rescatar células cambio morfológico DLC1 inducida, pero las células con el rock activa dominante podría superar la regulación inhibidora de DLC1 (Figura 7A-ii) e incluso DLC1ΔSAM (Figura 7B-ii) y células de DLC1 lanzado encogimiento celular inducida. Este experimento demostró que el rock es uno de los efectores de DLC1 en la coordinación de los cambios morfológicos en las células de HCC.
células COS7 fueron co-transfectadas con DLC1 (A) y ROCK o (B) DLC1ΔSAM y Rock, respectivamente . Las células transfectadas con pCS2MT DLC1 o pCS2MT DLC1ΔSAM aparecieron rojo, mientras que las células transfectadas con pEGFP o pEGFP ROCA aparecieron verde. DLC1 inducida por colapso del citoesqueleto celular o contracción celular (A-i), que fue aún más mejorado y claramente demostrado por constructo eliminado-SAM, pCS2 + MT DLC1ΔSAM (B-i). Rock fue capaz de restaurar las células de la contracción inducida por DLC1 celular (A-II) e incluso de DLC1ΔSAM inducida intensa contracción celular (B-II). se contaron las células transfectadas con Co (C) y sus morfologías registradas. El número de células cotransfectadas que muestran contracción celular (colapso celular) observable fue dividido por número total de células co-transfectadas contados, para calcular el porcentaje de células en la visualización de la contracción como se muestra en el gráfico de barras. Para cada columna, se contaron 150-200 células co-transfectadas. Las barras de error representan la desviación estándar (DE) de los datos obtenidos de tres experimentos independientes.
Discusión
Una de las funciones importantes de DLC1 es su capacidad para reprimir la migración celular y la invasión del cáncer. En este estudio para dilucidar los mecanismos subyacentes en la regulación de la migración celular y la invasión por HCC DLC1, hemos demostrado que DLC1 suprimió la migración de células HCC través de la regulación del citoesqueleto de actomiosina y contracción. Además, hemos demostrado que DLC1 funcionó como un regulador negativo de ROCK en el control de la morfología celular.
DLC1 negativamente regulado ROCA mediada la contractilidad actomiosina
El movimiento contráctil de las células cancerosas es generada por contracciones consecutivas de actomyosin paquetes compuestos de actina y miosina llamado actomiosina. Estos haces de actomiosina, visualizadas como fibras de estrés, se extienden a través del cuerpo de la célula y crean una tensión para generar contracción de la célula para conducir el movimiento de células mediante la conexión con las moléculas de adhesión focal [50]. Basado en el estudio anterior sobre el efecto inhibidor de DLC1 de fibras de estrés, en este documento se han encontrado, además, que la formación de fibras de estrés y la red de centros de adherencias dependía de DLC1 RhoGAP y la actividad de ROCK en células de HCC. Este hallazgo también se aclara que las fibras de estrés y adhesiones focales trabajan de la mano como se ha descrito por Hall A. [51], y su formación es interdependiente y estrechamente regulada por RhoGAP de la actividad ROCA DLC1 y. Además, DLC1 disminución de la fosforilación mediada-ROCK de MYPT1 (Thr853) y la fosforilación de MLC2 (Ser19) y que por lo tanto dar lugar a una disminución de la fosforilación total de la miosina y causar una reducción de la contractilidad de fibras de estrés [46]. Todas estas líneas de evidencia convergieron para explicar que DLC1 controlado uno de los mecanismos fundamentales migratorias, actomyosin contracción, similar a otro miembro de la familia RhoGAP, España
DLC1 abolió la formación de adhesión focal p190-RhoGAP [52]. Y también localizada a la adhesión focal complejo
Una cuestión intrigante de este hallazgo sobre el efecto inhibidor de RhoGAP en las moléculas de adhesión focal ha surgido. Se encontraron DLC1 y varios miembros de las proteínas RhoGAP incluyendo p122-RhoGAP y RC-GAP72 a ser localizados en los centros de adherencias [47], [49]. De hecho, los demás y nos han informado anteriormente de que DLC1 también localiza en las adhesiones focales e interactuó con los miembros de la familia tensina [18], [53], [54]. En este estudio, se encontró que DLC1 suprime la formación de adhesión focal fibra relacionado el estrés por su actividad RhoGAP. De estudio de inmunofluorescencia, se observó que, en una parte de las células transfectadas DLC1, DLC1 exhibió un patrón de adhesión focal de localización (Figura S1A); mientras que en algunas otras células transfectadas DLC1, especialmente los que presentan una amplia contracción celular, una pérdida intensa de las adhesiones focales vinculados con el estrés de fibra se observó (Fig. 1C). DLC1 la localización de las adhesiones focales y su efecto inhibitorio sobre las adhesiones focales no son mutuamente excluyentes. Especulamos que efecto de la dosis podría ser uno de los factores involucrados. Cuando una célula se transfectó con una alta dosis de DLC1, DLC1 sería apagar todas las fibras de estrés y las adhesiones focales de fibra ligado de estrés y el resultado en extensa colapso celular (Fig. 1C). Por otro lado, cuando una célula se transfectaron con una dosis más baja de DLC1, DLC1 extinguiría la mayor parte de las fibras de estrés y adhesiones focales de fibra ligado estrés, pero sobra algunas adhesiones focales no relacionados con el estrés fibras y dar lugar a un colapso celular más suave ( Figura S1A). Otra especulación de que era similar a la RC-GAP72 [47], DLC1 podría localizarse en la adhesión focal para desintegrar los complejos de adhesión focal.
citoesqueleto colapso inducido por la contracción celular y el impacto de DLC1 el colapso del citoesqueleto
adhesiones focales y fibras de estrés actomyosin siempre funcionan de manera interdependiente y que juntos construyen un andamiaje para apoyar una morfología intacta de la célula [47]. Las interrupciones de la red mencionada causada por DLC1 condujo a un colapso del citoesqueleto celular intensa que resulta en la contracción celular. Este hallazgo fue similar a Barberis D
et al. Estudio de búsqueda: 's en p190RhoGAP que la pérdida de adhesiones focales inducidas por p190RhoGAP precedió a la contracción de células [48]. Hemos observado que la pérdida de adhesiones focales y fibras de estrés se llevó a cabo una hora después de la inhibición del rock por Y27632, pero las células no se derrumbó inmediatamente (Figura 1A) hasta que el tratamiento prolongado de Y27632 hasta 24 horas (Figura S2). A partir de esta observación, conjeturamos que el colapso celular causada por el tratamiento fue Y27632 resultó de la pérdida de adhesión focal y la red de fibras de estrés. Tras la inhibición de la roca por Y27632, las redes citoesqueleto no podían ser formadas y las células ya no podían soportar la pérdida de la red del citoesqueleto y eventualmente sufrir colapso celular, lo que observamos como el encogimiento celular (Figura 8). El presente estudio mostró que el colapso del citoesqueleto inducida por DLC1, un RhoGAP cual su regulación a la baja se asocia con la progresión de HCC, podría ser parcialmente revertido por escombros activos, lo que implica, además, que DLC1 regulada negativamente ROCK en el control de la contractilidad actomiosina, morfología celular, y de forma secuencial la migración celular . Nuestro estudio anterior informó que DLC1 no sólo suprime la migración celular, sino también invasión celular que involucró barrera de la matriz extracelular. Sahai E
et al.
Informó de que las líneas celulares de cáncer pueden poseer diferentes modos de la motilidad celular y las líneas celulares de cáncer de morfología redondeada fueron más sensibles a inhibidor de ROCK en la matriz 3-dimensional [55]. Sin embargo, si este modelo es aplicable a células de HCC y si otras vías proteolíticas extracelulares coorperate con la vía DLC1 /Rho /ROCK /MLC aún se desconocen y esperado que deben abordarse.
fibras de estrés (A) se conectaron a adhesiones focales que forman una red. las fibras de estrés extendía a través de la celda para proporcionar la celda de una morfología intacta. (B) DLC1 RhoGAP o pérdida de actividad ROCA inducen la pérdida de fibras de estrés y adhesiones focales. Unas pocas adhesiones focales y haces de fibras de estrés se mantuvo. (C) Una prolongada o severa pérdida de fibras de estrés y de la red de adhesión focal causada por DLC1 RhoGAP o supresión de la actividad ROCA daría como resultado el colapso del citoesqueleto intensiva. se suprimieron todas las fibras de estrés y adhesiones focales.
Nuestro estudio demostró que el inhibidor de ROCK, Y27632, no afectó a la proliferación de células CHC en una dosis eficaz, que suprimió la migración de células HCC. inhibidores de ROCK han sido ampliamente utilizados en modelos animales, tales como modelos de ratas y ratones, sin causar toxicidad importante a los animales a dosis eficaces [35], [56]. Takamura et al. demostraron que Y27632 podría inhibir la metástasis intrahepática del HCC [35] y, recientemente, otro inhibidor de ROCK, fasudilo, se ha aplicado con éxito en ensayos clínicos para los pacientes con enfermedades cardiovasculares [57]. Estos estudios demuestran que la toxicidad de los inhibidores de ROCK a las células es limitada [35]. La acumulación de conocimientos indica que el rock está jugando un papel importante en la metástasis del cáncer, y el presente estudio ha enriquecido el conocimiento de la vía de señalización ROCK en HCC. inhibidores de ROCK Y27632 como podrían ser útiles para la intervención quimioterapéutica en la supresión de la metástasis intrahepática, una causa importante de mortalidad en los pacientes con HCC, sin causar mucho efectos desfavorables para los pacientes. Además de la caracterización de las eficacias de los inhibidores de ROCK y terapias anti-roca en el tratamiento del CHC está aún pendiente.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y plásmidos
SMMC-7721 y BEL7402 fueron regalos de Shanghai Instituto de Biología celular, Academia de Ciencias de china; 293T, COS7, HepG2 y Hep3B se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293T, BEL7402, SMMC-7721, y COS7 fueron cultivadas en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) alto contenido de glucosa suplementado con suero bovino fetal al 10%; Hep3B y HepG2 se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal 10%. Myc-etiquetados construcciones de expresión (pCAG) que lleva de tipo salvaje ROCA humana, roca activa dominante (1-725 aa), y el mutante dominante negativo ROCA (K105A, I1009A) fueron amablemente proporcionados por S. Narumiya (Facultad de Medicina de la Universidad de Kyoto) [27]. El dominio quinasa humana ROCA (ROCK 76-338 A. A.) se amplificó por PCR y se clonó en el vector pEGFPC3 usando KpnI y XhoI sitios de digestión y fue utilizado como forma activa dominante de roca. De tipo salvaje y DLC1 RhoGAP mutantes deficientes fueron clonados como se describe anteriormente [4].
El tratamiento farmacológico y transfección
-ROCK Y27632 inhibidor específico se obtuvo de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). Para el tratamiento, se añadieron las células Y27632 en 10 mM y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. Para la transfección, 1 × 10
5 células fueron sembradas en cubreobjetos en placas de 35 mm un día antes de la transfección. plásmidos indicados fueron transfectadas en células con reactivo Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza) según las instrucciones del fabricante.
La inmunofluorescencia
Anticuerpo monoclonal de ratón contra la cadena ligera de la miosina fosfo-2 (Ser 19) fue adquirido de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA). Anticuerpo monoclonal de ratón contra paxillin se obtuvo de Upstate (Lake Placid, NY). monoclonal de ratón (9E10) y policlonal de conejo (A14) anticuerpos contra c-myc se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Red conjugado colorante AffiniPure de cabra anti-IgG de ratón y de fluoresceína (FITC) conjugado con AffiniPure de cabra anti-IgG de conejo fueron adquiridos de Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron en paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton X, se bloquearon con albúmina de suero bovino y luego se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios indicados.