cervical
Extracto
El tercer miembro de la transformación de la proteína ácida espiral de la bobina (TACC) de la familia, TACC3, se ha demostrado que es un jugador importante en la regulación de la dinámica del centrosoma /microtúbulos durante la mitosis y se encontró que ser desregulado en una variedad de tumores malignos humanos. Nuestros estudios previos han sugerido que TACC3 puede estar implicado en la progresión del cáncer de cuello uterino y la quimiorresistencia, y su sobreexpresión puede inducir transición epitelio-mesenquimal (EMT) mediante la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt y proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK ) las vías de transducción de señales. Sin embargo, los mecanismos de aguas arriba de EMT mediada por TACC3 y su importancia funcional /clínico en cáncer de cuello uterino humano siendo difícil de alcanzar. factor de crecimiento epidérmico (EGF) ha demostrado ser un potente inductor de EMT en el cáncer cervical y asociados con la invasión tumoral y la metástasis. En este estudio, se encontró que TACC3 se sobreexpresa en el cáncer de cuello uterino y se puede inducir a la estimulación de EGF. La inducción de TACC3 por EGF depende de la actividad de la tirosina quinasa del receptor de EGF (EGFR). Curiosamente, el agotamiento de TACC3 suprime mediada por EGF EMT, lo que sugiere que TACC3 se requiere para el proceso de EMT EGF /EGFR impulsada. Por otra parte, Snail, un jugador clave en EMT EGF mediada, se encuentra que se correlaciona con la expresión de TACC3 en el cáncer cervical. En conjunto, nuestro estudio pone de relieve una nueva función para TACC3 en proceso de EMT EGF mediada y sugiere que la orientación de TACC3 puede ser una estrategia atractiva para el tratamiento de los cánceres de cuello uterino impulsados por la señalización /EGFR vías EGF
Visto:. Ha GH, Kim JL, Breuer E-KY (2013) TACC3 es esencial para la EMT mediada por EGF en el cáncer cervical. PLoS ONE 8 (8): e70353. doi: 10.1371 /journal.pone.0070353
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 18 Marzo, 2013; Aceptado: 17 Junio 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Ha et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epitelial-mensenchymal transición (EMT) es un altamente. proceso biológico conservado que resulta en una conversión de células epiteliales polarizadas para mesenquimales tipos de células que se caracterizan por la pérdida de los contactos célula-célula e-cadherina mediada así como la adquisición de un aumento de los potenciales migratorias e invasivas [1] - [9]. Factores de transcripción Snail, Slug, Twist and ZEB1 han sido identificados como reguladores negativos de la E-cadherina y se considera que son inductores potentes oncogénicos de la EMT [10] - [14]
A pesar del gran éxito de la detección temprana. programas, cáncer de cuello uterino sigue siendo la principal causa de muerte entre las mujeres en todo el mundo ginecológica [15], [16]. Se cree que los virus del papiloma humano (VPH) siendo la principal causa de cáncer de cuello uterino; Sin embargo, los estudios han demostrado que el virus por sí solo no es suficiente para desarrollar el cáncer [15], [17], [18]. factor de crecimiento epidérmico (EGF) ha demostrado ser uno de los más potentes inductores de EMT en el cáncer cervical y asociados con la invasión del estroma cervical y la metástasis nodal [15], [19]. El tratamiento crónico EGF induce la EMT a través de la regulación de la EMT que induce factor de transcripción Snail en células de cáncer cervical, y EMT EGF mediada está correlacionada con la sobreexpresión del receptor de EGF (EGFR) y la progresión clínica de cáncer de cuello uterino [15], [20]. La expresión de EGFR se ha encontrado que se sobreexpresa en el cáncer cervical [21].
El ácido proteína espiral de la bobina (TACC) de la familia transformación se caracteriza por una conservado C-terminal "dominio TACC", esencial para la interacción con la tubulina y microtúbulos [22] - [24] y se ha sabido que desempeñar un papel clave en la regulación de la dinámica de los microtúbulos y centrosoma [22], [25] - [29]. Hay tres proteínas identificadas en TACC humana: TACC1, TACC2 y TACC3 [24], [30] - [32]. TACC3 participa en el montaje y organización de los microtúbulos y la alineación de los cromosomas durante la mitosis, el mantenimiento de la estructura de la envoltura nuclear y la regulación del crecimiento celular /diferenciación y la transcripción de genes [24], [26], [27], [29], [ ,,,0],33] - [38]. El agotamiento de los
TACC3 ¿Qué causa el retraso del crecimiento y la letalidad embrionaria en ratones debido al aumento de la apoptosis [39].
Aunque el papel de TACC3 en el cáncer humano no está claro, la creciente evidencia sugiere que la desregulación de TACC3 puede ser directa o indirectamente relacionado con ciertos tipos de cáncer humano [24]. Las variaciones genéticas en el cromosoma 4p16.3, la región de codificación
TACC3
, se encuentran en varios cánceres humanos [9], [24], [40] - [48]. El crecimiento de fibroblastos receptor del factor de 3 genes (
FGFR3
) y
TACC3
están estrechamente localizada en el cromosoma 4p16.3 [9], [32]. Recientemente, se informó de una proteína de fusión TACC3-FGFR3 en un subconjunto de glioblastoma multiforme (GBM) [49] y los tejidos tumorales de vejiga y líneas de células [50]. Esta proteína de fusión induce defectos mitóticos y aneuploidía y activa la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) [49] señalización, [50]. Hasta ahora, una mutación somática (E680K) y dos mutaciones constitucionales (S93L y G514E) de
TACC3
han sido identificados en GBM y cáncer de ovario, respectivamente [40], [51], [52]. Los estudios han demostrado que la regulación de TACC3 se encuentra en glioblastoma, el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) y mieloma múltiple [40], [53], [54] y puede contribuir a lymphomagenesis [55], [56]. La expresión de genes de perfiles de análisis ha revelado que
TACC3
es hasta reguladas durante la transición del carcinoma ductal
In situ
a carcinoma invasivo de mama y el cáncer de ovario [57] - [59]. Hemos propuesto anteriormente que TACC3 puede estar asociado directamente o indirectamente con la progresión del tumor y resistencia a los medicamentos de cáncer cervical, en base a datos obtenidos de análisis de microarrays para identificar genes regulados por TACC3 [24], [60]. Por otra parte, nuestro estudio reciente ha demostrado que la expresión ectópica de TACC3 aumenta la proliferación, capacidad migratoria /invasiva y capacidad de transformación de las células de cáncer cervical HeLa y muestra un fenotipo más mesenquimales, acompañado por la baja regulación de marcadores epiteliales E-cadherina y la regulación de marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina, así como inductores de la EMT Snail y Slug [9]. Por otro lado, el agotamiento de TACC3 es capaz de revertir /supresión de EMT [9]. Aunque nuestro hallazgo indica que TACC3 puede desempeñar un papel importante en la EMT, los eventos de señalización corriente arriba responsables de la EMT mediada por TACC3 no se habían determinado.
Aquí, nos demuestran que TACC3 se sobreexpresa en el cáncer de cuello uterino. TACC3 puede ser inducida por EGF, y la inducción TACC3 EGF mediada depende de la activación de EGFR. Es importante destacar que, en ausencia de TACC3, EGF no es capaz de inducir EMT, lo que sugiere que es necesaria para TACC3 EMT EGF mediada en el cáncer cervical. Por otra parte, encontramos una correlación entre TACC3 y EGF inductor Caracol en el cáncer de cuello uterino. Nuestros resultados, por lo tanto, identifican un nuevo mecanismo que media EGF /EGFR inducida por EMT y una posible diana terapéutica para el cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
microarrays de tejidos de cáncer cervical (CR805, CR1003 y CR1501) fueron adquiridos de los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD). información del paciente microarrays de tejidos se muestra en la Tabla 1. Las diapositivas de microarrays de tejidos fueron deparaffinized, rehidratada y sometidos a tratamiento térmico para la recuperación de antígenos antes de la tinción de anticuerpos [61]. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo anti-TACC3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpo secundario biotinilado y la avidina biotina (ABC) de acuerdo con el protocolo del kit VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Tras el desarrollo de color con diaminobencidina (DAB), los portaobjetos se evaluaron de forma independiente por los autores. La intensidad de la tinción se registró como sigue: 0 para la expresión negativa; 1+ para la expresión débilmente positivo; 2+ para la expresión positivo medio; y 3+ para la expresión altamente positivo. Microfotografía (ampliación x 100) fue tomada por el DP12 microscopio (Olympus, Tokio, Japón) equipado con sistema de imagen digital DP71 (Olympus).
Cultivo de células, anticuerpos y reactivos
La cáncer de cuello uterino humano (HeLa, CaSki, SiHa y C33A) y líneas celulares inmortalizadas de HPV-epitelio ectocervical (Ect1 /E6E7) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). células HeLa se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Hyclone, Logan, UT) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA) y 1% de penicilina /solución de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). células CaSki se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Hyclone) que contenía 10% de FBS y 1% de penicilina solución /estreptomicina. células SiHa y C33A se cultivaron en MEM (Hyclone) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina solución /estreptomicina. Ect1 /E6E7 células fueron cultivadas en queratinocitos medio libre de suero (Ker-SFM; Gibco /BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) con 0,1 EGF ng /ml humana recombinante, 0,05 mg /extracto de pituitaria bovina ml y cloruro de calcio adicional 44.1 mg /L (concentración final 0,4 mM). Las células se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. El anticuerpo anti-TACC3 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos contra cadherina E, N-cadherina, vimentina, caracoles, babosas y EGFR fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Anti-β-actina de anticuerpos y EGF se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). El inhibidor de quinasa del EGFR AG1478 se adquirió de Selleckchem (Houston, TX).
shRNA y transfección
Las células fueron transfectadas con un TACC3 específica o un control de shRNA (Santa Cruz Biotechnology) usando FuGENE 6 (Roche Molecular bioquímicos, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante.
Análisis de Western Blot
lisados de tejido del cuello uterino normales humanos se adquirieron de imgenex (San Diego, CA). Los extractos celulares se prepararon en un tampón de lisis que consta de 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 1% phenoxypolyethoxylethanol nonil (NP-40), desoxicolato de sodio 0,25%, mM de cloruro de 150 sodio (NaCl), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), fluoruro de sodio 1 mM (NaF) y cócteles inhibidores de proteasa completos (Roche Molecular Biochemicals). Los lisados celulares se aclararon por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min, y los sobrenadantes se sometieron a análisis de transferencia Western. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por dodecilsulfato de sodio (SDS) electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con solución salina tamponada con Tris (TBS) /0.1% Tween 20 (TBS-T) suplementado con leche en polvo desnatada al 5% durante 1 h, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante el aumento de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) y se normalizaron a beta-actina.
Quantitative Real-Time Reacción en Cadena de la polimerasa (QRT -PCR)
total ARN de las células se extrajeron usando el kit RNeasy® mini (Qiagen Sciences, Germantown, MD) y luego se sometió a la síntesis de ADNc usando el kit de RevertAid ™ Primera Strand cDNA Synthesis (Fermentas Life Sciences Europa, Bremen, Alemania). La expresión de genes se analizó utilizando un iQ ™ SYBR
R supermix Green (Bio-Rad) y un tiempo real sistema de detección de PCR iCycler iQ5 (Bio-Rad). Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo: 95 ° C durante 5 min y 30 seg, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. Los datos se analizaron con un método de expresión génica normalizada (ΔΔ Ct) [62] utilizando el software del sistema óptico iQ5 (Bio-Rad), y el
β-actina
se utilizó como referencia para la normalización. Las secuencias de los pares de cebadores fueron los siguientes:
TACC3
5'-gaactggggaagatcatgga-3 'y 5'-ctcttcgttcttgcggtagc-3' [63];
β-actina
5actinINK \\ l \\ o "Ulisse 2007#484" gtagc-3 'CGG-3i [64]. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Transwell migración Ensayo
insertos de cultivo celular sin recubrimiento (8-micras poros, 24 pocillos) (Greiner Bio-One, Monroe, NC) se sembraron con 1 × 10
5 células en 200 l de medio libre de suero. Las cámaras inferiores se llenaron con 750 l de medio completo que contiene 10% de SFB. Después de 16 h de incubación, las células en la superficie superior del filtro fueron borradas, y las células que habían migrado a la superficie inferior del filtro se fijaron con paraformaldehído al 4% o metanol enfriado en hielo durante 5 minutos, se tiñeron con 0,05% de cristal violeta por 20 min y se cuantificó espectrofotométricamente a 490 nm.
Invasion ensayo
invasión ensayos se realizaron utilizando los kits QCM ECMatrix la invasión de células de ensayo (Millipore, Temecula, CA) según las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA). La significación se determina por
t-test y
Una forma de análisis de varianza (ANOVA), seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para medir la correlación entre dos variables. Un
p-valor Red de menos de 0,05 fue considerado como estadísticamente significativa.
Resultados
TACC3 se sobreexpresa en el cáncer cervical
Para investigar la importancia clínica de TACC3 en el cáncer cervical humano, lo primero que examinó la expresión de ARNm TACC3 en el cáncer cervical utilizando la base de datos a disposición del público Oncomine (www.oncomine.org, compendios Bioscience, Inc., Ann Arbor, MI) [65] y determinamos que es TACC3 altamente expresado en el cáncer cervical [66], [67]. La sobreexpresión de TACC3 en el cáncer de cuello de útero se confirmó en varias líneas de células del cuello uterino, incluyendo Ect1 /E6E7 (VPH-16 E6 /E7 transformado epitelio ectocervical), CaSki (HPV-16), C33A (HPV-negativa), HeLa (HPV-18 ) y SiHa (HPV-16) en comparación con tres tejidos del cuello uterino humanos normales. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión de TACC3 en estas líneas celulares era más alta que la de los tejidos del cuello uterino normales. Curiosamente, no hubo diferencias significativas en la expresión de TACC3 entre C33A HPV-negativas y otras células que portan oncogenes VPH (Ect1 /E6E7, CaSki, HeLa y SiHa), lo que sugiere que la infección por HPV puede no ser responsable de la sobreexpresión de TACC3. También se analizaron por inmunohistoquímica la expresión de TACC3 utilizando microarrays de tejido de cáncer de cuello uterino. TACC3 fue casi indetectable en el cuello uterino normal, mientras que se observó su fuerte expresión en tejidos de cáncer de cuello uterino (Figura 1B). Sin embargo, no hubo una asociación significativa de la expresión TACC3 con estadio clínico o el grado de la enfermedad (Figura 1C, 1D y S1). Sobre la base de nuestras conclusiones de que la expresión de TACC3 es elevada en el cáncer de cuello de útero en comparación con el cuello uterino normal, pero no significativamente asociado con la progresión de la enfermedad, se sugiere que el aumento de expresión de TACC3 puede ocurrir en las primeras etapas del desarrollo del tumor, así como ser esencial en el mantenimiento de cuello uterino tumorigénesis.
(a) La expresión de TACC3 en Ect1 /E6E7 (VPH-inmortalizada epitelial ectocervical), CaSki (HPV-16), C33A (VPH-negativo), SiHa (HPV-16) y HeLa ( líneas 18-HPV) de células se determinó por análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión se compararon con tres tejidos cuello uterino normal. β-actina se utilizó como control de carga. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. (B) tinción inmunohistoquímica Representante para la micromatriz de tejido de cáncer cervical. El análisis cuantitativo de microarrays de tejido de cáncer de cuello uterino mostró que la expresión de TACC3 es más alta en el cáncer cervical que en el cuello uterino normal, pero su expresión no se correlaciona con el estadio del tumor (C) o de grado (D). Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
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. & Lt; 0,001
Expresión EGF induce la estimulación endógena TACC3 en células que expresan EGFR
Nuestro estudio anterior indica que la sobreexpresión de TACC3 induce EMT , acompañada de la regulación por disminución de la e-cadherina y sobre regulación de caracoles y babosas, mientras que el agotamiento de TACC3 invierte EMT [9]. Además, la activación de Akt y ERK vías de señalización es esencial para mediada por TACC3 EMT [9]. Aquí, hemos tratado de determinar cómo TACC3 participa en la EMT. factores de crecimiento diversos, tales como EGF, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) han demostrado que induce la EMT y se asoció significativamente con la capacidad de invasión, metástasis y la recurrencia de cáncer de cuello uterino [ ,,,0],15], [68] - [70]. EGF se ha demostrado que induce la EMT a través de la regulación de Snail en células de cáncer de cuello del útero [15] y activar Akt y ERK vías de señalización [71], [72]. Con base en estos estudios, la hipótesis de que TACC3 puede estar implicado en EMT EGF mediada. Para probar nuestra hipótesis, se trataron células HeLa, CaSki y SiHa con 50 ng /ml de EGF durante 24 h y después se examinan los cambios morfológicos de las células y la expresión de los marcadores de EMT. Como se muestra en la Figura 2A, las células tratadas con EGF muestran características morfológicas y fenotípicas de EMT. Curiosamente, tanto la proteína (Figura 2B) y el ARNm (Figura 2C) niveles de TACC3 aumentaron significativamente tras la estimulación de EGF, acompañado por la baja regulación de marcadores epiteliales E-cadherina y la sobre regulación de marcador mesenquimal vimentina, así como inductores de la EMT Caracol y Slug en HeLa, CaSki y células SiHa (figura 2B). También se realizaron experimentos de tiempo para verificar la inducción de TACC3 a la estimulación de EGF. EGF indujo una expresión sostenida de TACC3 en CaSki y SiHa células hasta 48 h, mientras que un aumento temporal de la expresión TACC3 se encuentra en las células HeLa (Figura S2). También se encontró que el EGF promueve capacidades migratorias e invasivas de las células HeLa y SiHa (Figura 2D y 2E), en consonancia con otros estudios [15], [73]. No vimos ningún cambio significativo en la morfología celular (Figura 3A), la expresión de TACC3 y otros marcadores de EMT (Figura 3B), o la motilidad (Figura 3C) en las células C33A tratados con EGF. Esto es más probable porque C33A expresa niveles muy bajos o indetectables de EGFR (Figura 3D). Estos resultados sugieren que EGFR se requiere para la inducción de EGF-mediada de TACC3 y posterior EMT.
células de cáncer cervical (A) tratados con EGF mostraron un cambio morfológico asociado con la EMT. (B y C) Tanto los niveles de ARNm (C) de la proteína TACC3 (B) y fueron regulados por la estimulación de EGF, junto con la baja regulación de la E-cadherina y la sobre regulación de vimentina, caracoles y babosas. ß-actina se utilizó como control de carga. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. El nivel de ARNm de TACC3 estuvo representada en relación con ß-actina transcripciones. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. células (D y E) HeLa y SiHa tratados con o sin EGF se sometieron a migración transwell (D) y ensayos de invasión de Matrigel (E) (véase Materiales y Métodos). Las células se incubaron con o sin 50 ng /ml de EGF durante 24 h. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p Hotel & lt; 0,005; ****,
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C33A células tratadas con EGF no mostraron cambios significativos en la morfología celular (A), la expresión de marcadores de EMT TACC3 y (B ), o la motilidad (C). Las células se incubaron con o sin 50 ng /ml de EGF durante 24 h y después se sometieron a ensayos de transferencia y de migración transwell occidentales. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. (D) La expresión de EGFR en Ect1 /E6E7, CaSki, C33A, SiHa y HeLa líneas celulares se determinó mediante análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes.
La activación de EGFR se necesaria para la inducción mediada por EGF de TACC3
A medida que nuestros datos indican que el tratamiento con EGF puede aumentar la expresión de TACC3 en las células que expresan EGFR, se cuestionó si la inducción mediada por EGF de TACC3 depende de la actividad de la tirosina quinasa de EGFR. AG1478 es un inhibidor de tirosina quinasa de EGFR, que bloquea los eventos de señalización mediada por EGFR [74], [75]. El tratamiento con 5 M de AG1478 abolió cambios inducidos por EGF morfológicas (figura 4A) y la inducción TACC3 (Figura 4B), y, como consecuencia, se inhibió EMT mediada por EGF (Figura 4B). Estos datos sugieren que se requiere la activación de EGFR para la inducción TACC3 EGF mediada
.
La inhibición de la actividad de la tirosina quinasa de EGFR abolió un cambio morfológico asociado con EMT (A) y la inducción TACC3 EGF mediada por (B). Las células se trataron con EGF o EGF + AG1478 durante 24 h y después se sometieron a análisis de transferencia western. β-actina se utilizó como control de carga. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *,
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TACC3 es requerido para el proceso de EMT EGF mediada
Dado que tanto TACC3 y EGF pueden promover la EMT a través de la activación de PI3K /Akt y ERK vías de señalización [9], [71], [72], y TACC3 pueden ser de hasta reguladas tras la estimulación de EGF (Figura 2B, 2C y S2), nos preguntamos si TACC3 juega un papel importante en la EMT EGF mediada . Para abordar esta cuestión, que agotados TACC3 utilizando un vector lentiviral entrega de shRNA específico para TACC3 en células HeLa y SiHa y tratados con o sin EGF. Como se informó anteriormente [9], el agotamiento de TACC3 llevó a la sobre regulación de la E-cadherina y baja regulación de la vimentina, caracoles y babosas en las células HeLa y SiHa en comparación con las células control (Figura 5A). Curiosamente, el tratamiento EGF en células agotadas-TACC3 no fue capaz de revertir la expresión de marcadores de EMT (Figura 5A), la morfología celular (Figura 5B), la migración celular (Figura 5C) y la capacidad de invasión (Figura 5D). Estos hallazgos sugieren que TACC3 puede jugar un papel clave en la EMT EGF mediada.
A falta de TACC3, EGF no fue capaz de regular los marcadores de EMT (A), alterar la morfología celular (B), o mejorar celular capacidades de migración y la invasión (C y D). Las células fueron transfectadas transitoriamente con shRNAs contra el control (revueltos,
shCon
) o TACC3 (
shTACC3
) y tratados con o sin EGF durante 24 h. Las células se sometieron entonces a transferencia de Western, la migración transwell y ensayos de invasión de Matrigel. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes.
*
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;
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una correlación positiva existente entre TACC3 y Caracol expresión en cáncer de cuello
Caracol ha sido conocido por ser inducida por EGF , por lo tanto desencadenando EGF mediada EMT [15], [76]. Se encontró que TACC3 también se indujo a la estimulación de EGF (Figura 2B y 2C) y regula positivamente la expresión de Snail [9]. Por lo tanto, nos preguntamos si existe alguna correlación entre la expresión TACC3 y Caracol en el cáncer de cuello uterino. Es importante destacar que se encontró que la expresión de Snail fue elevada en el cáncer cervical (Figura 6A y 6B) y se correlacionó con la expresión TACC3 (Figura 6C). Sin embargo, la expresión TACC3 no se correlacionó con la expresión de Slug, otro miembro de la familia Snail (datos no mostrados).
(A) tinción inmunohistoquímica Representante de TACC3 y Caracol en microarrays de tejido de cáncer de cuello uterino. El análisis cuantitativo de los microarrays de tejido de cáncer de cuello uterino mostró que (B) la expresión de Snail es mayor en el cáncer de cuello uterino que en cérvix normal. Los datos mostrados son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,001 (C) Caracol expresión se correlaciona con la expresión TACC3 (r = 0,80383,
p & lt; 0,0001
).
Discusión
se ha sospechado que la desregulación (tanto arriba y abajo de la regulación) de TACC3 puede estar asociada con el desarrollo de diversos tipos de cáncer humano [24], [77], [78]. Hasta el momento, ya sea TACC3 actúa como un supresor de tumor o un oncogen no ha sido claramente definido debido a las discrepancias entre los estudios [24], [79]. Alternativamente, TACC3 puede tener diferentes funciones dependiendo del tipo de célula u órgano. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar la importancia funcional de TACC3 en el cáncer de cuello uterino. Nuestro análisis de microarrays de tejido de cáncer cervical reveló que la expresión de la proteína es de hasta TACC3 regulado en el carcinoma de células escamosas de cuello uterino, el tipo más común de cáncer cervical (aproximadamente 80-90%) [80]. Esto es consistente con los datos obtenidos de Oncomine [67] y sugiere su posible papel como un oncogén en el cáncer cervical. Nuestro estudio también sugiere que la expresión de TACC3 no puede ser regulado por los oncogenes E6 /E7, sin embargo, por el momento, no podemos descartar la posibilidad de que la expresión TACC3 está regulada por oncogenes VPH o correlacionada con los tipos de VPH.
EGF desencadena una cascada de eventos de señalización mediante la interacción con su receptor, EGFR [81], y se ha demostrado ser un potente inductor de EMT en el cáncer cervical [15]. eventos de señalización EGF /EGFR están asociados con la progresión tumoral acelerado de cáncer de cuello uterino [15], [19], [82]. En este estudio, se encontró que TACC3 fue hasta reguladas tras la estimulación de EGF, y el agotamiento de TACC3 abolió proceso de EMT mediada por EGF en células de cáncer de cuello uterino. Por otra parte, la inducción de TACC3 por EGF fue inhibida con éxito por el inhibidor de EGFR AG1478, lo que indica que la inducción TACC3 EGF mediada y posterior EMT dependen de la activación de EGFR. Curiosamente, se encontró que en células C33A, la expresión TACC3 fue mucho mayor que en las células CaSki o SiHa, a pesar de la ausencia de expresión de EGFR. Aunque nuestro estudio sugiere que la activación de EGFR puede ser uno de los mecanismos responsables de la regulación de la expresión de TACC3, aguas arriba de señalización que regula la expresión de TACC3 aún no ha sido bien definida. No ha sido hasta ahora un solo estudio publicados que demuestran la disminución de la estabilidad de proteínas TACC3 de una manera dependiente de Cdh1 [83]. TACC3 interactúa con un activador de la E3 ubiquitina ligasa anafase de la promoción de complejos /cyclosome (APC /C), Cdh1, y su interacción reduce TACC3 estabilidad de la proteína a través de la ubiquitinación y la degradación mediada por Cdh1 durante la progresión del ciclo celular. Una posibilidad es que consideramos que las células C33A pueden expresar niveles más bajos de Cdh1 que otras líneas celulares, manteniendo así altos niveles de TACC3. Curiosamente, a diferencia SiHa, CaSki y líneas de células HeLa, células C33A no albergan genomas de VPH, pero contienen la mutación de p53 [84] y pRb [85]. Además, diversos receptores de factores de crecimiento expresados en C33A son algo diferentes de SiHa, CaSki y células HeLa [86], [87]. Por lo tanto, es posible que la expresión TACC3 puede estar regulada por diferentes vías de señalización en función del tipo de célula.
Hay un creciente cuerpo de evidencia que demuestra la asociación de TACC3 con las vías de señalización del EGFR. TACC3 ha sido identificado como un socio de la interacción del transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5) [39], y su expresión se ha demostrado que se correlaciona con Aurora A expresión en ciertos tipos de cáncer [40], [63]. Curiosamente, EGFR también se asocia y coopera con STAT5 para apuntar y para aumentar la expresión de Aurora A, y se encuentra su expresión que se correlaciona con Aurora A expresión en cánceres de mama y de colon [81]. Por lo tanto, es razonable pensar que TACC3 puede formar un complejo con EGFR directa o indirectamente a través de su interacción con STAT5, y de esta manera estar implicado en las vías de señalización de EGFR. TACC3 También se descubrió como un receptor de aril hidrocarburos (AHR) translocador nuclear (ARNT) -interacting proteína [88]. ARNT pertenece a la hélice-bucle-hélice (bHLH) Pay-Per-Sim-ARNT familia (PAS) que dimeriza con Ahr y factor inducible por hipoxia α (HIF α) al estrés ambiental [89], [90]. Como un cofactor de transcripción, TACC3 es capaz de regular la activación transcripcional de HIF a través de la interacción directa con ARNT [91]. Un estudio reciente ha demostrado que ARNT desempeña un papel importante en la diferenciación epidérmica través de la regulación de las vías de señalización EGFR-ERK [92]. Por lo tanto, es tentador especular una posible participación de TACC3 en la red de ARNT-EGFR-ERK para regular la diferenciación de los queratinocitos.
El EGFR se expresa en niveles moderados a altos de cáncer de cuello uterino, y su expresión se asocia con estadio clínico y mal pronóstico [93], [94]. Las mutaciones en
EGFR
han demostrado ser poco frecuente en el cáncer cervical invasivo de alto grado [95]. Hasta ahora, sólo unos pocos ensayos clínicos a pequeña escala han sido probados para evaluar la eficacia de los inhibidores de EGFR para el tratamiento de cáncer de cuello uterino. Desafortunadamente, la monoterapia con inhibidor de EGFR no fue eficiente en los pacientes con cáncer recurrente locoregionally avanzado o metastásico cervical [94], [96]. Las combinaciones de inhibidores de EGFR con quimioterapia o quimiorradioterapia están actualmente bajo investigación.
Desde TACC3 se sobreexpresa en los cánceres de cuello uterino y otros y parece ser un jugador clave en el proceso de EMT EGF /EGFR impulsada, es posible que el agotamiento de TACC3 puede ser un buen método para tratar cánceres que son impulsados por el EGF /EGFR vías de señalización o resistentes a la terapia anti-EGFR. Aunque las mutaciones en
EGFR
en el cáncer cervical invasivo de alto grado son poco frecuentes, sería importante estudiar la asociación entre la expresión TACC3 y
EGFR
mutaciones. En general, nuestros resultados sugieren que TACC3 juega un papel importante en la EMT EGF mediada y puede servir como una diana terapéutica atractiva para los cánceres humanos impulsados por la señalización /EGFR vías EGF.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La expresión de TACC3 en el cáncer cervical con respecto a la etapa de la enfermedad y la clasificación histológica. Se presentó la expresión de TACC3 con diferentes estadios de la enfermedad y el grado del tumor. *,
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doi: 10.1371 /journal.pone.0070353.s001 gratis (TIF)
figura S2.
estimulación EGF induce la expresión endógena TACC3. TACC3 fue inducida por el tratamiento de EGF. Las células se incubaron con o sin 50 ng /ml y luego recogido en los puntos de tiempo indicados para análisis de transferencia Western.