Extracto
Antecedentes
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) es una proteína Rho GTPasa de la activación (RhoGAP) con frecuencia borrada y underexpressed en el carcinoma hepatocelular (HCC), así como en otros tipos de cáncer. estudios independientes recientes han demostrado interacción de DLC1 con los miembros de la familia de proteínas de adhesión focal tensina en un mecanismo de dominio dependiente de Src homología 2 (SH2). DLC1 y tensins interactúan y co-localizar a puntiforme estructuras en las adhesiones focales. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la interacción entre DLC1 y varios tensins siguen siendo controvertidos.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizó un ensayo de co-inmunoprecipitación para identificar un sitio de unión previamente indocumentado en 375 a 385 de DLC1 que predominantemente interactuó con la unión fosfotirosina (PTB) de dominio de tensin2. interacción DLC1-tensin2 está completamente abolida en un mutante que carece DLC1 este nuevo sitio de unión PTB (DLC1ΔPTB). Sin embargo, como se demostró por inmunofluorescencia y co-inmunoprecipitación, ni la localización de adhesión focal ni la interacción con tensin1 y C-terminal tensina-como (cten) fueron afectados. Curiosamente, la importancia funcional de este nuevo sitio se expuso por la reducción parcial de la actividad RhoGAP, que, a su vez, atenúa la actividad de crecimiento supresores de DLC1 sobre su eliminación de DLC1.
Conclusiones /Importancia
Este estudio ha proporcionado nuevas pruebas de que DLC1 también interactúa con tensin2 de manera depende del dominio PTB. Además de localizar adecuadamente las adhesiones focales y la preservación de la actividad RhoGAP, la interacción con DLC1 tensin2 a través de este novedoso sitio de unión de adhesión focal contribuye al crecimiento de la actividad supresora de DLC1
Visto:. Chan LK, Ko FCF, Ng IO- L, Yam PTC (2009) Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) utiliza un nuevo sitio de unión para la interacción de dominio PTB Tensin2 y es necesario para la función supresora de tumores. PLoS ONE 4 (5): e5572. doi: 10.1371 /journal.pone.0005572
Editor: Neil Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 21 Enero, 2009; Aceptado: April 15, 2009; Publicado: 15 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Chan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado en parte por el Consejo de Hong Kong Ayudas a la Investigación (HKU 7674 /06M y HKU 1 /06C) y el Programa de Investigación del cáncer genético Michael Kadoorie de la Fundación de Caridad Kadoorie. I.O.L. Ng es Loke Yew Profesor de Patología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la pequeña, monomérica G-proteína Rho se ha definido clásicamente como un regulador biológico clave del citoesqueleto de actina [1] - [3]. A su vez, la rotación del citoesqueleto dinámico controla una amplia gama de respuestas biológicas relacionadas, que van desde la definición de la forma de la célula a la promoción de la migración celular, la adhesión celular y la propagación de células [4], [5]. Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia sugiere que la Rho también está involucrado en el control de importantes funciones biológicas tales como la proliferación celular, la invasión celular y la transcripción de genes [6] - [11]. Rho está implicada en la carcinogénesis, como se ha encontrado para ser activado en diversos cánceres humanos [12], [13].
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1)
es un gen supresor de tumores localizado en el cromosoma 8p21.3-22 y se ha demostrado ser con frecuencia no expresada en una amplia variedad de cánceres humanos, incluyendo el carcinoma hepatocelular (HCC) [14] - [23].
DLC1
codifica una proteína RhoGAP de varios dominios con actividad selectiva hacia RhoA, B y C y menos hacia CDC42 pero no Rac1 [23], [24]. Extensos estudios han demostrado que DLC1 utiliza esta actividad RhoGAP para suprimir la proliferación celular [15] [18], [23], [25], - [29], activar la apoptosis [25] y para reducir la migración de células [26], [28 ], la invasión celular y la metástasis del cáncer resultante en líneas de células, así como los modelos de ratón con diferentes orígenes de tejido [29] - [31]. En un estudio reciente, el papel de DLC1 como un
de buena fe
supresor de tumores en el CHC fue confirmado por un modelo de ratón con un corto horquilla de ARN mediada DLC1 específico de hígado de derribo [32]. Aunque el papel de DLC1 en la protección de las células de las propiedades relacionadas con el cáncer ha quedado claro, las preguntas sobre su regulación biológica siguen sin respuesta.
Transcriptionally,
DLC1
expresión se ha encontrado para ser silenciado epigenético en varios cánceres humanos. La hipermetilación de la región promotora del gen suprimido
DLC1
la transcripción de genes y la expresión en diferentes tejidos [16], [17], [19], [22], [24], [33] - [35]. Después de la traducción, DLC1 rata se ha demostrado ser fosforilados por Akt quinasa [36]; Sin embargo, su presencia en DLC1 humana y su importancia biológica están todavía en cuestión. Por otro lado, un estudio reciente identificó mutaciones DLC1 en los cánceres de próstata y de mama en particular los residuos de tirosina y serina. Estas mutaciones inactivan la actividad DLC1 RhoGAP a través de un mecanismo desconocido [37]. Hasta la fecha, el mejor caracterizado de regulación DLC1 a nivel de proteínas es su interacción con las proteínas tensina [27], [28], [38]. Tensins son proteínas de adhesión focal que llevan Src homología 2 (SH2) y fosfotirosina (PTB dominios) en su extremo C-terminal [39] de unión. La evidencia acumulada sugiere que DLC1 interactúa con múltiples tensins. En general, DLC1 utiliza un motivo de unión a SH2 que implica la Y442 residuo de interactuar con el dominio SH2 de tensin1 y C-terminal tensina-como (cten). Mutación en Y442 causó DLC1 a perder su actividad de localización adhesión y supresor tumoral focal. Esta observación implica que tensinas de unión es un evento clave en la regulación de la localización subcelular y la función de supresión tumoral de DLC1 [27], [28]. Sin embargo, las interacciones entre DLC1 y el PTB tensin2 de dominio [38] hemos documentado anteriormente. Por lo tanto, el mecanismo de interacción entre DLC1 y varios tensins y sus implicaciones biológicas son todavía controvertida.
En el presente estudio, hemos descubierto un mecanismo entre DLC1 y tensin2 unión novedosa mediante la identificación de un sitio de unión indocumentado en DLC1, otra que el motivo de unión a SH2 descrito por otros, para la interacción con el tensin2 dominio PTB. Este nuevo sitio se conserva bien en las familias de DLC. También proporcionamos la primera evidencia de la interacción tensin2 como una característica común de DLC1 y DLC2. Aparte del mecanismo de unión, también hemos demostrado la importancia funcional de este nuevo sitio de unión en la regulación de la actividad supresora de tumores de DLC1.
Resultados
Se requirió que el dominio PTB tensin2 para la interacción DLC1
Hemos demostrado que el C-terminal tensin2 fragmento, incluyendo los dominios SH2 y PTB (SH2-PTB en la Fig. 1B), fue suficiente para unir DLC1 (Fig. 1A). Para evaluar la importancia de los dominios individuales en la interacción DLC1, hemos preparado varios mutantes de deleción tensin2 incluyendo tensin2 ΔSH2ΔPTB, ΔSH2, y ΔPTB y probamos su afinidad de unión hacia DLC1 (fig. 1B). Tensin2 ΔSH2ΔPTB mostró consistentemente una pérdida completa de la unión DLC1. En contraste con otros informes, se encontró que la eliminación del dominio SH2 en tensin2 reduce sólo parcialmente DLC1 vinculante. Curiosamente, la eliminación del dominio PTB en tensin2 fue suficiente para abolir completamente la interacción DLC1, lo que indica que se requiere el dominio PTB para la unión (Fig. 1C). Se ha informado de que DLC1 Y442 y S440 forman un motivo de unión fosfo-independiente para el dominio SH2 de tensin1 y cten [27], [28]. A continuación comprobamos la conservación de estos residuos en la unión al dominio SH2 tensin2. Curiosamente, encontramos que DLC1 Y442F y mutantes S440A mostró sólo una reducción parcial de tensin2 vinculante. Para probar si Y442 y S440 median en la interacción con el dominio SH2 tensin2, hemos comprobado la afinidad de unión entre DLC1 y tensin2 R1165A, un mutante del dominio SH2 con reconocimiento deterioro y la unión de los objetivos de tirosina fosforilada. Se encontró que la mutación en R1165A en tensin2 dio lugar a una caída en tensin2-DLC1 vinculante. Se observó una afinidad de unión similar hacia R1165A entre DLC1 de tipo salvaje, Y442F y S440A. Esto indicó que Y442 y S440 sólo podían ser eficaces cuando el dominio SH2 de tensin2 estaba intacto (Fig. 1D). En conjunto, estos resultados apoyan la conclusión de que un mecanismo de dominio SH2 mediada también contribuye a las interacciones DLC1-tensin2.
(A) Expresión del fragmento SH2-PTB tensin2 (como se describe en Materiales y Métodos y se indica en la figura. 1B) fue suficiente para la interacción con DLC1. HEK293T células fueron transfectadas con el fragmento marcado tensin2-Myc y construcciones DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2. DLC1 en los precipitados se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG. (B) Diagrama esquemático que muestra la estructura del dominio de la tensin2 Myc-etiquetados y sus mutantes truncados C-terminal. Los mutantes o bien tenían ambos dominios SH2 y PTB (ΔSH2ΔPTB) o tenían dominios individuales se está limpiando (ΔSH2 y ΔPTB). El SH2-PTB fue el tensin2 C-terminal utilizada en la fig. 1A. (C) Mapeo del sitio de unión DLC1 en tensin2. HEK293T células fueron transfectadas con etiqueta myc tensin2 y construcciones DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2. DLC1 en los precipitados se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG. La eliminación del dominio SH2 tensin2 (ΔSH2) dio como resultado la reducción parcial de la unión DLC1. La unión se observó la pérdida completa de DLC1 a la eliminación del dominio tensin2 PTB (ΔPTB). La intensidad de las bandas en cada carril se midió en los paneles de PI y Co-PI y las lecturas se normalizaron con el carril 2. También se incluyeron las proporciones relativas Co-IP a IP. (D) Caracterización de la unión entre tensin2 y adhesión mutantes defectivos DLC1 localización focales. De tipo salvaje o mutante tensin2 dominio SH2, R1165A, fue co-transfectadas con DLC1 de tipo salvaje, Y442F y S440A. El lisado celular se sometió a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-Myc, seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG. Y442F y S440A mostraron una reducción parcial de tensin2 vinculante, pero el mutante dominio SH2, R1165A, no.
Identificación de la tensin2 dominio de unión PTB en DLC1
A continuación comentamos los cuales se requiere región de DLC1 para esta interacción tensin2 depende del dominio PTB. Nos habíamos propuesto con anterioridad la región central 375-509 de DLC1 ser la región necesaria para la interacción tensin2 [38]. Para examinar precisamente esta región de unión propuesto, hemos clonado y expresado diversos mutantes DLC1 con diferentes truncamientos creados dentro de esta región (Fig. 2A). Se encontró que el N-terminales de DLC1 1-400 y 1-440, tanto carece del sitio informado tensina SH2 de unión (Y442 de DLC1), fueron suficientes para interactuar con tensin2. Por otro lado, la mutuamente excluyentes fragmento C-terminal de 400 termina con un sitio de unión SH2 intacto no era suficiente para interactuar con tensin2 (Fig. 2B). Se observó un resultado similar cuando 450-stop, que no contiene ningún sitios de unión tensina predicho, fue utilizado (Fig. 2B). Para proporcionar una evidencia más de que el N-terminal de DLC1 interactuó con tensin2 través de un mecanismo de dominio dependiente del PTB, se comprobó la interacción entre DLC1 1-400 y los mutantes de deleción tensin2 antes mencionados. Hemos observado que la interacción entre DLC1 1-400 y tensin2 no se vio afectada, incluso cuando se eliminó el dominio SH2 de tensin2. Por el contrario, la interacción entre los dos se abolió de nuevo cuando se eliminó el dominio PTB de tensin2, lo que indica que esta unión era solamente dependiente de dominio PTB (Fig. 2C). Para determinar aún más el sitio de unión al PTB en DLC1, se analizó la unión de un conjunto de DLC1 fragmentos N-terminal a tensin2. Entre estos fragmentos, se encontró que DLC1 1-385 fue el fragmento más corto que era capaz de unirse tensin2 (Fig. 2D). En conjunto, estos resultados sugieren que la región DLC1 375-385 funciona como un tensin2 PTB sitio de unión y es necesario para tensin2 de unión.
(A) La N-terminal de DLC1 fue suficiente para la interacción con tensin2. HEK293T células fueron transfectadas con el fragmento marcado tensin2-Myc y construcciones DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2. DLC1 en los precipitados se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG. (B) El C-terminal de DLC1 era incapaz de unirse tensin2. Myc-tagged tensin2 se co-transfectó con dos DLC1 fragmentos C-terminal marcado con FLAG como se indica. Estos fragmentos DLC1 C-terminal no podían ser co-immunoprecipitated con tensin2. (C) N-terminal fragmento 1-400 estuvo implicado en la unión tensin2 PTB. La bandera de etiquetado DLC1 1-400 podría ser co-inmunoprecipitó con tensin2. La eliminación del dominio SH2 tensin2 no afectó a la afinidad de unión a 1-400, pero un dominio PTB intacta era necesaria para la unión. (D) El mapeo fino el sitio de unión PTB en DLC1. Myc-etiquetados tensin2 fue co-transfectadas con un panel de DLC1 fragmentos N-terminal marcado con FLAG. fragmentos de la bandera de etiquetado en los precipitados fueron detectados por análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-FLAG. Fragmento 1-385 fue el fragmento más corto capaz de ser co-inmunoprecipitado con tensin2. La intensidad de las bandas en cada carril se midió en los paneles de PI y Co-PI y las lecturas se normalizaron con el carril 2. Las relaciones relativas Co-IP-a-IP también fueron incluidos.
Conservación de tensin2 PTB dominio de unión en DLC2
Para comprobar la conservación biológica de las regiones de unión de otros miembros de la familia DLC tensin2 asignada, se realizó un alineamiento de aminoácidos entre DLC1 y DLC2 [40], [41]. Se encontró que tanto los sitios de unión de SH2 y PTB están bien conservados en DLC2. Correspondiente serina (S457) y tirosina (Y459) residuos en el dominio de unión a SH2 se encontraron en DLC2. Se encontró que el sitio de unión de PTB en DLC1 375-385 para que coincida con DLC2 400-410, lo que sugiere un papel potencial de esta región en la mediación de PTB dominio dependiente de la unión entre miembros de la familia de DLC y tensin2 (Fig. 3A). Sobre la base de la conservación de los sitios de unión en tensina DLC2, la hipótesis de que podría interactuar con DLC2 tensin2. El uso de co-inmunoprecipitación, hemos demostrado que DLC2α y tensin2 interactúan, lo que confirma nuestra especulación. Al igual que con DLC1, no se requiere la actividad de RhoGAP DLC2 para tensin2 interacción, como se muestra por la interacción positiva del mutante DLC2 RhoGAP, R740E, con tensin2 (Fig. 3B). Se analizó si DLC2 también localiza en las adhesiones focales en células SMMC-7721. Hemos encontrado que la expresión de DLC2γ indujo contracción celular grave. Para facilitar la observación, en vez utilizó un mutante funcionalmente inactivo, DLC2γ R622E, que albergaba una mutación en su dominio RhoGAP [41]. Se encontró que DLC2γ R622E podría co-localizar con vinculina (Fig. 3C), lo que indica que otras proteínas DLC también pueden localizar a las adhesiones focales.
(A) que muestra esquemática el SH2 tensin2 y PTB sitios en DLC1 unión. Dentro de la región de unión 375-509 tensin2 mínimo, elementos separados están implicados en la mediación de tensin2 unión a través de mecanismos de PTB o SH2. Estos elementos están bien conservados en el paralog DLC1, DLC2. Se subrayaron los residuos conservados. (B) La interacción entre DLC2 y tensin2 de manera RhoGAP-independiente. HEK293T células fueron transfectadas con etiqueta myc tensin2 y construcciones DLC2 GFP-etiquetados como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2. DLC2 en los precipitados se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-GFP. (C) GFP-DLC2γ mostró la localización de adhesión focal de una manera RhoGA-independiente. La expresión de GFP-DLC2γ indujo contracción celular severa cuando se expresa en células SMMC-7721. Se detectó la localización focal adhesión de la DLC2γ RhoGAP mutante R622E. El vinculina endógeno se visualizó por el anticuerpo anti-vinculina. Barra de escala = 10 micras.
mutante DLC1ΔPTB mostró pérdida específica de unión tensin2 pero conservó su adhesión focal de localización
Para estudiar el papel de la tensin2 PTB dominio de unión de DLC1, hemos clonado tres mutantes DLC1 separados que tenían alteraciones mínimas para los siguientes elementos estructurales: Δ375-390 (ΔPTB#1), Δ375-385 (ΔPTB#2) y Δ380-390 (ΔPTB#3), cada uno con una deleción interna específica dentro del PTB dominio (DLC1ΔPTB) (Fig. 4A). Para confirmar el papel del dominio PTB en tensin2 de unión, primero a prueba la unión de estos mutantes con tensin2. Con un ensayo de co-inmunoprecipitación, se encontró que todos los mutantes DLC1ΔPTB mostraron una pérdida de tensin2 de unión (Fig. 4B). La pérdida de unión se confirmó además por una disminución de co-localización entre DLC1ΔPTB#1 y tensin2 (Fig. 4C). Para abordar la especificidad de la motivo de unión PTB mapeada hacia otras proteínas tensina, se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando un fragmento C-terminal de tensin1, 648-stop. Tensin1 648-stop cubre los SH2 y PTB dominios C-terminal, que se ha demostrado que es importante en DLC1 de unión [28]. Hemos confirmado su papel en la interacción DLC1 con nuestro sistema de co-inmunoprecipitación (Fig. S1). Curiosamente, encontramos que tensin1 648-parada mostró afinidad de unión comparables con DLC1 de tipo salvaje y DLC1ΔPTB (Fig. 4D). Una interacción positiva con DLC1 también se observó cuando cten se inmunoprecipitó en el ensayo de co-inmunoprecipitación (Fig. 4E). Estas observaciones apoyan la participación específica de este motivo de unión a PTB con tensin2. Para determinar si la eliminación del dominio PTB afectaría a la localización de la adhesión focal de DLC1, se estudió la localización de la DLC1ΔPTB en SMMC-7721 células de HCC con inmunofluorescencia. Se encontró que los mutantes DLC1ΔPTB mantuvieron su localización de adhesión focal, como se indica por su co-localización con la vinculina proteína asociada a la focal-adherencia. Esta observación sugirió que la eliminación del sitio de unión PTB en DLC1 afecta a su unión con tensin2 pero conserva su localización de adhesión focal, posiblemente a través de la interacción con otros tensins través de un mecanismo de unión PTB-independiente (Fig. 4F)
.
( A) Esquema que muestra la estructura de tres mutantes DLC1ΔPTB bandera de etiquetado: Δ375-390, Δ375-385 y Δ380-390 (ΔPTB#1-3). (B) demostraron una reducción de DLC1ΔPTB tensin2 vinculante. HEK293T células fueron transfectadas con etiqueta myc tensin2 y construcciones DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2. DLC1 en los precipitados se detectó mediante análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-FLAG. La eliminación del dominio de unión a PTB en DLC1 resultado la pérdida de tensin2 unión. (C) DLC1ΔPTB mostró reducción de co-localización con tensin2. células SMMC-7721 fueron transitoriamente co-transfectadas con el vector de GFP o GFP-tensin2 y la DLC1 etiquetado-Myc se indica. DLC1 se visualizó mediante el uso de anticuerpo anti-Myc, seguido de anticuerpo secundario de Texas Red conjugado. Barra de escala = 10 micras. (D) DLC1ΔPTB podría interactuar con tensin1. células HEK293T fueron transfectadas con Myc-etiquetados tensin2 SH2-PTB (como se indica en la Fig. 1B) o Myc-tagged tensin1 C-terminal 648-parada (como se indica en la Fig. S1) y constructos DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2 o tensin1. DLC1 en los precipitados se detectó mediante análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-FLAG. La eliminación del dominio de unión a PTB en DLC1 no afectó la unión tensin1. (E) DLC1ΔPTB podría interactuar con cten. HEK293T células fueron transfectadas con tensin2 etiquetado-Myc Myc-etiquetados o cten y construcciones DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. lisados celulares aclarados se incubaron con anticuerpo anti-Myc para inmunoprecipitar tensin2 o cten. DLC1 en los precipitados se detectó mediante análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-FLAG. La eliminación del dominio de unión a PTB en DLC1 no afectó la unión cten. (F) DLC1ΔPTB mostró la localización de adhesión focal en las células SMMC-7721. células SMMC-7721 fueron transitoriamente co-transfectadas con GFP-tensin2 y la DLC1 bandera de etiquetado tal como se indica. DLC1 se visualizó mediante el uso de anticuerpo anti-DLC1, seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. El vinculina endógeno se visualizó por el anticuerpo anti-vinculina, seguido de Tejas anticuerpo Red-conjugado. Barra de escala = 10 micras.
DLC1ΔPTB mostró una reducción parcial de la actividad RhoGAP pero fue suficiente para suprimir la formación de fibras de estrés de actina
Activo RhoA es mejor conocido por su papel en la simulación de fibras de estrés de actina formación. Al ser un regulador negativo de RhoA, DLC1 suprime la formación de fibras de estrés de actina de una manera dependiente de RhoGAP [26]. El uso de fibras de estrés de actina como resultado una lectura indirecta biológica, nos preguntamos si la actividad de mutantes RhoGAP DLC1ΔPTB se vería afectada. Se encontró que las células mutantes transfectadas DLC1ΔPTB demostraron una reducción de la formación de fibras de estrés de actina, en comparación con las células no transfectadas vecinas. Esta observación fue similar a las de los mutantes de localización defectuosa de adhesión focal de DLC1, Y442F y S440A, cada uno de los cuales lleva una mutación puntual en el dominio de unión a SH2 tensina (Fig. 5A). Para cuantificar directamente la inactivación de RhoA, se realizó un ensayo de pull-down Rhotekin para determinar los niveles de actividad de Rho-GTP en células que expresan diferentes mutantes DLC1. Aunque se encontró que el mutante DLC1ΔPTB podría suprimir la actividad de Rho-GTP, que era interesante que esta supresión era menos eficaz en comparación con la de tipo salvaje DLC1 (Fig. 5B). Por otro lado, se observa que los mutantes Y442F y S440A también mostraron una reducción en la supresión de los niveles de actividad de Rho-GTP. En conjunto, se encontró que el mutante DLC1ΔPTB mostró una reducción parcial en la actividad intrínseca RhoGAP, pero que esta actividad era suficiente para suprimir la formación de fibras de estrés de actina.
células (A) SMMC-7721 HCC fueron transfectadas con el Myc indicado construcciones DLC1-etiquetados y las fibras de estrés de actina se tiñeron con faloidina conjugada con TRITC 1 hora después de la inducción de suero. El asterisco (*) marca las células DLC1 transfectadas. DLC1 Y442F, S440A, ΔPTB#1 y#2 podría suprimir la formación de fibras de estrés de actina tan eficientemente como DLC1 WT. Barra de escala = 10 micras. (B) las células HEK293T fueron transfectadas con el plásmido indicado DLC1 bandera de etiquetado durante 24 horas. Después de la transfección, las células se privaron de suero durante 24 horas y se estimularon con 5 M de ácido lisofosfatídico durante 30 minutos. a continuación, se recogió el lisado de la célula y se somete a GST-RBD desplegable para RhoA-GTP. Las muestras desplegables se sometieron a análisis SDS-PAGE y immunodetected con anticuerpos anti-RhoA. La intensidad de la banda de la RhoA activa en cada carril se midió y las lecturas se normalizaron a las células transfectadas con el vector. El DLC1, tubulina y RhoA en el lisado celular total se immunodetected con anti-FLAG, anti-tubulina y anticuerpos anti-RhoA, respectivamente. las células (C) HeLa fueron transfectadas con las construcciones de DLC1 indicados y se seleccionaron con G418 durante 2 semanas. Las colonias formadas se visualizaron por tinción con cristal violeta. Se encontró que la diferencia media en la eficiencia de formación de colonias entre los grupos para ser estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 0,001; unidireccional ANOVA).
DLC1ΔPTB demostraron una reducción de la actividad de supresión del crecimiento
La capacidad de DLC1 para suprimir el crecimiento del tumor ha sido bien documentado. Se analizó si los mutantes DLC1ΔPTB antes mencionados muestran ninguna diferencia en la supresión del crecimiento inducida por DLC1. En un ensayo de formación de colonias de células HeLa, de tipo salvaje DLC1 suprimió significativamente la formación de colonias en comparación con el control de vectores. En contraste, la expresión ectópica de mutantes DLC1ΔPTB resultó en un aumento significativo del número de colonias en comparación con el tipo salvaje DLC1 (Fig. 5C). Esta observación indica que incluso cuando DLC1ΔPTB muestra adecuada de localización de adhesión focal, pérdida de este tensin2 PTB motivo de unión dará lugar a la supresión del crecimiento reducida, probablemente debido a la reducción parcial de la actividad RhoGAP. Es probable que tensin2 adecuada PTB contribuye a la supresión del crecimiento inducida por DLC1 unión.
Discusión
DLC1 se ha demostrado que ejercen funciones biológicas similares a las de los genes supresores de tumores clásicos. Los diversos efectos de tumor supresor de DLC1 son fuertemente dependientes de la presencia de un dominio funcional RhoGAP [26], [28]. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la actividad RhoGAP por sí sola no es suficiente para su función supresora de tumores [26] - [28], [42]. análisis estructural previo de nuestro grupo proporcionó la primera evidencia de que estas funciones de DLC1 podría ser restaurado sólo cuando se incluyó [26], la región entre los dominios SAM y RhoGAP. La identificación de tensin2 como la primera proteína de unión que interactúa con esta región funcionalmente importante dado a entender más a fondo en la relación entre la interacción y la función tensin2 DLC1 [38]. Esta idea fue apoyada además por el descubrimiento de cten y tensin1 como socios de DLC1 en estudios posteriores de unión, lo que implica que es biológicamente importante para tensinas proteínas de la familia a trabajar en cooperación con DLC1 [27], [28].
Hemos propuesto anteriormente que DLC1 375-509 es la región de unión mínimo de tensin2. Esta región abarca los residuos clave Y442 y S440, que fueron sugeridos por otros estudios para constituir un sitio de unión SH2 para cten y tensin1 [27], [28]. Sin embargo, no hemos podido proporcionar evidencia directa de que el dominio SH2 tensin2 era suficiente para DLC1 vinculante [38]. En este estudio, y nuestro informe anterior, nuestros resultados mostraron consistentemente que tensin2 que PTB, en lugar de SH2, el dominio interactuaron directamente con DLC1.
Hay algunas posibles explicaciones para los resultados discrepantes. En primer lugar, aunque los dominios SH2 y PTB en proteínas tensina tienen una alta homología de secuencia, las diferencias en sus secuencias pueden dar lugar a diferentes mecanismos de unión para DLC1 y otros miembros de la familia tensina. En segundo lugar, diferentes ensayos de unión fueron utilizados por diferentes grupos para estudiar el mecanismo de la unión entre tensina y DLC1. Por ejemplo, la levadura-basan pull-down ensayos de unión y GST fueron utilizados por Liao et al. y Qian et al., respectivamente, mientras que
in vivo
co-inmunoprecipitación se empleó en nuestro presente estudio. En tercer lugar, se utilizaron fragmentos C-terminal de tensina que contenían ya sea uno o ambos de los dominios SH2 y PTB en la cartografía de sitio de unión DLC1 en los estudios de Liao et al. y Qian et al. Este diseño experimental presume que la región N-terminal de la proteína tensina no estuvo involucrado en la unión ni contribuyó al plegamiento de la proteína normal de la región C-terminal.
En el presente estudio, nos proporcionan la primera evidencia de que la eliminación específica de los dominios SH2 y PTB en tensin2 afecta a la unión en diferentes grados (Fig. 1C) DLC1. Para demostrar que el dominio PTB juega un papel crítico en la unión DLC1-tensin2, estudiamos el dominio PTB-unión en el extremo N-terminal de DLC1 (Fig. 2) y confirmó su papel mediante la caracterización de los mutantes de deleción internas DLC1ΔPTB (fig. 4A). Se identificaron una región de 375 a 385 indocumentados DLC1 como el sitio PTB-dominio de unión y la interacción DLC1-tensin2 se perdió cuando esta región fue removido (Fig. 4B). Está bien establecido que el dominio PTB reconoce un motivo NPXY, como se ilustra en su unión con la integrina β [43]. Sin embargo, este motivo no se ha encontrado en nuestra región asignada en DLC1, dando a entender que el modo de interacción mediada por el PTB es un probablemente atípica. Aunque DLC1ΔPTB mostró pérdida de unión tensin2, todavía era capaz de localizar a las adhesiones focales (Figs. 4C y 4F). Además, se encontró que el dominio PTB era necesario para la localización de adhesión focal de tensin2 (datos no mostrados). Por lo tanto, además de actuar como el sitio de unión física para DLC1, el dominio PTB puede también ser importante para llevar tensin2 en las proximidades de DLC1 en adhesiones focales y facilitar su interacción. En conjunto, estos resultados sugieren que DLC1 utiliza región de 375 a 385 en la mediación de tensin2 de unión, mientras que utiliza residuos Y442 y S440 de adhesión focal de orientación (Fig. 6).
DLC1 fue dirigida a las adhesiones focales y requiere residuos Y442 y S440. En la adhesión focal, además del mecanismo de unión de SH2, DLC1 Región utilizada 375-385 de interactuar con el dominio PTB de tensin2, como se indica por la línea de puntos. La formación de este complejo de unión era importante para DLC1 para ejercer la función de supresión del crecimiento.
Aún no se sabe si la propuesta tensina dominio de unión PTB en DLC1 está implicado en la unión con otros tensins. Esto queda por investigar. Ha habido informes de que la expresión del tensin1 dominio PTB es suficiente para la interacción con DLC1. Además, la eliminación de adorno (440 a 448) de unión a todo el SH2 tensina, en lugar de la introducción de una mutación puntual en Y442F DLC1, es suficiente para la interacción con tensin1 [28]. Esto indica que el PTB unión dependiente puede estar presente entre DLC1 y tensin1, pero juega un papel sutil, a diferencia de la DLC1 y tensin2 interacción. En base a los hallazgos presentes, llegamos a la conclusión de que el mecanismo de unión PTB es tensin2-específica (Fig. 4B, 4D y 4E), mientras que otros utilizan un mecanismo de tensins SH2 vinculante [27], [28]. Posible compensación por otros tensins puede explicar por qué DLC1ΔPTB puede estar localizada en adhesiones focales en ausencia de interacciones tensin2. Además, se encontró que DLC1ΔPTB mostró una reducción parcial de la actividad RhoGAP, lo que resultó en una reducción parcial de la supresión del crecimiento (Fig. 5B y 5C).
Una limitación de nuestro estudio es el uso de ectópica expresó tensin2. La detección de tensin2 endógeno no fue posible, como el anticuerpo tensin2 no estaba disponible en nuestro laboratorio. La interacción entre DLC1 endógeno y tensin2 debe examinarse para reflejar su unión en el contexto biológico real. Por otro lado, se realizó un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real preliminar para determinar los niveles de expresión de ARNm de DLC1 y tensin2 en los tejidos HCC humanos. Nuestros datos no publicados demostraron que la subexpresión de ambos DLC1 y tensin2 se correlacionó con la supervivencia global más corto en comparación con los que tenían expresión normal de uno o ambos genes, el apoyo a la posible asociación funcional de DLC1-tensin2 con hepatocarcinogénesis.
En conjunto , hemos identificado un nuevo sitio de unión tensin2 PTB en DLC1 y demostró su implicación en interacciones tensin2. Aunque la eliminación del sitio de unión PTB no afectó a la localización de adhesión focal, redujo parcialmente la actividad de RhoGAP DLC1, que atenúa su función supresora del crecimiento.