Extracto
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo; los tiempos de supervivencia son pobres a pesar del tratamiento. El papel del dominio de dos poros K
+ (K2P) canal TASK-1 (KCNK3) en el cáncer de pulmón es actualmente desconocido. Se encontró que TASK-1 se expresa en líneas de células no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) a niveles variables. En una muy TASK-1 que expresa la línea de células de NSCLC, A549, un pH característico y sensibles a la hipoxia no inactivante K
+ actual se midió, lo que indica la presencia de canales funcionales TASK-1. La inhibición de TASK-1 condujo a la despolarización significativa en estas células. Desmontables de TASK-1 por siRNA mejora de forma significativa la apoptosis y la reducción de la proliferación en las células A549, pero no en débilmente TASK-1 que expresan las células NCI-H358. Na
+ - junto transporte de nutrientes a través de la membrana celular está acoplado funcionalmente al flujo de salida de K
+ a través de K
+ canales, por lo tanto TASK-1 puede influir potencialmente Na
+ - junto transporte de nutrientes. En contraste con TASK-1, que no se expresa de forma diferente en el cáncer de pulmón vs tejido pulmonar normal, encontramos el Na
+ - transportadores de nutrientes acoplados,
SLC5A3
,
SLC5A6
, y
SLC38A1
, transportadores de myo-inositol, biotina y glutamina, respectivamente, que se sobreexpresa significativamente en adenocarcinomas de pulmón. En resumen, se muestra por primera vez que el canal TASK-1 regula la apoptosis y la proliferación en un subconjunto de NSCLC
Visto:. Leithner K, Hirschmugl B, Li Y, Tang B, Papp R, C Nagaraj , et al. (2016) TAREA-1 regula la apoptosis y la proliferación en un subconjunto de células no pequeñas cánceres de pulmón. PLoS ONE 11 (6): e0157453. doi: 10.1371 /journal.pone.0157453
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos |
Recibido: 14 Diciembre, 2015; Aceptado: 31-may de 2016; Publicado: 13 Junio 2016
Derechos de Autor © 2016 Leithner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Para análisis in silico de expresión génica de datos en muestras de adenocarcinoma de pulmón y los pulmones normales (GDS3257) publicados en la expresión génica se utiliza Ominbus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
Financiación : el estudio fue apoyado por fondos del Banco Nacional de Austria (Fondo aniversario, número 12713 proyecto de HO). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Nuestro trabajo fue financiado por el Banco Nacional de Austria (Fondo aniversario, número de proyecto 12713). El Banco Nacional de Austria no tiene ningún interés comercial asociados con los proyectos financiados, incluyendo nuestro proyecto. El Banco Nacional de Austria es propiedad del gobierno federal de Austria, y el Fondo Aniversario sólo es compatible con la investigación independiente de muy diversos campos de investigación. Los proyectos son revisados por los investigadores internacionales (peer-review) independiente y los resultados obtenidos no son en cualquier forma utilizada por el Banco Nacional de Austria, ni tampoco el Banco Nacional de Austria tiene ningún impacto en los objetivos de los proyectos. Esto no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
cáncer de pulmón representa el mayor número de muertes por cáncer en todo el mundo [1]. Aproximadamente el 85% de los cánceres de pulmón son no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y el 15% son los cánceres de pulmón de células pequeñas. Los cánceres de pulmón a menudo se avanzaron al momento del diagnóstico [1] y la supervivencia es pobre a pesar del tratamiento [2].
K
+ canales han demostrado estar involucrados en prácticamente todas las características del cáncer, tales como la proliferación sostenida , la evasión de la apoptosis, y la invasión (para revisión ver [3,4]). En total, 77 genes codifican los canales de potasio. Existen
+ canales cuatro clases principales de K: voltaje K
+ canales, activado por calcio K
+ canales, hacia el interior del rectificador K
+ canales, y dos de los poros de dominio K
+ (canales K2P) [3]. Mientras que muchas K
+ canales abiertos sobre un disparador específico, por ejemplo, los cambios en el potencial de membrana, canales K2P son constitutivamente activa. Un canal K2P funcional es un dímero de dos subunidades del canal de [5,6]. canales K2P se agrupan en seis subfamilias basándose en sus propiedades estructurales y funcionales. Uno de los grupos, la tarea (relacionados con TWIK, ácido-sensibles) K
+ familia de canales, comprende los canales K2P ácido y sensibles al oxígeno, TASK-1 (codificada por el gen
KCNK3
), TASK-3 (
KNCK9
), y TASK-5 (
KCNK15
) [5,6]. TASK-5 es estructuralmente relacionados con la Tarea-1 y TASK-3, pero es eléctricamente silencioso. TASK-1 es único entre los canales iónicos en la generación de un rectificador abierta "fuga" K
+ corriente que está regulado por tanto, un aumento o disminución del pH extracelular en el rango fisiológico [5,7]. Las propiedades de TASK-3 son similares a TASK-1, sin embargo, el pKa de TASK-3 corrientes se desplaza a un nivel más ácida (pH 6,7) [5,7]. Además de las diferentes funciones en las neuronas, TASK-1 se ha demostrado que se expresa funcionalmente en el corazón, y para establecer el potencial de membrana en reposo y regular el tono en células del músculo liso de las arterias pulmonares, el intestino y la vejiga [5,7]. Por otra parte, TASK-1 ha demostrado ser un marcador para el tejido adiposo marrón [8,9].
Canales
K2P, al igual que el canal TASK-1, suele proporcionar el flujo de salida de K
+ a partir de células a lo largo de su gradiente electroquímico. Junto con la acción de Na
+ /K
+ - ATPasa, K
+ flujo de salida determina el potencial de membrana en reposo [5,7]. Puesto que el control del potencial de membrana es importante también en células no excitables, por ejemplo, para el control de la entrada de calcio dependientes de voltaje, sino también para Na
+ - transporte de solutos conducido, se evaluó si TASK-1 se expresa funcionalmente en las células de cáncer de pulmón y cánceres de pulmón humano
Materiales y Métodos.
Las líneas celulares
El NSCLC humano líneas de células A549 (Nº Cat. 300114), A427 y SK-MES-1 (SK-MES (Cat No. 300111.); gato. Nº 300339) fueron adquiridos directamente de la célula Líneas de Servicio (Eppelheim, Alemania). células A549 y A427 se cultivaron en DMEM /F-12 (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS, BioWest, Ringmer, Reino Unido) y antibióticos (penicilina y estreptomicina). SK-MES-1 en las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FCS y antibióticos. Las líneas celulares NSCLC humanos NCI-H23 (denominado en adelante como H23, número ATCC CRL-5800), el NCI-H358 (en lo sucesivo como H358, número ATCC CRL-5807), y NCI-H441 (se hace referencia en adelante como H441, número ATCC HTB-174) se adquirieron directamente de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MOR células y las células NCI-H460 (en lo sucesivo como H460) fueron un regalo de Martin P. Barr, Instituto de Medicina Molecular, Hospital de St. James y el Trinity College de Dublín, Dublín, Irlanda. H23, H358, H441, H460, y MOR células se cultivaron en RPMI (Gibco), suplementado con 10% de FCS (BioWest) y antibióticos. Las pruebas para descartar la contaminación por micoplasmas se llevaron a cabo con regularidad.
NSCLC y pulmón
tejido
muestras de tejido de NSCLC y las correspondientes muestras de tejido pulmonar normal se obtuvieron de doce pacientes que fueron remitidos para la resección quirúrgica de la División de Cirugía Torácica y hiperbárico, Universidad de Medicina de Graz. Antes de la cirugía consentimiento informado por escrito firmado para este estudio en particular se obtuvo de todos los pacientes. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Graz (Graz, Austria) y llevó a cabo de conformidad con la declaración de Helsinki.
tratamiento hipóxico
células de NSCLC se sembraron en la cultura platos y dejó que se unieran durante 24 horas. A partir de entonces las células se cultivaron durante 72 horas a 37 ° C en ambiente (21%) de oxígeno o 1% de oxígeno en la automatizada XVIVO Sistema G300CL (BioSpherix, Lacona, NY) antes de la extracción de ARN, toma de muestras de proteínas, o grabaciones de patch clamp. La exposición al oxígeno se controló a lo largo de los experimentos en la estación de trabajo hipóxica. El pH del medio de cultivo se midió al final del experimento utilizando el WTW 3110 metros pH (WTW, Weilheim, Alemania) inmediatamente después de la retirada de la incubadora.
Electrofisiología
El conjunto- se utilizó la técnica de patch clamp de células como se ha descrito anteriormente para medir el potencial de membrana en reposo bajo la pinza de corriente y K
+ corrientes bajo tensión de la abrazadera [10]. Todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Brevemente, las células fueron perfundidas a temperatura ambiente con solución de baño (en mM): NaCl 140,5, KCl 5,5, CaCl
2 1,5, MgCl
2 1, glucosa 10, Na
2HPO
4 0.5, KH
2 PO
4 0,5, HEPES 10; pH ajustado a 7,3 con NaOH. Para TASK-1 de grabación, las pipetas se llenaron con las siguientes soluciones (en mM): KCl 20, metanosulfonato de potasio (para suprimir Cl
- corrientes) 135, MgCl
2 1, CaCl
2 0,1, Na
2ATP 2, (éter de ß-aminoetil) etilenglicol bis -N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) 3, HEPES 20; pH ajustado a 7,2 con KOH. El no inactivante TASK-1 K
+ actual (I
KN) se obtuvo de la potencial de mantenimiento de 0 mV, mediante la intensificación de la tensión a 60 mV y después el aumento gradual a -100 mV durante un período de 1,6 segundos . Para aislar el no inactivante TASK-1 K
+ actual (I
KN) de dependiente de la tensión K
+ corrientes, las células se fijaron en 0 mV durante al menos 5 min. Los datos se analizaron con el software pCLAMP 9.0 (Axon Instruments, Foster City, CA).
silenciamiento génico con siRNA
siRNA dirigidos TASK-1 y no silenciar siRNA se obtuvieron de Ambion (Waltham , MA). De no silenciar siRNA (Control negativo#1 siRNA, Ambion) no muestra ninguna homología de secuencia con las secuencias de genes humanos. La transfección se realizó a una concentración final de 40 nM siRNA utilizando Effectene (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficacia se evaluó 48, 72, y 96 horas después de la transfección por qPCR y Western blot.
La extracción de RNA y la síntesis de ADNc
El ARN total fue extraído utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen) combinado con la digestión DNasa (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (1 g) se sometió a transcripción inversa utilizando el RevertAid H Minus kit de síntesis de la primera cadena de ADNc (Fermentas, Burlington, Canadá).
cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR)
qPCR reacciones eran realizado en el Sistema 7900 real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando el TaqMan
® expresión génica ensayos (Applied Biosystems)
KCNK3 gratis (TASK-1), Hs00605529_m1;
KCNK9 gratis (TASK-3), Hs00363153_m1;
SLC2A1 gratis (GLUT1), Hs00892681_m1;
HK2
, Hs00606086_m1;
ACTB gratis (ß-actina), Hs99999903_m1 (gen de referencia). La PCR se realizó en 10 reacciones mu l que contenían ADNc (equivalente a 25 ng de ARN total), 1x TaqMan
® Expresión Génica Mastermix (Applied Biosystems) y 1x TaqMan
® Expresión Génica de ensayo (Applied Biosystems). Mean ciclo umbral (Ct) se utilizaron número de carreras por triplicado para el análisis de datos. La expresión relativa del gen de interés en tratados frente a las células de control se calculó como 2
ΔΔCt. Ct se calcula restando el número de Ct del gen de interés de la del gen de referencia. Para el cálculo de ΔΔCt, Ct-valores del grupo de control se restaron de Ct-valores del grupo tratado.
Western blot
Las células se lisaron en hielo en tampón RIPA (Sigma-Aldrich ) que contiene inhibidores de la proteasa. 50 g de proteína se cargó en un gel de acrilamida al 10%, separados por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio utilizando el Mini-PROTEAN
® unidad de electroforesis (BioRad, Hercules, CA) y se transfirieron a una membrana de PVDF (BioRad). La inmunodetección se realizó con anticuerpo policlonal de conejo anti TASK-1 anticuerpo (laboratorios Alomone, Jerusalén, Israel; APC-024) diluido 1: 500, o un anticuerpo monoclonal de ratón TASK-3 (Abcam, Cambridge, MA; ab50042) diluido 1: 1000. actividad peroxidasa se detectó mediante detección de quimioluminiscencia (SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente, Thermo Scientific, Waltham, MA). Como control de carga, las membranas se tiñeron con un anticuerpo policlonal de ß-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). SiRNA células transfectadas
Ensayos de apoptosis
TASK-1 siRNA o controlar fueron replated en 2x10
4 células /cm
2. Después de 24 horas se añadieron estímulos apoptóticos: cisplatino, o DMEM que carece de medio de glucosa (Gibco). Después de 72 horas adicionales y las células flotantes células unidas se recogieron y la suspensión se centrifugó a 400 g durante 5 min. El porcentaje de células apoptóticas se determinó con el intracelular Actividad Kit de ensayo de la caspasa-3 I (PhiPhiLux
® G1D2, Merck, Darmstadt, Alemania) o, después de la interrupción del kit por el fabricante, por el CellEvent caspasa-3/7 verde Citometría de Flujo Assay Kit (Molecular Probes, Waltham, MA). La concentración de péptido DEVD se ajustó a 4 mM. Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, EE.UU.). Como se cosecharon las células de un segundo método, se centrifuga, se tiñeron con colorante Hoechst (Invitrogen, Waltham, MA), y se evaluó la fragmentación nuclear. El observador (KL) fue cegado al tratamiento, se evaluaron al menos 500 células por muestra.
Ensayos de proliferación
Las células transfectadas se volvieron a sembrar en placas de 6 pocillos a 1x10
5 células /pocillo en medios de cultivo que contiene 1% de FCS. Después de los puntos de tiempo indicados, las células se tripsinizaron y el número de células totales se midieron con CASY
® contador de células (Sistema Schärfe, Reutlingen, Alemania) en duplicados. Para la evaluación de la mitosis, las células se incubaron en medio de cultivo que contiene 1% de FCS. Después de 48 horas EdU (5-etinil-2 'desoxiuridina, un análogo de nucleósido de timidina) se añadió al medio durante otras 1,5 horas. Después de la cosecha, las células se analizaron con el kit Clickit EdU (Invitrogen) mediante citometría de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences).
En silico análisis de la expresión
abundancia de ARNm de miembros de la
SLC5
familia de transportadores y de los
SLC38A1
y
SLC38A2
se evaluó en un conjunto de datos de expresión génica a disposición del público en las muestras de adenocarcinoma de pulmón y los pulmones normales (GDS3257) [ ,,,0],11] publicada en gene Expression Omnibus (GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). se informan detalles sobre el procesamiento de microarrays y características de los pacientes en el GEO y en [11].
El análisis estadístico
Los datos fueron compilados y analizados con el paquete estadístico SPSS, versión 21.0 (Chicago, IL) o con GraphPad Prism, versión 5.03 (La Jolla, CA). Las diferencias de grupo se calcularon con
t-test
, de Student de una muestra de
t-test
, o de dos vías de Student no pareada o emparejado con ANOVA de Bonferroni análisis post-hoc según el caso.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
TASK-1 se expresa en un subconjunto de líneas celulares de cáncer y tejidos de NSCLC
En primer lugar, investigamos TASK-1 y la proteína TASK-3 y mRNA en ocho líneas celulares de cáncer humano. proteína TASK-1 fue consistentemente detectable por inmunotransferencia en cuatro de las ocho líneas celulares (A549, H358, H460, y MOR), la expresión más fuerte se encontró en A549, células H460, y MOR (Fig 1A). Además, débil TASK-1 expresión de la proteína se encontró en A427, H441 y SK-MES células, mientras que la expresión en células H23 fue insignificante. En las células A549 también los niveles de TASK-1 mRNA fueron elevados, mientras que en todas las otras líneas celulares se observó ninguna correlación clara entre la proteína TASK-1 y los niveles de ARNm (Fig 1A). Sin embargo los niveles de proteína TASK-1 no sólo están reguladas por la expresión de genes, pero también importante por endocitosis y la degradación de [12,13]. Esto podría explicar las discrepancias entre la proteína TASK-1 y los niveles de ARNm. Curiosamente, la tarea-1 iniciadores disponibles en el mercado no se encontró ninguna TAREA-1 transcripción de ARNm en células H441. TASK-3, que ha sido descrito para ser amplificado en el pulmón y el cáncer de mama [14], se expresó en las ocho líneas celulares de NSCLC con la expresión más baja se encuentra en las células A549 (Fig 1B). TASK-1, una proteína glicosilada [15], apareció en un peso molecular de 52 kDa en la inmunotransferencia (Fig 1C). Una banda adicional leve a los 46 kDa podría representar la no glicosilada TASK-1 forma (figura 1C). La señal fue abrogada por el uso de un péptido de bloqueo específico para el anticuerpo y se redujo después de la transfección con disponible comercialmente siRNA dirigidos TASK-1 (Fig 1C-1E), lo que confirma su especificidad.
(A) TASK -1 expresión en ocho líneas celulares de NSCLC diferentes. Se muestran los valores medios de densitometría Un inmunoblot representativo y. las células A549, presentes en todas las inmunotransferencias, sirven como referencia para la normalización. Abajo: los niveles de TASK-1 mRNA fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa. Beta-actina (ACTB) fue utilizado como un gen de referencia. (B) la proteína TASK-3 y los niveles de mRNA en ocho líneas celulares de cáncer diferentes. (A, b) resultados son la media +/- SEM de tres a cuatro muestras independientes. comparaciones de grupos se calcularon con la prueba t de un grupo de Student. células A549 (C, D) se transfectaron con ARNsi no silenciar (c), TASK-1 siRNA (T) o se deja sin tratar (u). se muestra (C) inmunotransferencia utilizando un anticuerpo Representante TASK-1 en presencia o ausencia de un péptido de bloqueo específico. TASK-1 aparece en un peso molecular de 52 kDa, la banda débil adicional a los 46 kDa podría representar la forma unglycolsylated. niveles (D) TASK-1 mRNA 48 horas después de la transfección con TASK-1 siRNA evaluada por RT-PCR cuantitativa. (E) inmunotransferencias representativas de TASK-1 en células A549 y células H358 a diferentes intervalos de tiempo después de la transfección. Los datos se muestran como la media +/- SEM de n = 3 experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
Tarea- 1 es funcional y contribuye a establecer el potencial de membrana en las células A549
con el fin de demostrar que las formas de TASK-1 canales funcionales en células de cáncer de pulmón, K
+ corrientes se analizaron en células A549. Después de la aplicación de un potencial de mantenimiento de 0 mV, que inactiva por voltaje K
+ canales, se detectó un "no inactivante" K
+ actual (I
KN) en las células A549 (Figura 2). La corriente se modula por desviaciones de pH, que muestra una disminución significativa a pH bajo y un aumento significativo a pH alto (Fig 2A). El selectivo TASK-1 inhibidor de la anandamida [16] (10 M) redujo significativamente el no inactivante K
+ actual en células A549 (Figura 2B). En consecuencia, la inhibición de TASK-1 actual por la anandamida (10 M) condujo a la despolarización importante de la membrana celular hacia valores menos negativos (Fig 2B). Cuando el no inactivante K
+ actual se analizó en las células A549 transfectadas con TASK-1 siRNA o controlar siRNA, las células transfectadas con TASK-1 siRNA mostraron una reducción significativa no inactivante K
+ actual (Figura 2C) . Estos datos muestran claramente que los canales funcionales TASK-1 están presentes en las células A549 y que una porción significativa de la no inactivante K
+ actual es llevado por TASK-1 canales. La corriente no inactivante también se redujo por la tarea-3 rutenio inhibidor rojo [17] (Fig 2D). Los efectos de la anandamida y el rojo de rutenio son aditivos (Figura 2D).
(A) grabaciones representativas de un país no inactivar K
+ actual (I
KN) en las células A549 utilizando toda la célula técnica de patch clamp en condiciones ácidas y básicas, y los gráficos que resumen la corriente media a 0 mV. I /I
0 es la corriente en presencia de baja (6,3) o alta (8,3) pH expresada como una fracción de la corriente antes del tratamiento. La corriente no inactivante se reduce bajo ácido y aumentó en condiciones básicas. (B) grabaciones representativas y un gráfico que resume el no inactivante K
+ actual (I
KN) y el potencial de membrana en reposo (
E
m) en presencia y ausencia de la tarea de un inhibidor de la anandamida 1 (Ana, 10 mM) a pH 7,3 en las células A549. I /I
0 es la corriente en la presencia de la anandamida expresa como una fracción de la corriente antes del tratamiento anandamida. La anandamida reduce la no inactivante K
+ actual y condujo a la despolarización de la membrana celular hacia valores más positivos. (C) grabaciones representativas de la no inactivante K
+ actual (I
KN) y el gráfico de barras que resume la corriente media a 0 mV en células A549 transfectadas con siRNA TASK-1 o el control de siRNA a un pH de 7,3. (D) grabaciones representativos de la no inactivante K
+ actual (I
KN) y la media normalizada actual a 0 mV en las células A549 en tratamiento con el TASK-3 bloqueador de rojo de rutenio (RR, 10 M) o rojo de rutenio junto con la anandamida (10 M) a pH 7,3. Los datos son la media +/- SEM. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control. Ana, la anandamida; RR, rojo de rutenio.
TASK-1 mediada K
+ actual es inhibida por la hipoxia
TASK-1 es conocido por ser inhibida en condiciones de hipoxia aguda por mecanismos postraduccionales [10]. Nos cultivadas células A549 en condiciones de hipoxia a fin de evaluar si la tarea-1 mediada por K
+ actual es sensible a la hipoxia en las células de cáncer de pulmón. En las células hipóxicas, una K no inactivante
+ actual fue detectable (Fig 3A), sin embargo, la corriente era más baja que en virtud de normoxia y carecían de sensibilidad a la tarea-1 inhibidor de la anandamida (Fig 3A). El no inactivante K
+ densidad de corriente en las células cultivadas en hipoxia fue significativamente menor que en las células cultivadas en normoxia (Fig 3B). En consecuencia, el potencial de membrana en reposo (
E
m) fue significativamente más positiva (despolarizado) en las células hipóxicas que en las células de normoxia (Figura 3B). El pH del medio de cultivo de células cultivadas en diferentes concentraciones de oxígeno en la densidad utilizada para los experimentos de patch-clamp se midió con el fin de aclarar si una diferencia de pH podría explicar la reducción observada de la K no inactivante
+ corriente en condiciones de hipoxia. El pH medio en el medio de cultivo celular era 7,57 (+/- 0,11) bajo normoxia y 7,85 (+/- 0,05) en condiciones de hipoxia (
P
= 0,02). El pH ligeramente superior en condiciones de hipoxia, posiblemente debido a la reducida tasa de crecimiento de las células A549 en condiciones de hipoxia [18], prefieren mejorar de reducir el TASK-1 K
+ actual, por lo tanto una diferencia en el pH no era responsable de la hipoxia inducida por la inhibición de la corriente.
(a) izquierda, grabaciones representativos de la no inactivante K
+ actual (I
KN) en células A549 cultivadas en hipoxia (1% de oxígeno) para tres días. La corriente detectable carece de sensibilidad a la tarea-1 inhibidor de la anandamida (Ana, 10 mM). Derecha, gráfica que resume la corriente media a 0 mV. (B) No inactivar K
+ densidad de corriente (I
Densidad KN; izquierda) y el potencial de membrana en reposo (
E
m; derecha) en las células A549 cultivadas en condiciones de hipoxia o normoxia. (C) la abundancia relativa de TASK-1 mRNA en células A549 cultivadas en hipoxia (1% de oxígeno) para diferentes intervalos de tiempo medidos por PCR cuantitativo. GLUT-1 y 2 hexoquinasa (HK2) fueron evaluados como marcadores de hipoxia. (D) por inmunotransferencia y la abundancia relativa de la proteína TASK-1 en células A549 cultivadas en hipoxia (1% de oxígeno) medido para diferentes intervalos de tiempo. Los datos son la media +/- SEM. *
P Hotel & lt; 0,05, ***
P Hotel & lt; 0,001, N. S., no significativo. Ana, la anandamida; HK2, hexoquinasa 2; GLUT1, familia de transportadores de soluto 2 (transportador de glucosa facilitado), miembro de 1.
La reducción de la anandamida sensible K
+ corriente en condiciones de hipoxia no es atribuible a una disminución de la TAREA-1 de expresión, ya que los niveles de ARNm no fueron inferiores, pero incluso ligeramente mayor en la hipoxia, aunque la diferencia no fue significativa (figura 3C). Curiosamente, los niveles de ARNm de TASK-1 aumentaron gradualmente con el tiempo en las células A549 sembraron en placas de cultivo y se recogieron cada 24 horas, ambos, en la hipoxia y normoxia (figura 3C). No se sabe si un aumento en la densidad celular, un posible ligero cambio en el pH, o un agotamiento de nutrientes es la causa subyacente. La expresión de GLUT-1 (
SLC2A1
, familia de transportadores de soluto 2 (transportador facilitado de glucosa), miembro de 1) y 2 hexoquinasa (
HK2
), los genes de hipoxia inducida conocidos, fue elevado en condiciones hipóxicas tratamiento (figura 3C). Del mismo modo, TASK-1 los niveles de proteína en las células A549 no fueron afectadas por la hipoxia (Figura 3D).
TASK-1 desmontables potencia la apoptosis en las células A549
Silenciado TASK-1 en A549 y en células H358 utilizando siRNA. Cuando el cisplatino fármaco citotóxico, que se sabe que induce apoptosis en células de cáncer de pulmón, se administró a las células A549, un aumento significativo en la apoptosis inducida por cisplatino se encuentra en las células transfectadas TASK-1 siRNA en comparación con las células control transfectadas siRNA (Fig 4A y 4C, la figura S1). Este efecto no se observó en células H358 (Fig 4B, S2 Fig). Del mismo modo, cuando la apoptosis fue inducida por la privación de glucosa, TASK-1 silenciamiento condujo a un aumento significativo de la apoptosis en células A549, pero no en las células H358 (Fig 4A y 4B, S1 y S2 Figs). Las células se re-chapada después de la transfección con el fin de evitar altas densidades de células, especialmente en las células no tratadas, durante el curso del experimento. Sin embargo, si se omitió re-enchapado, se observó el mismo efecto apoptosis promotoras de TASK-1 siRNA en células A549 (figura 4D). La eficacia de TASK-1 desmontables de siRNA fue menor en las células H358 que en las células A549 después de 48 horas, pero alcanzó niveles similares después de 72 horas (Figura 1E). Por lo tanto, las diferencias en la sensibilidad a la Tarea-1 siRNA no pueden explicarse por los diferentes niveles de caída.
(A, B) Las células fueron transfectadas con TASK-1 siRNA o no silenciar siRNA (siRNA control). 48 horas después de la transfección, se volvieron a sembrar las células, después de las células 24 horas adicionales fueron tratados con diferentes estímulos durante 72 horas y la apoptosis se evaluó mediante la detección de células con actividad de la caspasa 3 por análisis de FACS. Para la inducción de apoptosis, las células se trataron con cisplatino a diferentes concentraciones o con medio DMEM que contenía suero dializado y 10 mM o 0 mM D-glucosa (equilibrada con metabólicamente inerte L-glucosa). células A549 (C) se transfectaron y se trataron con diferentes concentraciones de cisplatino de la misma manera que en el panel A. La apoptosis se evaluó por tinción de las células flotantes y adherentes con colorante Hoechst. Las tasas de fragmentación nuclear se determinaron en una forma ciega. células A549 (D) se transfectaron en la misma manera que en el panel A y se trataron con diferentes concentraciones de cisplatino sin replating anterior. (A, B, D) La apoptosis se evaluó mediante la detección de células con actividad de la caspasa 3 por análisis de FACS. Los resultados son la media +/- SEM de n = 3 experimentos independientes. Grupo comparaciones se realizaron con ANOVA de dos vías seguido de un análisis post-hoc de Bonferroni. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001. ns: no significativo.
TASK-1 desmontables reduce la proliferación de células A549
Cuando se evaluó el papel de TASK-1 en la proliferación de células de cáncer de pulmón en condiciones reducida suero, nos encontrado que desmontables de TASK-1 siRNA redujo significativamente el aumento de número de células en células A549, pero no en las células H358 (Fig 5A). La tasa de mitosis, medida por la incorporación EdU, también se redujo significativamente en las células A549 tratadas con TASK-1 siRNA comparación con el control de siRNA (Figura 5B).
Las células (A) se transfectaron con TASK-1 siRNA o no -silencing siRNA (control siRNA). 48 horas después de la transfección las células se volvieron a sembrar en medio con contenido en suero reducida (1%), a fin de evitar la sobreestimulación de las células. el número de células totales se contaron cada día consecutivo en duplicados con los análisis electrónico área de pulso (CASY
®). Los resultados son la media +/- SEM de n = 3 experimentos independientes. Grupo comparaciones se realizaron con ANOVA de dos vías seguido de un análisis post-hoc de Bonferroni. (B) Las células fueron transfectadas como se ha descrito y se cultivan en medio de suero reducido-(1%) durante 48 horas. La mitosis se evaluó mediante un ensayo de captación de edu. Los resultados son la media +/- SEM de n = 4 experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001, ns: no significativo
Expresión de los efectores TASK-1 y la posible existencia. de TASK-1, Na
+ - junto transportistas, en NSCLC humano y pulmones normales
Cuando analizamos TASK-1 de expresión en el nivel de proteína en muestras de NSCLC humanos y el correspondiente tejido pulmonar normal de doce pacientes que encontraron niveles variables de expresión, tanto, en pulmones y tumores (Fig 6A). En general, los niveles de expresión no se alteró en comparación con CPNM pulmonar normal (Figura 6A). Na
+ - junto transportadores de nutrientes son los efectores putativos de TASK-1, ya que su acción depende de Na
gradientes + que sólo pueden establecerse si K
+ importación por Na
+ /K
+ - ATPasa se equilibra con K
+ - de exportación a través de K
+. Se evaluó la expresión de Na
+ - soluto co-transportadores, los miembros de la
SLC5
familia y el Na
+ - glutamina transportadores impulsados
SLC38A
1 y
SLC38A2
, en muestras humanas de NSCLC (adenocarcinoma) en comparación con el tejido pulmonar normal utilizando un conjunto de datos grande, pública publicada en el GEO (GDS3257) [11]. Encontramos el Na
+ - symporters de glucosa
SLC5A1 gratis (SGLT1) y
SLC5A2 gratis (SGLT2) que se expresa en el CPNM en un nivel similar como en el pulmón normal, donde SGLT- el transporte mediado de glucosa a través de la capa epitelial alveolar desempeña un papel importante en la glucosa de la recaptación de [19]. Sin embargo, se halló una mayor significativamente la expresión de la Na
+ /myo-inositol co-transportador
SLC5A3
, el Na
+ - transportador multivitamínico dependiente de
SLC5A6
, y de la glutamina transportador
SLC38A1 Hoteles en tumores de pulmón en comparación con lo normal (figura 6B y 6C).
SLC38A página 2 no se expresó diferencialmente (datos no mostrados).
proteínas (A) TASK-1 se evaluó en el tejido NSCLC y que corresponde pulmón no participan de doce pacientes mediante Western blot. Derecha: los valores de densitometría para TASK-1 en el CPNM y los pulmones se normalizaron a ß-actina. (B, C) los niveles de mRNA de los miembros de la
SLC5
familia de Na
+ - acoplados transportistas y de la Na
+ - impulsada transportador de glutamina
SLC38A1
se evaluaron en un conjunto de datos a disposición del público GEO (GDS3257) [11] publicada en gene Expression Omnibus (GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) en muestras de adenocarcinoma de pulmón (n = 58) y los pulmones normales (n = 49). La RMA (robusto multichip media) medida de la expresión de ARNm abundancia está en la escala logarítmica. ***
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P
. & Lt; 0,05
Discusión
La importancia de K
+ canales durante la mitosis se ha propuesto ya en la década de 1960, pero sólo recientemente K
+ canales han sido estudiados en cánceres [3]. En nuestro estudio demostramos que TASK-1 se expresa en un subconjunto de NSCLC y que TASK-1 es funcional, promueve la proliferación y la apoptosis inhibe en una línea celular de cáncer de pulmón altamente TASK-1 que expresa.
La expresión aberrante de K
+ canales se observa con frecuencia en los cánceres, sin embargo, la comprensión de su regulación y función durante la progresión del cáncer y el crecimiento es incompleta. [14].