Extracto
DLC2 (suprimido en el cáncer de hígado 2), una proteína Rho GTPasa de la activación, se había demostrado que se underexpressed en el carcinoma hepatocelular humano y tiene funciones supresores de tumores en modelos de cultivo celular. Hemos generado ratones deficientes en DLC2 para investigar el papel supresor de tumor de DLC2 en hepatocarcinogenesis y la función de DLC2 in vivo. En este estudio, se encontró que, a diferencia de DLC1 homóloga, que es esencial para el desarrollo embrionario, DLC2 era prescindible para el desarrollo embrionario y los ratones deficientes en DLC2 podría sobrevivir hasta la edad adulta. Tampoco se observa una mayor incidencia de la formación de tumores del hígado o diethylnitrosamine (DEN) hepatocarcinogénesis inducida en ratones deficientes en DLC2. Sin embargo, se observó que los ratones deficientes en DLC2 eran más pequeños y tenían menos tejido adiposo de los ratones de tipo salvaje. Estos fenotipos no eran debido a la reducción de tamaño de las células o defecto en la adipogénesis, como se observa en el modelo de ratón 190B RhoGAP deficientes. En conjunto, estos resultados sugieren que la deficiencia en DLC2 sola no mejora hepatocarcinogénesis
Visto:. Yau A, Leung THY, Lam S, Cheung DE, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Suprimido en cáncer de hígado 2 (DLC2) es prescindible para el Desarrollo y su deficiencia Did no agrava HEPATOCARCINOGENESIS. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10.1371 /journal.pone.0006566
Editor: Alfred Lewin, Universidad de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2009; Aceptado: 10 de julio de 2009; Publicado: 10 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Yau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por becas de investigación Fondo de Hong Kong Consejo general de Investigación (HKU 7436 /04M) y el Fondo de Investigación Cooperativa RGC (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng es Loke Yew Profesor de Patología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es un tumor maligno primario y es uno de los cánceres más comunes en Asia y África. La infección con hepatitis B o infección por el virus C y la exposición a la aflatoxina B1 han sido bien documentadas como las principales causas. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes que conducen al desarrollo y la progresión de HCC siguen sin estar claros.
La inactivación de genes supresores de tumores es una característica de las células cancerosas. En la búsqueda de los supresores de tumores implicados en hepatocarcinogénesis, hemos identificado un nuevo gen
DLC2
(suprimido en el cáncer de hígado 2) en la región cromosómica 13q12.3, que a menudo se pierde en los HCC [1]. Similar a su homólogo DLC1, DLC2 se underexpressed en los HCC humano y tiene funciones supresoras tumorales en células cultivadas [1], [2].
DLC1 y DLC2 son Rho GTPasa de la activación de las proteínas (BPA). Tienen tres dominios funcionales, un dominio catalítico RhoGAP [1], [3], un motivo estéril alfa (SAM) de dominio de interacción de proteínas [4], [5] y un (START) de dominio de transferencia de lípidos relacionados estrellas de lípidos vinculante [6], [7]. Las GTPasas de la familia Rho tienen 18 miembros, entre ellos los tres representantes bien estudiados, Rac1, RhoA y Cdc42. Estas pequeñas GTPasas regulan diversas vías de señalización celular [8], [9]. Se ha sugerido que las proteínas Rho juegan un papel importante en la transformación oncogénica mediada por Ras y otras oncoproteínas mediante el control de la organización del citoesqueleto de actina, la proliferación celular y la supervivencia celular [10], [11]. Además, estimulan la invasión celular tumoral y la metástasis [9]. Rho GTPasa de la activación de las proteínas (BPA) desactivarlos mediante la conversión del estado unido a GTP activo al PIB determinada uno a través de la activación de la actividad GTPasa intrínseca de las proteínas Rho inactivo. Por lo tanto, las BPA se han sugerido para ser supresores de tumores que contrarrestan el potencial oncogénico de las proteínas Rho.
Ha habido varias líneas de evidencia in vitro para apoyar la función supresora de tumores de estas dos proteínas Rho GAP, DLC1 y DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Los modelos animales que puedan ser aprovechados para investigar las funciones supresoras de tumores de estas dos proteínas son todavía limitados. Durkin et al. [17] ha generado un modelo de ratón deficiente en DLC1 para estudiar las funciones biológicas de DLC1. Sin embargo, la deficiencia DLC1 conduce a la letalidad embrionaria por mitad de la gestación. Sordella et al [18] mostró que los embriones que carecen de p190B RhoGAP fueron aproximadamente 30% más pequeño en tamaño y proporcionan pruebas que sugieren que esta reducción en el tamaño del embrión era debido a la reducción en el tamaño celular. También demostraron que los fibroblastos embrionarios murinos derivados de estos embriones eran defectuosas en la adipogénesis en comparación con el tipo silvestre homóloga [19].
En este estudio, hemos generado ratones deficientes en DLC2 para investigar las funciones biológicas de DLC2 y su papel en hepatocarcinogenesis in vivo. A diferencia del modelo nocaut DLC1, DLC2 era prescindible para el desarrollo embrionario y los ratones deficientes en DLC2 podría sobrevivir hasta la edad adulta. los ratones deficientes en DLC2 no mostraron mayor incidencia de hepatocarcinogénesis o diethylnitrosamine (DEN) hepatocarcinogénesis inducida. Sin embargo, los ratones deficientes en DLC2 fueron significativamente más pequeños y tenían menos tejido adiposo de los ratones de tipo salvaje. Análisis de la adipogénesis de DLC2 deficientes y de tipo salvaje fibroblastos embrionarios murinos no mostró diferencias significativas entre ellos. Además, no se observó ninguna diferencia significativa en el tamaño de la celda entre el tipo inmortalizado fibroblastos fase G1 DLC2 deficientes y salvajes con citometría de flujo.
Materiales y Métodos
Generación de ratones deficientes en DLC2
Un clon PAC que contiene el ratón
región DLC-2
genómico se obtuvo del Centro Sanger (Cambridge, Reino Unido). Para construir el ratón
DLC-2
la orientación de genes vectorial, una 2,8 kb
Eco RI
/
Bam HI
fragmento, que es 3 'al exón 5, se clonó en
Eco RI
/
Bam HI
sitio de pPNT (Figura 1a). Un par de cebadores (adelante, 5'-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc; revertir, 5'-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) se utilizó para amplificar una región genómica, 2,7 kb de tamaño y 5 'al exón 5 (Figura 1a). El fragmento se clonó en pPNT [20]. El vector de orientación se linealizó con
No
I y se sometió a electroporación en el AB2.2 la madre embrionarias (ES) línea celular (129s7 /SvEBrd-b-HPRT m2), y las células se cultivaron en medio de cultivo de células ES suplementado con G418 y fialuridina. Los clones resistentes fueron analizados por Southern Blot (véase más adelante) para identificar
DLC2
-targeted clones.
(a) Diagrama esquemático para mostrar estrategia de selección de genes. Las cajas negras, exones del gen DLC2 ratón (números de exones se escriben en la parte superior); cajas de color gris, secuencia de ADN del gen de resistencia a la neomicina de la construcción de la orientación; caja blanca, secuencia de ADN del gen de la timidina quinasa de la construcción de la orientación. Los sitios de digestión con enzimas de: B, BamHI; Bg, BglII; E, EcoRI; N, NcoI; sólo los sitios de restricción de diagnóstico se muestran por simplicidad. (B) análisis de transferencia Southern. digestión BglII se sondeó con la sonda 5 'como se indica; tamaños de las bandas de diagnóstico: alelo natural, 4,7 kb; alelo específica, de 5,7 kb. digestión NcoI se sondeó con la sonda 3 'como se indica; tamaños de las bandas de diagnóstico: alelo natural, 9,1 kb; alelo específica, de 5,7 kb. (C) determinación del genotipo PCR; tamaños de las bandas: alelo natural, 414 pb; alelo específica, de 339 pb. (D) RT-PCR para detectar la expresión DLC2 en el corazón, el hígado y el músculo esquelético.
Todas las investigaciones con animales de trabajo fue aprobado por el Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATA) de la Universidad de Hong Kong. Las células de estos clones se inyectaron en blastocistos C57BL /6N. Quimeras se aparearon con ratones C57BL /6N, y que contiene
DLC2
alelo -targeted se identificaron descendencia. Los ratones con fondos genéticos mixtos fueron nuevamente cruzado en C57BL /6N durante al menos cinco generaciones.
Southern blot, de genotipado PCR y RT-PCR
Para el análisis de transferencia de Southern, dos sondas, 5 'y 3' externa, se utilizaron (Figura 1a).
digestión Bgl II
se sondeó con la sonda 5 'y los tamaños de las bandas de diagnóstico eran 4,7 kb para el alelo de tipo salvaje y 5,7 kb para el alelo dirigido.
Nc
digestión Oi sondeó con la sonda 3 ', y los tamaños de las bandas de diagnóstico eran 9,1 kb para el alelo de tipo salvaje y 5,7 kb para el alelo dirigido
.
Dos pares de cebadores fueron utilizado para el genotipado por PCR. Para la detección del alelo de tipo salvaje, hacia adelante (5'-AATGGAAGCACCATGTAGCC) y el cebador 5 'AATGGAAGCACCATGTAGCC) inversa se utilizaron, con el tamaño esperado del producto 414 pb PCR. Para la detección del alelo dirigido, hacia adelante (5'-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) e inversa se utilizaron cebadores (5'-GGGGGAACTTCCTGACTAGG), con el tamaño esperado del ser producto de PCR, 339 pb.
Para RT semicuantitativa análisis de PCR, el ARN total fue preparado a partir de tejidos de ratón usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). Primera línea de cDNA se sintetizó a partir 1 g de ARN total usando hexámeros aleatorios con el kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Dos l de cDNA se utilizó luego para detectar los niveles de expresión de
DLC1, DLC2
y
DLC3
usando los siguientes cebadores: Para ratón
DLC1
gen, cebador directo (5 '- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) y el cebador invertido se utilizaron (5'-GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC); Para ratón
se utilizaron DLC2
gen, cebador directo (5'-GATGAGAAACACAGCCAGCA) y el cebador inverso (5'-GTTGGGTATCTGGACGCACT); Para
DLC3
, se utilizaron cebador directo (5'-TCCACAGGCAGCCATGCCAG) y el cebador inversa (5'-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC). condición de la PCR fue el siguiente: desnaturalización a 95 ° C durante 15 min, seguido de 25 ciclos (
DLC1
y
DLC2
) o 27 ciclos (
DLC3
) de desnaturalización durante 30 s, hibridación a 55 ° C durante 30 seg con extensión a 72 ° C durante 30 s y una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 1,2%.
experimento jaula metabólica
Los animales fueron alojados individualmente en jaulas metabólicas en un ciclo de luz-oscuridad 12:12 horas y se alimentaron
ad
libitum. El agua y el consumo de alimentos y la producción de orina y excrementos se midieron durante 2 días.
diethylnitrosamine (DEN) el tratamiento de ratones
El protocolo hepatocarcinogénesis fue el siguiente. El 15 días de edad, de sexo masculino
DLC2
ratones knockout homocigotos y ratones de tipo salvaje fueron inyectados por vía intraperitoneal con 25 mg /kg DEN en PBS estéril. A los 35 semanas de edad, los ratones se sacrificaron y sus hígados se recogieron y se examinaron. Los hígados se fijaron en formaldehído al 4% en PBS, se incluyeron en parafina y se cortan en secciones de 4 micras para el examen histológico.
Preparación de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) y el establecimiento de líneas celulares
Los ratones preñados se sacrificaron a los 13,5 días coito pasado (DPC). Los embriones se diseccionaron del útero, y se eliminaron las membranas y vísceras extra-embrionarias. Los embriones se cortan en trozos pequeños, y se sumergen durante 30 minutos en 4 ml de 0.25% de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. La tripsinización se inactivó con medio de Eagle modificado α-(aMEM) suplementado con FBS inactivado por calor al 10%, 50 U de penicilina por ml, y 50 g de estreptomicina por ml. Las células se suspendieron mediante pipeteo y se pasan a través de un colador. Los procedimientos estándar se utilizaron para establecer líneas celulares de fibroblastos inmortalizados [21]. Brevemente, las células se pasaron cada 3 días en DMEM suplementado con suero de ternera al 10% y antibióticos a una densidad de 10
6 células por placa de 10 cm. Los medios se cambiaron en el día siguiente. Se establecieron líneas celulares inmortalizadas estables después de 30 a 50 pasajes.
La medición de tamaños de celda
Los tamaños relativos de
DLC2
+ /+
y
DLC2
- /- se determinaron
células con citometría de flujo. Brevemente, las células fueron marcadas con BrdU utilizando FITC flujo del juego de BrdU (BD Pharmingen ™, NJ, EE.UU.). G1 población de células fue cerrada y se determinó la dispersión de la luz frontal (FSC) de 5000 G1 células. FSC se utilizó para determinar los tamaños de celda relativas.
La inducción de la diferenciación de los adipocitos
Para la inducción de la diferenciación de los adipocitos, células MEF utilizados se encontraban dentro de dos pasajes. Se realizó la inducción de la diferenciación de adipocitos como se describe anteriormente [19]. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y se propagan a confluencia. Dos días más tarde, el medio se reemplazó con medio de inducción de diferenciación estándar (α-MEM que contiene isobutilmetilxantina 0,5 mM, 1 mM de dexametasona, 5 g de insulina por ml, 10% de FBS, 50 U de penicilina por ml, y 50 g de estreptomicina por ml, y el medio se renueva cada dos días. las células fueron inducidas durante 8 días antes del análisis.
las células fueron fijadas en formol al 10%, se aclararon dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se tiñeron con Oil-Red O solución de tinción (0.5% de aceite O rojo en solución de agua destilada-alcohol isopropílico [60:40]) durante 30 min a 37 ° C y después se lavaron con agua destilada tres veces. adipogénesis en Oil-Red-O- manchada MEF se cuantificó midiendo la absorbancia de la luz a 510 nm después de la extracción con alcohol isopropílico.
Rhotekin ensayo de unión
las células se lisaron en 500 l de tampón de lisis que contenía Tris 50 mM (pH 7,4 ), MgCl2 10 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, 10 mg /ml de aprotinina, 10 g /ml de leupeptina, y PMSF 1 mM. Los lisados se aclararon por centrifugación a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y 500 g de cada lisado se incubó con 45 g de GST-RBD (proteína de fusión GST que contiene el dominio RhoA-unión de Rhotekin) unida a glutatión-Sepharose perlas (Amersham Pharmacia) durante 1 h. Después de la unión, las muestras se lavaron con tampón de lisis por tres veces. Las proteínas unidas se fraccionaron en 12% SDS /PAGE y a inmunotransferencia con el anticuerpo policlonal para RhoA (Santa Cruz Biotechnology). lisado celular total se analizó también con el anticuerpo anti-RhoA como control de carga. El nivel de RhoA activo se determinó después de la normalización con el RhoA total presente en los lisados celulares.
Inmunofluorescencia tinción
Las células se cultivaron en cubreobjetos y se enjuagaron en PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente, permeabilizadas con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 5 minutos y se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino en PBS. Después de lavar con PBS, las células fueron incubadas con anticuerpo paxilina (Sigma), seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC a temperatura ambiente. F-actins se tiñeron con faloidina marcada con isotiocianato de tetrametilrodamina B (Sigma) durante 20 min a temperatura ambiente, y los núcleos se tiñeron por DAPI. Las células fueron montadas con una solución antifade Vectashield (Vector Laboratories).
Resultados
Generación de ratones deficientes en DLC2
Para estudiar la función de la DLC2
in vivo
y el papel de DLC2 en hepatocarcinogénesis, se generaron ratones DLC2-deficent. La interrupción del gen DLC2 ratón se logró mediante la recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES). En la recombinación, el exón 5, el más grande de exón
DLC2
gen, fue sustituido por el gen de resistencia a neomicina del vector de orientación (Figura 1a). Dos ES dirigidos clones se utilizaron para establecer los ratones DLC2 deficientes (Figura 1b y 1c).
DLC2
- /-.
Ratones no expresaban el
DLC2
ARNm detectado por RT-PCR en tejidos seleccionados, el corazón, el hígado y el músculo esquelético (Figura 1d)
ratones deficientes en DLC2 eran anatómicamente normal, pero más pequeños y tenían menos grasa adiposa
a diferencia de la
DLC1
- /- ratones,
fallecidas en fase embrionaria,
DLC2
- /- ratones
podrían sobrevivir hasta la edad adulta. Esto sugiere que DLC2 es prescindible para el desarrollo embrionario. análisis anatómico mostró que
DLC2
- /-
ratones eran normales (a 30 semanas de edad), sin embargo
DLC2
- /-
ratones eran de menor tamaño y más ligero en peso (p = 0,01) (Figura 2a) y tenían menos tejido adiposo que los ratones de tipo salvaje (p = 0,02) (Figura 2b, 2c amp;). Queríamos excluir la posibilidad de que
DLC2
- /- ratones
poder comer menos alimentos de los
DLC2
+ +
ratones /y esto podría contribuir a su menor tamaño corporal. Para ello hemos realizado el experimento jaula metabólica para investigar si había alguna diferencia en el consumo de alimentos y agua. Sin embargo, no hemos podido detectar ninguna diferencia significativa en la ingesta de alimentos y agua entre
DLC2
- /- ratones y
DLC2
+ /+ ratones
(Figura 3)
(a) el peso corporal. (B) Peso de las almohadillas de grasa del epidídimo. En (a) y (b), se muestran los valores medios ± errores estándar y valores de p. P-valores se calcularon mediante la prueba de la t de Student no apareado. (C) Las muestras representativas de las almohadillas de grasa del epidídimo.
(a) La ingesta de alimentos, (b) la ingesta de agua, (c) las heces de salida y (d) la producción de orina en 24 horas. Se muestran los valores medios ± error estándar y valores de p. P-valores se calcularon mediante la prueba de la t de Student para datos independientes.
El agotamiento de DLC2 no afectó el tamaño celular y la adipogénesis en MEFs
Los embriones de ratón p190B RhoGAP deficientes eran más pequeñas de la naturaleza embriones de tipo y fibroblastos derivados de los embriones p190B RhoGAP deficientes eran más pequeñas que las derivadas de los embriones de tipo salvaje [18]. Además, los fibroblastos derivados de los embriones p190B RhoGAP deficientes eran defectuosos en la adipogénesis [19]. Por lo tanto, hemos examinado si los fibroblastos derivados de la
DLC2
- /-.
embriones de ratón fueron más pequeñas en tamaño y defectuoso en la adipogénesis
Como se ha demostrado con la citometría de flujo, el tamaño de las células derivadas del
DLC2
- /- embriones de ratón
no fue significativamente diferente de la de la
DLC2 embriones
+ /+
ratón (Figura 4a y 4b). Desde Sordella et al. [18] mostró la vía AKT fue blanco de abajo RhoA, y esto llevó finalmente al tamaño celular disminuida de fibroblastos derivados de los embriones p190B RhoGAP deficientes, hemos examinado la ruta AKT en las células derivadas de la
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+
embriones de ratón. No se detectó ninguna diferencia entre ellos en esta vía (Figura 4c). Anteriormente puso de manifiesto que era un DLC2 RhoGAP; la sobreexpresión de DLC2 el regulado actividad Rho en líneas celulares de hepatoma y dio como resultado la inhibición de la formación de fibras de estrés de actina [2]. Sin embargo, la regulación de la actividad de Rho en el
DLC2
- /- no se observó
células (Figura 4d) y había alguna diferencia leve pero no significativo en la formación de fibras de estrés de actina o adhesiones focales entre los
DLC2
- Opiniones y
DLC2
+ /+
células (Figura 4E) - /. Estos sugieren que podría haber otras proteínas funcionalmente similares que pudieran compensar la función de DLC2
(a) Comparación de tamaños de DLC2 + /+ (n = 6) y DLC2 -. (N = 6) células /- por citometría de flujo. la dispersión de luz frontal (FSC) de las células-fase G1 según lo determinado por citometría de flujo se utilizó para medir los tamaños de celda relativas. Se muestran los valores medios ± error estándar y valores de p. P-valores se calcularon mediante la prueba de la t de Student no apareado. (B) Las muestras representativas de los resultados de la citometría de flujo. (C) análisis de transferencia de Western de DLC2 tratados con insulina + /+ y DLC2 - células - /. (D) la actividad de RhoA de DLC2 + /+ y DLC2 - /- células como se detecta por el ensayo de unión Rhotekin. (E) citoesqueleto de actina y adhesiones focales en DLC2 + /+ y DLC2 - /-. Células MEF se detectaron mediante tinción de inmunofluorescencia de las fibras de estrés de actina (rojo) y Paxilina (verdes), respectivamente
A continuación, examinado la adipogénesis en los fibroblastos derivados de los
DLC2
- Opiniones y embriones
DLC2
+ /+
ratón - /. Cuando
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+
células fueron inducidas por medio de inducción estándar de la diferenciación de adipocitos, tanto
DLC2
- /
-. y
DLC2
+ /+
células eran competentes para diferenciarse en adipocitos y no difirieron significativamente en la producción de lípidos cuantitativamente (Figura 5)
(a) inducción de la adipogénesis se realizó en DLC2 - /- (n = 6) y DLC2 + /+ (n = 6) MEFs. Después de la inducción, MEFs fueron teñidas con Oil-Red O, y luego se extrajo la mancha y se midió la absorbancia a 510 nm. Se muestran los valores medios ± error estándar y valores de p. P-valores se calcularon mediante la prueba de la t de Student no apareado. (B) Las muestras representativas de los MEF-Rojo Aceite O-manchado.
El agotamiento de DLC2 no predisponen a la formación de tumores en el hígado ni agravar DEN-inducida hepatocarcinogénesis
Nosotros no lo hicimos observar cualquier formación de tumores en el hígado de los adultos
DLC2
- /- ratones
hasta una edad de 18 meses. Para abordar el papel de DLC2 en hepatocarcinogénesis inducido por productos químicos, tratamos a la edad de sexo masculino de 15 días
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+ ratones con
DEN . Cuando los ratones alcanzaron 35 semanas de edad, que fueron disecados y sus hígados fueron examinados para la formación de tumores. Hemos observado que desarrollaron tumores del hígado en todos los ratones tratados con DEN. Además, el número de tumores formados y los diámetros de los tumores máximas fueron similares tanto en el
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+ ratones
(p = 0,79 y 0,51, respectivamente) (Figura 6). Estos hallazgos sugieren que la deficiencia de DLC2 no agrava hepatocarcinogénesis química.
(a) número de tumores formados en el hígado después del tratamiento DEN. (B) Tamaño de tumor tal como se representa por el diámetro máximo (en milímetros). En (a) y (b), se muestran los valores medios ± errores estándar y valores de p. P-valores se calcularon mediante la prueba de la t de Student no apareado. (C) las muestras representativas del hígado tratados con DEN. Las flechas blancas indican tumores. (D) Representante H & amp;. E manchadas secciones de muestras de hígado tratados con DEN
DLC1
y
DLC3
la expresión de ARNm en tejidos DLC2 empobrecido
PCR
semi-cuantitativa se realizó en tejidos seleccionados, incluyendo el hígado, músculos esqueléticos y el corazón de los
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+ ratones a
3 meses de edad para observar cualquier compensación de dosis génica por otros miembros de DLC en nuestros
DLC2
- /- ratones
. Nuestros datos no mostraron aumento significativo de cualquiera DLC1 o DLC3 en esos tejidos del
DLC2
- /- ratones
(Figura S1). Los experimentos se llevaron a cabo de forma independiente por tres veces.
Discusión
Se informó de que los embriones DLC1-deficiente, tienen defectos del tubo neural y morían en mitad de la gestación temprana al [17]. Como se sugiere por Durkin et al. [17], esto también podría ser debido al mal funcionamiento principal de otros órganos tales como el corazón en desarrollo. Nuestro grupo demostró recientemente que DLC1 regulada negativamente la Rho /ROCK [22]. Además, un nivel relativamente alto de expresión ROCA se observó anteriormente en los corazones de los embriones en desarrollo, 7,0-9,0 DPC [23] y 9.5 a 11.5 dpc [24]. Esto sugiere que la deficiencia de DLC1 puede alterar la función normal de las proteínas de rocas en el corazón embrionario y provocar letalidad embrionaria. Sin embargo, los fenotipos observados sugieren que DLC1 tiene un papel fundamental durante el desarrollo temprano murino.
En este estudio, hemos demostrado que la deficiencia de DLC2 no causó defectos de desarrollo observables, y los ratones deficientes en DLC2 podría sobrevivir hasta la edad adulta. Esto sugiere que las funciones de DLC2 en el desarrollo embrionario pueden ser compensados por su homólogo, DLC1, pero no viceversa. Es común que los genes parálogos compensan las funciones de los miembros del grupo. Por ejemplo, los miembros de ratón Hox grupo paralogous 3, Hoxa3, Hoxb3 y Hoxd3, interactúan sinérgicamente para regular el desarrollo embrionario de una manera dependiente de la dosis [25], [26]. Aunque la deficiencia de DLC2 no dio lugar a letalidad embrionaria, los ratones deficientes en DLC2 eran más pequeños y tenían menos tejido adiposo. Desde que se demostró que los fibroblastos derivados de embriones 190B RhoGAP deficientes eran más pequeñas [18] y fueron menos eficaces en la adipogénesis [19], se examinaron los ratones con deficiencia de DLC2 a lo largo de estas líneas. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el tamaño celular y la adipogénesis entre fibroblastos derivados de
DLC2
- /- Opiniones y
DLC2
+ /+ ratones
. Además, el experimento jaula metabólica no detectó ninguna diferencia significativa entre los
DLC2
- Opiniones y
DLC2
+ /+ ratones
- /. En este sentido, no podríamos excluir la posibilidad de que el experimento jaula metabólica podría no ser lo suficientemente sensible para detectar la pequeña diferencia en la cantidad de la ingesta de alimentos que pueden causar que el fenotipo observado en el peso corporal. También no podíamos excluir el hecho de que
DLC2
- /- ratones
podrían ser más activo y se consume más calorías que
DLC2
+ /+ ratones
se demostró que DLC2 localizado en la mitocondria y podría desempeñar un papel en el transporte de lípidos [7]. Además, se ha sugerido que el dominio START que contiene proteína, estrella, es un componente esencial en la producción de la hormona esteroide en la translocación del colesterol de la membrana externa de la membrana interna de la mitocondria en la célula esteroidogénica [27]. Desde DLC2 es un dominio START que contiene proteínas y es capaz de localizar en las mitocondrias, será de interés para el estudio de la función fisiológica de DLC2 en relación con el metabolismo de los lípidos, así como la biosíntesis de hormonas esteroideas.
DLC2 era se muestra que se underexpressed en HCC [1], [2], [28] y tienen funciones supresoras de tumores incluyendo supresión de la proliferación celular, inducida por Ras formación de colonias y el crecimiento independiente de anclaje [1], [2]. Uno de nuestros objetivos principales en la generación de los ratones deficientes en DLC2 fue investigar la función supresora de tumores de DLC2 in vivo. Se encontró que la deficiencia de DLC2 no predisponen a la formación de HCC ni agravar hepatocarcinogenesis DEN-inducida. Una vez más, la función supresora de tumores de la función DLC2 puede ser compensada por DLC1. Dado que los ratones deficientes en DLC1 muere en la etapa embrionaria, sería interesante ver si la deficiencia específico de hepatocitos de DLC1 puede predisponer a estos ratones para el desarrollo de HCC y para delinear el papel de la deficiencia DLC2 en el desarrollo de CHC en estos ratones. Se demostró que la pérdida de p53 aceleraría hepatocarcinogenesis en ratones transgénicos que sobreexpresan c-myc [29]. Sería informativo para cruzar ratones deficientes en DLC2 con otros ratones knockout de genes supresores de tumores, tales como p53 y /o ratones transgénicos que sobreexpresan oncogenes, tales como c-myc y TGF-alfa [30]. Alternativamente, el sistema recién desarrollado por Zender et al. podría ser explotada para estudiar la función supresora de tumores de DLC2 en hepatocarcinogénesis [31]. En ese sistema, las células progenitoras del hígado deficientes en p53 podrían estar infectados con una combinación de los retrovirus ecotrópicos llevan c-myc, RAS, AKT y DLC2. Esto nos permitirá investigar más a fondo si DLC2 tiene función supresora de tumores in vivo.
DLC2 pertenece a un miembro de la familia de proteínas de DLC. Que codifica un dominio RhoGAP con alta homología de secuencia con miembros de la familia DLC, DLC1 y DLC3. En nuestros estudios anteriores, hemos demostrado que DLC2 o DLC1 fue capaz de inhibir la actividad de RhoA lo que resultó en la regulación negativa de la formación de fibras de estrés de actina. Además, el estudio de Kawai et al indicó que DLC3 también podría inhibir la actividad de RhoA por su dominio RhoGAP. La expresión ectópica de DLC3 en células HeLa se redujo el número de las fibras de estrés de actina [32]. Los resultados sugieren que el papel funcional de DLC1, DLC2 y DLC3 en líneas celulares y sus efectores son bastante similares. En el modelo de ratón, DLC1 agotamiento era embriones letal, mientras que nuestros ratones knockout DLC2 podrían sobrevivir hasta la edad adulta. Esto sugiere que las funciones de DLC2 en el desarrollo embrionario pueden ser compensados por DLC1 o DLC3. Sin embargo, desde nuestro semicuantitativa resultado de RT-PCR, no hubo un aumento significativo de cualquiera DLC1 o DLC3 en los hígados, corazones y los músculos esqueléticos de los ratones knockout DLC2. El resultado implica que el nivel fisiológico de DLC1 o expresión DLC3 puede ser suficiente para la compensación de las funciones DLC2. Será interesante para generar ratones knockout DLC3 para estudiar su importancia en el desarrollo embrionario y examinar si su función puede ser compensada por otros miembros de DLC. Además, los datos de los ratones knockout indican que los miembros de la DLC pueden desempeñar diferentes funciones fisiológicas en el desarrollo. Aparte del efector común (RhoA), podría haber otras dianas moleculares diferentes que se regulan específicamente por un miembro de DLC en particular.
Además de estudiar el papel supresor de tumores de DLC2 en el CHC, los ratones deficientes en mayo DLC2 ser útil para el estudio de otros tipos de cáncer, como regulación a la baja de DLC2 también se observó en el pulmón, ovario, renal, de mama, de útero, estómago, colon y cánceres de recto [33].
información de apoyo
Figura S1.
nivel de expresión de DLC1 y DLC3 en DLC2 - /- y + /+ ratones DLC2. PCR semi-cuantitativa realiza en el hígado, los músculos esqueléticos y el corazón de la DLC2 - /- y DLC2 + /+ ratones de 3 meses de edad no mostró diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de DLC1 y DLC3. β-actina gen se utilizó para la normalización
doi:. 10.1371 /journal.pone.0006566.s001 gratis (0.39 MB TIF)