Extracto
rigidización microambiente juega un papel crucial en la tumorigénesis. Mientras filopodios generalmente se cree que es uno de los mechanosensors celulares para sondear la rigidez del medio ambiente, los efectos de la rigidez del medio ambiente sobre las actividades filopodial de células cancerosas siguen sin estar claros. En este trabajo, investigamos las actividades filopodial de células de adenocarcinoma de pulmón humano CL1-5 cultivadas sobre sustratos de rigidez ajustable utilizando una plataforma novedosa. La plataforma consta de un sistema óptico llamado estructurado iluminación nano-perfilometría, que permite la visualización de tiempo transcurrido de las actividades filopodial sin etiquetado de fluorescencia. Los sustratos de cultivo estaban compuestos de cloruro de polivinilo mezclado con un plastificante con el medio ambiente para producir el módulo de Young de 20 a 60 kPa. estudios de viabilidad celular mostraron que la viabilidad de las células cultivadas en los sustratos fue similar a las cultivadas en elastómeros utilizados comúnmente tales como polidimetilsiloxano. imágenes de células vivas en el tiempo transcurrido se adquirieron y las actividades filopodial en respuesta a los sustratos con diferentes fueron analizados grados de rigidez. Los análisis estadísticos revelaron que las células de cáncer de pulmón cultivadas en sustratos blandos parecía tener ya filopodios, mayores densidades filopodial con respecto al perímetro celular, y las tasas de retracción más lento filopodial. No obstante, el análisis temporal de las actividades filopodial reveló que si un filopodium decide extender o retraer es puramente un proceso estocástico y sin dependencia de la rigidez del sustrato. La discrepancia de las actividades filopodial entre las células de cáncer de pulmón cultivadas en sustratos con diferentes grados de rigidez desapareció cuando las actividades de la miosina II fueron inhibidos por el tratamiento de las células con blebbistatin, lo que sugiere que las actividades filopodial están estrechamente modulados por la fuerza de adhesión de las células. Nuestros datos cuantitativos se refieren filopodial actividades de las células de cáncer de pulmón con la rigidez del medio ambiente y deben arrojar luz sobre la comprensión y el tratamiento de la progresión del cáncer y la metástasis
Visto:. Liou YR, Torng W, Kao YC, Sung KB, Lee CH , Kuo PL (2014) de sustrato de rigidez Regula filopodial Actividades en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (2): e89767. doi: 10.1371 /journal.pone.0089767
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 13 Junio, 2013; Aceptado: 26 Enero 2014; Publicado: 27 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Liou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores Agradecemos la ayuda financiera bajo los números de subvención NSC 100-2112-H-001-022-MY3 y NSC101-2220-e-002-011 proporcionados por el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (http://web1.nsc.gov. tw /) y el número de concesión 101-EC-17-A-19-S1-174 proporcionada por el Ministerio de Economía de Taiwán (http://www.moea.gov.tw/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
rigidez microambiente juega un papel crucial en el desarrollo y progresión del cáncer. La rigidez de la matriz extracelular resultante del aumento de la reticulación del colágeno se produce durante la tumorigénesis [1], [2]. El endurecimiento de la matriz afecta a la motilidad celular, dirige la migración de las células del cáncer, y puede además estar relacionado con la metástasis de órganos específicos [3]. matriz Stiff promueve la estabilidad de la adhesión focal de células, lo que aumenta la señalización del factor de crecimiento intracelular y a su vez aumenta la transformación de las células tumorales y el crecimiento [2], [4]. Por ejemplo, se ha demostrado recientemente que varias líneas celulares de cáncer de pulmón crecieron mejor en sustratos rígidos [5], y que la reducción de stifferening matriz mediante la inhibición de la progresión tumoral mediada por impedido oxidasa lisil reticulación de colágeno [6]. La comprensión de cómo perciben las células cancerosas y responden a la rigidez del medio ambiente debe proporcionar información valiosa sobre las complejidades de la progresión del cáncer y ayudar en la mejora de las estrategias de tratamiento
.
Filopodios, los salientes en forma de dedos en los bordes de celda, se observan generalmente en altamente células de cáncer metastásico, tales como CL1-5, un altamente invasivos células de adenocarcinoma de pulmón humano [7], [8]. La morfología única y actividades altamente dinámicos de filopodios a tomar orgánulos intrínsecamente adecuados para sondear la rigidez del medio ambiente. Filopodios normalmente de extensión y retracción dentro de una escala de tiempo de decenas de segundos, mientras que su larga duración y alta relación superficie-volumen permiten una interacción íntima con el microambiente. filopodial retracción implica el flujo retrógrado de F-actina impulsado principalmente por la contracción de la miosina II [9], mientras que las actividades de miosina se correlacionan positivamente con la rigidez del sustrato [4], [10]. Por lo tanto se piensa que filopodios pueden actuar como mechanosensors celulares mediante el sondeo rigidez del medio ambiente en la retracción. Recientemente, la dinámica de rigidez sensible sustrato de filopodios se demostró en los conos de crecimiento neural y explicados por un modelo estocástico basado en la hipótesis de "motor de embrague" [11], [12]. El modelo predice que la tasa de flujo retrógrado miosina guiado de los aumentos de F-actina y la fuerza de tracción filopodial disminuye con el aumento de la rigidez del sustrato. Los resultados experimentales confirmaron que el filopodios separa del sustrato con más frecuencia con una mayor rigidez del sustrato. Si estas predicciones y observaciones pueden generalizarse a las células cancerosas, se puede esperar que las actividades filopodial generales de una célula de cáncer, tales como la distribución de la longitud y la densidad filopodial también serían regulados por la rigidez del sustrato. Esto es importante, ya que se cree que la presencia y las actividades de filopodios en las células cancerosas que se correlaciona con la capacidad de las células cancerosas para el hogar de los vasos sanguíneos e invaden los tejidos [7], [13] - [15].
Sin embargo , los efectos de la rigidez del sustrato sobre las actividades filopodial de células cancerosas siguen sin estar claros, debido a varias limitaciones de la técnica. Los diámetros de filopodios se extienden típicamente de uno a tres cientos de nanómetros, que están en el margen del límite de resolución de la microscopía óptica convencional. En consecuencia, se tomaron la mayoría de imágenes de células vivas con respecto a las actividades filopodial de las neuronas embrionarias proteína actina-transfectadas fluorescentes, que tienen gran filopodios en los conos de crecimiento. Sin embargo, la mayor expresión de la proteína compleja-actina fluorescente transfectadas puede alterar las actividades filopodial, mientras que la fototoxicidad interpuesto por la luz de excitación puede afectar a las actividades celulares y cambiar la dinámica de filopodios [16], [17].
en este trabajo, se investigaron los efectos de la rigidez del sustrato sobre las actividades filopodial de las células de cáncer de pulmón CL1-5 utilizando una técnica de imagen de nuevo desarrollo llamado estructurado iluminación nano-perfilometría (SINAP), que utiliza la sensibilidad topográfica para mejorar el contraste de la imagen de un filopodium sobre sustratos planos y permite libre de etiquetas, visualización de tiempo transcurrido de actividades filopodial a una velocidad de hasta 0,2 Hz [18], [19]. Para mejorar el contraste de la imagen entre filopodios y el medio circundante, cloruro de polivinilo (PVC) materiales basados con altos índices de refracción y rigidez sintonizable fueron adaptados para el cultivo celular. La biocompatibilidad de los sustratos a base de PVC se evaluó usando el ensayo de MTT [20]. Se cuantificaron las actividades filopodial de células individuales mediante la medición de la densidad filopodial (es decir, el número de filopodios por unidad de longitud de las periferias celulares), la longitud filopodial promedio, las tasas de extensión y retracción filopodial, y la probabilidad de extensión /retracción de filopodios individuo , que se define como la fracción de tiempo que un filopodium pasó para la extensión /retracción. Para determinar si el efecto de la rigidez del sustrato sobre las actividades filopodial depende de las actividades de la miosina II, también medimos el cambio de actividades filopodial cuando las células cultivadas en sustratos con diferentes grados de rigidez se trataron con blebbistatin, un inhibidor de la miosina II.
resultados
Caracterización de los sustratos a base de PVC
los sustratos de cultivo fueron hechas de una mezcla de PVC y un respetuoso del medio ambiente, el tipo de plastificante carboxilato, di (isononilo) ciclohexano-1, 2-dicardoxylate (DINCH). La rigidez de la mezcla fue ajustado mediante el ajuste de la relación de PVC para el plastificante, mientras que relaciones más grandes resultaron en materiales compuestos rígidos. módulos de los compuestos de PVC de Young, medida por la aplicación de compresión secuencial para los materiales a granel, fueron 20,2 ± 2,5 kPa (
n
= 6), 35,7 ± 0 kPa (
n = 1
), y 61,1 ± 12,9 kPa (
n
= 6) para el PVC 01:01, 02:01 PVC, PVC y 03:01 respectivamente. Aquí el PVC 01:01, 02:01, 03:01 y se refieren a los compuestos de PVC con relaciones de PVC para el plastificante es 01:01, 02:01, 03:01 y respectivamente. Estos datos indican que la rigidez de los materiales compuestos de PVC está dentro del rango de la mayoría de tejidos en condiciones malignos [21].
El principio de funcionamiento de SINAP requiere que el sustrato de cultivo tiene un índice de refracción diferente de la de las células a mejorar la relación señal a ruido de las imágenes. Los índices de refracción de los materiales compuestos de PVC se determinaron utilizando la novela microtomography holográfica digital como descrito recientemente [22]. Los índices de refracción medidos del PVC y el plastificante eran 1,53-1,57 y 1,47, respectivamente. Así, los índices de refracción resultantes del material compuesto de PVC varió desde 1,47 hasta 1,53, que es muy próxima a la de vidrio (~ 1,5) y más alta que la de las células (~1.36) [23].
prueba de viabilidad de la célula se utilizó para determinar si la biocompatibilidad de los materiales compuestos de PVC es compatible con otros sustratos compatibles comúnmente utilizados para el cultivo celular. Hemos llevado a cabo ensayos de MTT para células de adenocarcinoma de pulmón humano CL1-5 cultivadas sobre vidrio, los materiales compuestos de PVC, geles de poliacrilamida (PA), y poli (dimetil) siloxano (PDMS). La Figura 1 muestra imágenes típicas de las células cultivadas en los diferentes sustratos. El ensayo MTT cuantifica células activas metabólicas como la densidad óptica (DO) a 570 nm. Como se muestra en la Fig. 2, las células cultivadas en el vidrio y PA gel tenido el mayor viabilidad en comparación con otros sustratos elastoméricos. Las viabilidades promedio de las células cultivadas en los materiales compuestos de PVC y la de los sustratos PDMS fueron similares. No hubo diferencia significativa en la viabilidad celular entre la 3:01 PVC, 2:01, y 1:01. Esto indica que la biocompatibilidad de los materiales compuestos de PVC es similar a la de otros sustratos elastoméricos utilizados comúnmente y no afectados por la variación de la proporción de PVC para el plastificante.
El PVC 1:01, 2:01, y 3 :1 referirse a los compuestos de PVC con relaciones de PVC para el plastificante es 01:01, 02:01, 03:01 y, respectivamente; PA y PDMS se abrevian de poliacrilamida y poli siloxano (dimetil) respectivamente. Barra de escala = 100 micras.
El colorante tiene un color púrpura y se cuantificó la absorbancia óptica a 570 (
n
= 8, 5, 4, 4, 3, y 3 para el vidrio, PVC 03:01, 02:01 PVC, PVC 01:01, gel de PA, y el sustrato PDMS, respectivamente).
Efectos de la rigidez del sustrato de la longitud y la densidad filopodial
Para determinar si las actividades filopodial se ven afectados por la rigidez del sustrato, se sembraron las células CL1-5 en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio. Los sustratos se revisten con fibronectina antes de la siembra de células para facilitar la unión celular. La inmunotinción contra la fibronectina recubierto confirmado que la fibronectina absorbida tenía concentraciones superficiales similares a través de los tres tipos de sustratos; las relaciones de la intensidad de fluorescencia media de la fibronectina manchado al fondo sustrato fueron 1,64, 1,59, y 1,41 para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente. módulos de los compuestos de PVC de Young eran aproximadamente 60 kPa y 20 kPa para el PVC 03:01 y 01:01, respectivamente, mientras que el módulo de vidrio de Young es del orden de GPa. imágenes de células vivas fueron adquiridos utilizando un sistema SINAP. imágenes SINAP típicos para las células cancerosas cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el sustrato de vidrio se muestran en la Fig. 3, en el que filopodios se caracterizan como protuberancias finas y luminosas con diferentes longitudes en las periferias celulares.
Barra de escala = 5 micras.
Hemos observado que el número de filopodios por célula varió de 50 a 70. para las células individuales, se identificaron todos los filopodios visible y se calculó la densidad y la duración media de la filopodios, conocido como
f
dy
f
L respectivamente. La densidad filopodial se definió como la relación entre el número de filopodios en el perímetro de la célula. La Figura 4A muestra la variación de la
f
d muestreada a partir de células cultivadas en PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente. Las células cultivadas en el 1:01 PVC tenían el mayor
f
d (media = 0,55 m
-1, el número de células = 33), seguido de las células cultivadas en el PVC 3: 1 (media = 0,31 m
-1, el número de células = 18) y que se cultivan en el cristal (media = 0,31 m
-1, el número de células = 43). El análisis estadístico reveló que hay una diferencia significativa entre los resultados de la PVC 01:01 y 03:01 (
p
= 4,4 × 10
-9), y el PVC 01:01 y el cristal (
p
= 1,1 × 10
-9), mientras que no hay diferencia significativa entre los resultados de la PVC 03:01 y el cristal (
p
= 0,75). Consistentemente, como se muestra en la figura 4B, el
f
L de las células cultivadas en el 1:01 PVC fue significativamente más largo que el de las células cultivadas en el 3:01 PVC (
p
= 8,8 × 10
-4) y el cristal (
p
= 2,2 × 10
-4), mientras que no hay diferencia significativa entre la del PVC y 3:01 el cristal (
p = 0,67
). Los medios de
f
L fueron 3,77, 3,08 y 3,03 micras para la 1:01 de PVC, PVC 03:01, y vidrio, respectivamente. Estos datos indican que cuando las células cancerosas se cultivan en sustratos elastoméricos, las células que crecen en sustrato más suave tienen más y ya filopodios.
La densidad filopodial se definió como el número de filopodios por unidad de longitud del perímetro celular. La longitud filopodial se promedió a partir de todos los filopodios visible de la célula. Las barras representan las medias de las variables y los errores indican las desviaciones estándar calculadas a partir de 33, 18, y 43 células para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente. Se encontraron diferencias significativas entre los datos de PVC 01:01 y 03:01, 01:01 y PVC y vidrio con el que ** indica p
. & lt; 0,01
Efectos de la rigidez del sustrato sobre la dinámica de extensión y retracción filopodial
Nos preguntamos si la filopodios tienen diferentes tasas y probabilidades para extender o retraer cuando las células cancerosas fueron cultivadas sobre sustratos de diferentes grados de rigidez. En concreto, se razonó que la filopodios de las células cancerosas cultivadas sobre sustratos rígidos puede tener una mayor propensión a retractarse, lo que conduce a un
f
más pequeño D y una más corta
f
L, como se muestra en la Fig. 4. Analizar la retracción y la ampliación dinámica de filopodios individual, imágenes SINAP-tiempo transcurrido de células vivas se tomaron un fotograma cada 10 segundos durante cinco minutos. Sólo filopodios durado más de un minuto (es decir, que aparece en 6 cuadros consecutivos) fueron rastreados y las longitudes filopodial instantáneos se midieron a partir de fotogramas individuales. Un perfil temporal longitud representativa de un filopodium rastreado se representa en la Fig. 5. El filopodium tenía una longitud inicial de 0,92 micras, con inicio de seguimiento, se extendió de forma continua durante 100 segundos, y se retrae a 1,02 micras, con el final de la adquisición de imágenes. Se calcularon las tasas de cambio de longitud entre fotogramas consecutivos y se refirió cambios positivos y negativos como la extensión ya que las tasas de retracción. Esto produjo un conjunto de tasas de extensión /retracción asociados con diferentes longitudes filopodial. Por ejemplo, las tasas de extensión para la filopodium muestran en la Fig. 5 son 0,004, 0,04 y 0,001 μm⋅s
-1 en la longitud filopodial de 0,92, 1,14 y 1,79 micras, respectivamente. Tenemos un seguimiento de 51, 59, y 34 filopodios para las células cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente. Hemos asumido que las células cultivadas en el mismo tipo de sustratos tienen una dinámica filopodial similares, y reunieron a los datos de velocidad en función del tipo de sustratos de cultivo. Para facilitar la comparación de los datos de velocidad a través de diversas longitudes filopodial, que Surtido de los datos con un conjunto de rangos de longitud separadas por la misma distancia. En primer lugar, elegimos 2 micras como la brecha; es decir, rango de 1 a que se refiere filopodial longitud ≥0 y & lt; 2 m, rango de 2 a que se refiere filopodial longitud ≥2 micras y & lt; 4 micras, y así sucesivamente. La Figura 6 resume la variación de los datos de velocidad a través de los rangos de longitud definida para las células cultivadas en los tres tipos de sustratos. Las barras representan las medias de los datos de tasa de surtidos en el rango de longitud y los errores indican las desviaciones estándar. En general, las tasas de extensión mostraron una tendencia a disminuir a medida que la longitud filopodial aumentado, mientras que las tasas de retracción parecían aumentar a medida que la longitud aumentado, con un máximo local en longitud de 11, 7, y 7 micras para las células cultivadas en el PVC 1:01, 3:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente. Hemos observado tendencias similares cuando assorting los datos utilizando diferentes lagunas, tales como 1 o 0,5 micras para los rangos de longitud. Tenga en cuenta que en la Fig. 6, los datos de velocidad de las células en sustratos blandos abarcaban categorías de talla de mayor tamaño, lo cual es consistente con los resultados mostrados en la Fig. 4B.
La célula se cultiva en un sustrato de vidrio. La longitud filopodial fue de 0,92 micras, con el inicio de adquisición de imágenes, extiende de manera continua a 1,81 m, y retraída a 1,02 micras, con el final de la adquisición de imágenes. Las imágenes SINAP correspondientes a los datos de longitud marcados por círculos se muestran en la derecha y anotados con el tiempo de grabación. El filopodium seguimiento fue destacada por la flecha imagen de 1
er en.
(A), (B) y (C) se representa la relación entre las velocidades de extensión y longitudes para el filopodial células cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el sustrato de vidrio, respectivamente; (D), (E) y (F) muestran una variación de las tasas de retracción con respecto a varias longitudes filopodial para las células cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustrato de vidrio respectivamente. Las barras representan las medias de los datos de tasa de surtidos en los rangos de longitud y los errores indican las desviaciones estándar. Los datos fueron surtidas en un conjunto de rangos de longitud separadas por 2 micras. El número de filopodios rastreados para la medición de la frecuencia son 51, 59, y 34 para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente.
rigidez del sustrato afectó significativamente las tasas de retracción cuando filopodial longitud supera una cierta escala. Se encontró que el significado apareció cuando la escala se ajusta para que sea 4 micras, que es alrededor de los medios de la
f
L se muestra en la Fig. 4B. Para cada filopodium rastreado, agrupamos los datos de velocidad medidos en filopodial longitud ≥4 micras y calculados los medios. Nos referimos a los medios de la extensión y retracción de las tasas como
V
E y
V
R, respectivamente. Nos reunimos el
V
E y
V
R calculado a partir de células cultivadas en el mismo tipo de sustrato y surtidos los datos en un conjunto de rangos de frecuencia que fueron igualmente separados por 0,02 μm⋅s
-1. La probabilidad de que ocurre una gama determinada tasa se estima calculando por lo tanto la fracción de los datos de surtidos en el rango de interés. La Figura 7 ilustra la distribución de probabilidad de las velocidades de extensión y retracción estimados para las células cultivadas en los tres tipos de sustratos. Las líneas continuas, discontinuas y de puntos representan la distribución normal se ajusta a los datos de vidrio, PVC 03:01, y PVC 01:01 respectivamente. El análisis estadístico reveló que no hubo diferencias significativas entre el
V
E para las células cultivadas en los tres sustratos (
p = 0,17)
. Los medios de
V
E fueron 0,052, 0,064, y 0,054 μm⋅s
-1 para las células cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el sustrato de vidrio, respectivamente . Sin embargo, la
V
R para las células cultivadas en el 1:01 PVC fue significativamente más lenta que la del vidrio (
p
= 0,02), mientras que las diferencias de
V
R entre las células cultivadas en el PVC 01:01 y la 3:01 PVC (
p
= 0,31) y la del PVC 03:01 y el cristal (
p
= 0,05) no fueron significativas. Los medios de
V
R fueron 0,059, 0,063, y 0,069 μm⋅s
-1 para las células cultivadas en el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el sustrato de vidrio, respectivamente . Estos resultados sugieren que la filopodios de las células cultivadas en sustratos blandos aparece para retraer más lenta cuando la longitud filopodial supera la longitud media.
Los datos fueron surtidos en una serie de intervalos de porcentajes que fueron igualmente separados por 0,02 μm⋅s
-1. Las líneas continuas, discontinuas y de puntos representan la distribución normal se ajusta a los datos de vidrio, PVC 03:01, y PVC 01:01 respectivamente. Los coeficientes de determinación (es decir,
R-
cuadrado) para los tres accesorios son & gt;.
0,9
Para cuantificar la tendencia de retracción filopodial cuando las células fueron cultivadas sobre sustratos de concreto rigidez, definimos la probabilidad de que un filopodium prefiere para retraer como (1) donde
t
e y
t
R denotan las fracciones de tiempo que el filopodium gastado para su extensión y retracción respectivamente. Ya que estábamos principalmente interesados en la dinámica filopodial que afectan a los medios de la
f
L, fueron excluidos únicamente los datos temporales después de la longitud filopodial superior se consideraron 4 micras y los períodos que la longitud filopodial permaneció estacionaria . Tenga en cuenta que la probabilidad de extensión y retracción de la filopodium son los mismos si
P
R es igual a 0,5. La Figura 8 muestra la distribución de probabilidad de la
P
R calculado a partir de las células cultivadas en los tres tipos de sustratos. Una vez más, las líneas continuas, de trazos y de puntos representan la distribución normal se ajusta a los datos de vidrio, PVC 03:01, y PVC 01:01 respectivamente. El análisis estadístico reveló que no había ninguna diferencia significativa entre el
P
R de las células cultivadas en los tres tipos de sustrato (
p
= 0,54). Los medios de
P
R fueron 0,48, 0,48, y 0,47 para el PVC 01:01, 03:01 PVC y vidrio, respectivamente. Estos resultados sugieren que si un filopodium decide extender o retraer es puramente un proceso estocástico sin dependencia de la rigidez del sustrato. Así, la variación de
f
L entre sustratos de diferentes grados de rigidez se debió principalmente a la variedad de tasas de retracción filopodial, que fue impulsado principalmente por la miosina II contracción y depende de la rigidez del sustrato.
la tendencia de retracción se define como la fracción de tiempo que el filopodium pasó para la retracción. Las líneas continuas, discontinuas y de puntos representan la distribución normal se ajusta a los datos de vidrio, PVC 03:01, y PVC 01:01 respectivamente. Los coeficientes de determinación (es decir,
R-
cuadrado) para los tres accesorios son & gt;. 0.9
tratamiento Blebbistatin altera las actividades filopodial
Desde la rigidez del sustrato regula la fuerza de la adhesión celular y la miosina actividades II [10], nos preguntamos si la discrepancia observada de longitud filopodial y densidad entre las células cultivadas sobre sustratos de diferentes grados de rigidez se desvanece si se inhibieron las actividades de miosina. Primero examinamos las viabilidades y actividades filopodial de células cancerosas tratadas con blebbistatin de varias concentraciones. Las células se cultivaron CL1-5 sobre sustratos de vidrio durante 24 horas y se expusieron a soluciones que contienen desde 10 hasta 30 blebbistatin mu M durante 1 hora para inhibir las actividades de miosina, como una referencia a una literatura reciente [24]. Los estudios de viabilidad celular utilizando el ensayo MTT revelaron que el tratamiento de 10-30 blebbistatin M no trajo la células CL1-5 toxicidad significativa (Fig. 9), mientras que la densidad filopodial y duración media aumentó con el aumento de las concentraciones blebbistatin (Fig. 10) . El análisis estadístico reveló que la densidad filopodial de las células cancerosas tratadas con 30 blebbistatin mu M fue significativamente mayor que el tratado con 0 (
p
= 0,006) y 10 mM blebbistatin (
p
= 0,03), pero no había ninguna diferencia significativa entre los que se trata con 0 y 10 mM (
p
= 0,1). Del mismo modo, la longitud filopodial de las células cancerosas tratadas con blebbistatin 30 mM fue significativamente más largo que el tratado con 0 (
p
= 3,2 × 10
-5) y 10 blebbistatin mu M (
p
= 0,02), y no hubo diferencia significativa entre los que se trata con 0 y 10 mM (
p
= 0,01).
Las células se cultivaron sobre sustratos de vidrio para 24μM de DMSO o blebbistatin para 1 hora (
n
= 5 para cada concentración). Las densidades ópticas de las células sin la aplicación de los reactivos se conocen como control (
n
= 8). Las barras representan las medias de las variables y los errores indican las desviaciones estándar.
Las barras representan las medias de las variables y los errores indican las desviaciones estándar calculadas a partir de 43, 24, y 31 células tratadas con 0, 10, y 30 mM blebbistatin respectivamente. La marca * indica
p
. & Lt; 0,05
Para alcanzar el bloqueo significativo de las actividades de miosina, que las células cultivadas en el CL1-5 PVC 01:01, 03:01 PVC y sustratos de vidrio y trataron las células con una solución de blebbistatin 30 M durante 1 hora. La figura 11 muestra el campo brillante y las imágenes representativas inmunotinción de las células que fueron tratadas y no tratadas con blebbistatin. Se calculó el número de vinculina manchado por las células. Parece que el tratamiento aumentó blebbistatin celular redondeo en todos los tres tipos de sustratos y una mayor elongación y ramificación filopodial, pero disminuyó el número de adhesiones focales para las células cultivadas en sustratos rígidos. La media y la desviación estándar del número vinculina por célula fueron 53,2 ± 28,3, 93,6 ± 30,3 y 155,8 ± 35,5 para las células cultivadas en el PVC 01:01 (
n
= 5), PVC 03:01 (
n
= 5), y el sustrato de vidrio (
n
= 8) y sin tratamiento bleddistain. Después de la exposición bleddistain, los números cambiaron a 40,5 ± 13,6, 51,7 ± 19,5 y 101,6 ± 22,3 para las células cultivadas en el 1:01 PVC (
n
= 3), PVC 03:01 (
n
= 4), y el sustrato de vidrio (
n
= 9).
(A), (B) y (C) son imágenes de campo claro de las células tratadas con regularidad medio de cultivo como control; (D), (E) y (F) son sus imágenes de inmunofluorescencia correspondientes del núcleo (azul) y vinculina (verde); (G) - (L) muestra el campo brillante y las imágenes immunofluroresence correspondientes de las células tratadas con blebbistatin 30 mM durante una hora para inhibir la miosina II actividades. Barra de escala = 10 micras.
El análisis estadístico reveló que después de expuesto a blebbistatin 30 M durante una hora, la diferencia de
f
D entre las células cultivadas en el PVC 1:01 y 3:01 de PVC se convirtió en insignificante (
p = 0,11
), y el
p valor Opiniones de la importancia de los
f
D diferencia entre ese en el PVC 01:01 y el vidrio disminuido (
p
= 0,0069) en comparación con que sin el tratamiento blebbistatin (
p
= 1,1 × 10
-9). Además, el tratamiento blebbistatin aumentó significativamente
f
D, con un aumento más significativo en células cultivadas en el PVC 03:01 (
p
= 0,046 para el PVC 01:01,
p
= 2,1 x 10
-6 para la PVC3:1, y
p = 0,006
para el vidrio). El número de células de la muestra fueron 10, 13, y 31 para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el vidrio respectivamente. La figura 12A resume el cambio de
f
D para las células expuestas a blebbistatin durante una hora. Tenga en cuenta que los resultados mostrados en la Fig. 4A se representó junto a estas barras para la comparación
Las barras blancas representan las medias de los datos medidos a partir de células sin tratamiento blebbistatin (es decir, los datos en la Fig. 4).; las barras grises indican las medias de los datos medidos a partir de células con tratamiento blebbistatin; y los errores especifican las desviaciones estándar de los datos. El número de células tratadas con blebbistatin son 10, 13, y 31 para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y sustratos de vidrio, respectivamente.#Y ## denotan
p
& lt; 0,05 y
p
& lt; 0,01, respectivamente, para la diferencia entre los datos adquiridos a partir del mismo tipo de sustratos con y sin tratamiento blebbistatin; * Y ** están anotados para
p Hotel & lt; 0,05 y
p Hotel & lt; 0,01, respectivamente, para la diferencia entre los datos adquiridos de diferentes tipos de sustratos con y sin tratamiento blebbistatin. Tenga en cuenta que para las células sin tratamiento blebbistatin, no se encontraron diferencias significativas entre los datos de PVC y PVC 01:01 03:01, y entre la de PVC 01:01 y vidrio; para las células tratadas con blebbistatin, diferencia significativa sólo se encontró entre los datos de PVC 01:01 y vidrio.
El
f
l de células cultivadas sobre sustratos de diferentes grados de rigidez exhiben cambio similar después de que el tratamiento de 30 mM blebbistatin (Fig. 12B). Una vez más, los resultados mostrados en la Fig. 4B se representaron junto a ellos tras el tratamiento blebbistatin para la comparación. El análisis estadístico reveló que el tratamiento blebbistatin aumentó significativamente el
f
L para las células en el PVC 03:01 (
p
= 0,005) y el vidrio (
p
= 3.2 × 10
-5); mientras que el cambio de
f
L no fue significativa para las células de la 1:01 de PVC (
p = 0,48
). Los promedios de
f
L eran 4,32 m, 3,95 m, y 4,98 m para el PVC 01:01, 03:01 PVC, y el cristal, respectivamente. La discrepancia de
f
L entre las células cultivadas sobre sustratos de diferentes grados de rigidez se convirtió en insignificante después del tratamiento blebbistatin (
p = 0,12
). Estos resultados sugieren que el sustrato observado actividades de rigidez sensible de filopodios eran al menos en parte modulada por la actividad de la miosina II.
Discusión
En este trabajo, se cuantificó la relación entre las actividades de filopodial pulmón de células cancerosas y la rigidez del sustrato utilizando una técnica de imagen libre de etiquetas. Se encontró que la rigidez sustrato regulada la longitud filopodial y la densidad en las células cancerosas probablemente a través de afectar a la tasa de retracción filopodial, que fue modulada principalmente por las actividades de miosina variadas.