Extracto
K-Ras dependientes no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) son 'adictos' a la autofagia basal que reprograma el metabolismo celular de una manera sensible a los lisosomas. Aquí demostramos que el TBK1 quinasa asociada xenophagy impulsa la autofagia basal, en consonancia con su requisito conocida en la proliferación NSCLC K-Ras-dependiente. Además, la autofagia basal en este contexto se caracteriza por el secuestro de la xenophagy receptor de carga Ndp52 y su paralogue Tax1bp1, que se demuestra aquí para ser un
bona fide
receptor de carga. La autofagia de estos receptores de carga promueve la señalización NF-kB no canónica. Proponemos que este mecanismo TBK1 dependiente de la señalización de NF-B contribuye a la adicción a la autofagia en K-Ras impulsado NSCLC
Visto:. Newman CA, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman M, McIver EG, Kamal A, et al. (2012) TBK1 quinasa Adicción en células de cáncer de pulmón es mediado a través de autofagia Tax1bp1 /Ndp52 y no canónica de señalización NF-kB. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10.1371 /journal.pone.0050672
Editor: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2012; Aceptado: 23 de octubre de 2012; Publicado: 29 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Newman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo en el laboratorio SW fue financiada por una beca de Reino Unido Carrera Desarrollo de la Investigación del cáncer (C20685 /A12825) en poder de SW. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Ahmad Kamal, Ed McIver y Michelle Newman son empleados de Tecnología Consejo de Investigación Médica, Lynton Casa, 7-12 Tavistock Square, Londres WC1H 9LT, Reino Unido. Médico de Investigación de Tecnología del Consejo es propietaria de una solicitud de patente (PCT número WO2010100431) sobre los inhibidores de TBK1 incluyendo MRT68601. Por tanto, estos autores pueden recibir beneficios financieros de cualquier futura explotación de esta patente. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Una estrategia destinada a la progresión del tumor es identificar vulnerabilidades moleculares específicas conferidas por los antecedentes genéticos. La activación de K-Ras por mutación, o por otros medios, hace que la proteína de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) células 'adicto' a la presencia de TBK1 (quinasa de unión TANK-1) para la proliferación y /o supervivencia [1] continuo, posiblemente a través de la estimulación directa de la actividad TBK1 [2]. TBK1 y su paralogue, IKKε, junto con las proteínas IKK y IKKβ bien caracterizados, constituyen una subfamilia de proteínas quinasas de serina-treonina [3]. TBK1 y IKKε se describieron originalmente como mediación de la activación del factor de transcripción NF-kB [4], [5], [6]. También se ha propuesto que la promoción constitutiva de NF-kappa B señalización en las células de NSCLC, aguas abajo de K-Ras, podría ser la base de TBK1 'adicción' [1]. De hecho, perfiles de expresión génica ha demostrado que un K-Ras impulsado, la firma NF-KB-como depende del gen TBK1 [1]. Sin embargo, la evidencia mecanicista para el compromiso TBK1 mediada por NF-kB en el cáncer ha sido escasa. Se han propuesto explicaciones alternativas de la adicción TBK1, tales como la activación directa de pro-supervivencia de señalización Akt quinasa [7], [8]. Sin embargo, ninguna contribución individual de TBK1 es necesariamente excluyentes entre sí con los demás.
Una segunda vía dedica aguas abajo de la activación de K-Ras se macroautofagia (autofagia en adelante) [9], [10], [11]. La autofagia es un proceso de múltiples pasos degradación lisosomal [12]. En las primeras etapas, dependiendo de la acción de los genes autofagia básicas como
ATG5
y
ULK1
, vesículas de doble membraned decoradas con proteínas tipo ubiquitina de la familia /GABARAP LC3, llamados autofagosomas, se empiezan a formar. Estos autofagosomas nacientes encierran alrededor, y secuestrar, citosol a medida que maduran. Dependiendo del contexto, esto puede ser un proceso no selectivo o selectivo, este último secuestro que implica de poblaciones discretas, o "cargas ', de orgánulos, proteínas u otras estructuras, tales como bacterias en el caso de" xenophagy'. La selectividad es mediada a través de receptores de carga que enlazan proteínas LC3 /GABARAP a la carga, en complejos multi-moleculares presuntos [12]. impactos autofagia sobre el destino celular por tanto este secuestro selectivo de complejos de carga desde el citosol a través de y posterior degradación lisosomal de los contenidos de autophagosome, que libera metabolitos en el citosol. Este último paso es inhibida por fármacos lisosomotróficos tales como cloroquina. Tales compuestos son una clase potencial de agentes para la manipulación terapéutica de la autofagia [11], [13].
El papel de la autofagia en respuesta aguda a Ras mutación no está claro. Se ha demostrado para actuar como un efector de la supervivencia, la muerte celular o senescencia [9], [14], [15]. Sin embargo, la autofagia basal continua es inequívocamente requiere para la proliferación y /o supervivencia de células de cáncer impulsado K-Ras establecidos [10], [11], [13]. Un papel de la autofagia aquí es la regulación directa del metabolismo celular, a través de la homeostasis mitocondrial, control de calidad de proteínas y /o remodelación de la piscina metabolito celular. Acumulativamente, estos mecanismos regulan el equilibrio entre la fosforilación oxidativa y la glucólisis aeróbica [10], [11], [13]. Algunos de estos mecanismos son dependientes de la degradación lisosómica, como se muestra por la sensibilidad de los efectos metabólicos a agentes lisosomotróficos tales como cloroquina. Sin embargo, no se ha abordado cómo autofagia se dedica aguas abajo de K-Ras. Además, no está claro si la autofagia 'adicción' se puede explicar solamente por efectos metabólicos directos o si el secuestro de proteínas específicas modula destino de la célula, a través de la alteración de la transducción de señales dentro de la célula.
Curiosamente, TBK1 ha sido implicado en la autofagia de citosólica
Salmonella spp.
de bacterias dentro de las células [16]. La nueva proteína de unión a TBK1-y el receptor de carga xenophagy, Ndp52, reconoce las proteínas ubiquitinated, en la superficie de las bacterias, y las proteínas de unión a carbohidratos en las vesículas de acogida rotura [17], [18]. Un paso no redundante en esta vía ha sido recientemente demostrado ser la fosforilación TBK1 mediada de un nuevo receptor de más carga, Optineurin [16]. La relevancia de las afueras de xenophagy señalización TBK1 no está claro. Sin embargo, se muestra aquí que la autofagia basal, con algunos paralelismos con xenophagy y que resulta en la rotación de los receptores de carga tales como Ndp52 y la proteína paralogous Tax1bp1, está constitutivamente participado en las células NSCLC TBK1-adicto por la actividad quinasa de TBK1. Demostramos un papel central para este autofagia en la conducción no canónica de señalización NF-kB mediada por el factor de transcripción RelB. Proponemos que esta vía complementa mecanismos metabólicos directos en la contribución de la autofagia basal de apoyar la proliferación y /o supervivencia de células de NSCLC. Nuestros resultados amplían el papel de la adicción a la autofagia en el cáncer impulsado K-Ras y muestran la interacción mecánica con la vía TBK1-NF-kB.
Resultados
autofagia en K-Ras células dependientes del cáncer de pulmón está aguas abajo de la quinasa TBK1
Para investigar el papel de TBK1 en K-Ras autofagia basal impulsado hemos desarrollado un modelo de cultivo de NSCLC en las células A549 K-Ras 'adictas' [1]. Se encontró que el citosol de estos contenía estructuras punteadas abundantes que etiquetados con proteína de fusión GFP-LC3B, pero no con lípidos unconjugatable GFP-LC3BΔG- & gt; A (Fig. 1a). La abundancia de puntos lagrimales GFP-LC3B fue elevado dramáticamente por tratamiento con cloroquina (Fig. 1a). De acuerdo con la metodología del campo [19], después cogimos estos puntos lagrimales LC3B para representar un valor basal, el nivel de estado estacionario de autofagosomas. Estos autofagosomas estaban ausentes cuando se utilizó ARNi para derribar la autofagia genes
ATG5
y
ULK1 gratis (Fig. 1b-d). RNAi de
TBK1
produce efectos similares, el posicionamiento de esta quinasa aguas arriba de la abundancia autophagosome basal (Fig. 1b-d). Hemos ampliado estos hallazgos a través de ensayos de flujo de la autofagia en combinación con un miembro de una familia recientemente descrita de inhibidores enzimáticos de TBK1 (MRT68601, en lo sucesivo, TBKi, Fig. S1) [20]. tratamiento con el inhibidor de las células LC3B tándem fluorescente A549 [21] dio lugar a la reducción tanto de la autofagia temprana ( "verde + rojo ') y puntos lagrimales LC3B autofagosomas finales de los ácidos (puntos lagrimales" rojo ") (Fig. 1e, f). En consecuencia, la acumulación de cloroquina mediada de lipidada LC3B-II o GABARAP-II, la forma de estas proteínas se correlacionó con la formación de autofagosomas, fue impedida por el tratamiento con inhibidor (Fig. 1 g). Tomados en conjunto, estos datos muestran que TBK1 quinasa de hecho promueve la autofagia, que actúa en la etapa temprana de la formación de autofagosoma, en lugar de reprimir la maduración autofagosoma en el compartimento lisosomal ácida [19].
A549-GFP o GFP-LC3B LC3BΔG - & gt; a las células se trataron con PBS o 5 cloroquina mu M (CQ) durante 8 h y las células fotografiado para GFP. b, c) células A549-GFP LC3B fueron transfectadas con siRNA se indica durante 72 h (
NTC
= control sin focalización) y b) los extractos celulares se transfirieron las proteínas indicadas (α-bañera = α-tubulina) o Las células fueron c) fotografiado por los puntos lagrimales GFP-LC3B. d) células A549 FLAG-HA-LC3B fueron transfectadas con indicado siRNA y puntos lagrimales HA-positivo inmunotinción, fotografiado y se contaron a las 72 h (n = 3, ± S.E.M., * = p & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01). e, f) A549 tándem fluorescente-LC3B (células tfLC3B) fueron tratados con DMSO o 1 M MRT68601 (TBKi) durante 24 h, y e) la imagen y f) cuantificaron para el número total de puntos lagrimales autofagia (verde + rojo) y el subconjunto de estos puntos lagrimales con la señal indetectable GFP (rojo), como se describe en detalle en Materiales y Métodos. ) células A549 g se trataron con DMSO o 10 mM MRT68601 (TBKi) durante 24 h en presencia o ausencia de PBS o 5 M (CQ) cloroquina y extractos celulares borrados para las proteínas indicadas. Las barras de escala = 50 micras de todos los paneles.
Basal La autofagia se dirige a los receptores de carga y Ndp52 Tax1bp1
autofagia bacteriana (xenophagy) está mediada a través de TBK1 y sus compañeros de unión, la carga xenophagy receptores Ndp52 y Optineurin [16], [18]. En paralelo a esto, encontramos reclutamiento de Ndp52, y el Ndp52 paralogue Tax1bp1, a autofagosomas basales en células A549 (Fig. 2a, c). Se demostró además un complejo constitutiva Ndp52-TBK1 y confirmó un informe anterior que Tax1bp1 podría obligar TBK1 [22] (Fig. S2a, b). Estos datos implican que Ndp52 y Tax1bp1 pueden estar siendo objeto de secuestro por autofagia basal. En consecuencia, tratamiento con cloroquina estabilizado Tax1bp1 similar a un control positivo, el receptor de carga p62 (Fig. 2b), y concomitante con el aumento de la localización Tax1bp1 a vesículas LC3B-positivos (Fig. 2c). proteínas tipo ubiquitina de las subfamilias LC3 y GABARAP son capaces de unirse Tax1bp1, con diferentes afinidades (Fig. 2d). Esto sugiere que Tax1bp1 es, como, Ndp52, un
de buena fe
proteína del receptor de carga. Más apoyo a esta conclusión proviene de la observación de que la supresión de los motivos de unión a LC3 putativo de la familia /GABARAP en Tax1bp1 ablación de la localización de autofagosomas (Fig. 2e). Estos motivos incluyen tanto un LIR motivo (región LC3-interactuando) 'canónica' (W49, V50, G51, I52) y un "no canónica LIR 'motivo, este último inferida de la descrita recientemente por Ndp52 unión a LC3C (L141, V142, V143) [23] (Fig. 2e, también ver alineaciones en la Fig. S2c). En consonancia con el papel de TBK1 en los procedimientos anteriores, la proteína TBK1 También se mostró para localizar a autofagosomas basales (Fig. 2F).
A549 células GFP-LC3B se tiñeron para Ndp52 y la imagen. b, c) las células A549 fueron tratados con PBS o 5 cloroquina M (CQ) durante la noche y b) los extractos celulares se transfirieron las proteínas indicadas (α-bañera = alfa tubulina) o c) las células co-manchada por un Tax1bp1 y LC3B, y la imagen de microscopia confocal. d) 293FT células fueron transfectadas con vector de expresión de myc-TAX1BP1, o el control de vector vacío, y los lisados sometidos a desplegable con proteína de fusión indicada, tal como se describe en Materiales y Métodos (- = GST solamente, B = GST-LC3B, C = GST-LC3C, G = GST-GABARAP). e) las líneas celulares A549 FLAG-HA-TAX1BP1 expresan de forma estable las variantes indicadas de proteína Tax1bp1 (ver texto) se trataron con 5 mM de cloroquina durante la noche y se tiñeron para HA puntos lagrimales. f) Se obtuvieron imágenes de las células A549-GFP TBK1 mCherry-LC3C (las flechas indican la colocalización). Las barras de escala = 25 micras de todos los paneles.
TBK1 Drives no canónica de señalización NF-kB por autofagia El secuestro de Ndp52 y Tax1bp1
A continuación la hipótesis de una relación entre la autofagia TBK1 impulsada y basal de señalización NF-kB. canónicas localización nuclear de NF-kB vía subunidades c-Rel o de RelA no era detectable en la línea celular A549 (p53 de tipo salvaje), pero la localización nuclear basal de la subunidad vía no canónica RelB fue detectable (Fig. S3). RelB localización nuclear era dependiente de la actividad de quinasa TBK1 como se muestra por la pérdida de tinción nuclear RelB (Fig. 3a, b) o la pérdida de residencia en la fracción nuclear (Fig. 3c) tras el tratamiento con inhibidor de TBK1. Tax1bp1 previamente se ha demostrado que inhibe la señalización de NF-kappa B canónica por nucleación de un complejo de edición de ubiquitina para canónicas reguladores NF-kB y TRAF6 RIP1 [24]. Sin embargo, informes contradictorios han demostrado un efecto potenciador NF-kB, aunque aguas abajo de la desregulación de la función Tax1bp1 por el Impuesto oncoproteína viral [25]. Se encontró que el ARNi de
ATG5
,
ULK1
,
TBK1, TAX1BP1
o
NDP52
inhibida RelB localización nuclear (Fig. 3d-f), lo que implica que una consecuencia aguas abajo de Tax1bp1 y Ndp52 por el secuestro de la autofagia es el compromiso de no canónica NF-kB. El tratamiento con el inhibidor de la autofagia compuesto 3-MA (adenina 3-metil) también se realiza la ablación RelB localización nuclear, más el apoyo a estos hallazgos (Fig. 3g). No está claro si la degradación de la autofagia de cargos en los lisosomas, o la mera captura de autofagia de la carga, se requiere para la señalización RelB. Mientras E64d /pepstatina A tratamiento no tuvo efecto inhibidor sobre RelB de localización nuclear, un efecto pequeño pero significativo se observó con dosis altas de cloroquina y un marcado efecto inhibidor se observó con bafilomicina A1 (Fig. S4). Para confirmar la observación de que la autofagia promueve la actividad RelB, se evaluaron los cambios en la transcripción de genes. Los análisis de los posibles genes diana RelB demostraron que
BIRC3
niveles de mRNA fueron fuertemente downregulated por la inhibición RelB (Fig. 3 h, i). Es importante destacar que el ARNi de
ATG5
,
ULK1
,
TAX1BP1
y
TBK1
parecida downregulated
BIRC3
mRNA (Fig. 3J) .
células A549 se trataron durante la noche con DMSO o 10 mM MRT68601 (TBKi) y a) se tiñeron para RelB (barra de escala = 50 m), la localización nuclear cuantificado en b) (n = 3, ± SEM, * * = p & lt; 0,01) o c) extractos nucleares preparados y borrados para las proteínas indicadas. d-f) las células A549 fueron transfectadas con siRNA se indica (
NTC
= no director de control) durante 72 h y e) los extractos celulares se transfirieron las proteínas o los indicados d, f) las células se tiñeron y se cuantificaron por RelB nuclear (n = 3, ± SEM, * = p & lt; 0,05). ) células A549 g se trataron con PBS o 10 mM 3-metiladenina (3-MA) durante 24 horas y después se tiñeron y se cuantifica para RelB nuclear (n = 3, ± S.E.M., *** = p & lt; 0,005). h, i) las células A549 se infectaron con lentivirus indicada y, a las 72 h después de la infección, h) los extractos de células se transfirieron las proteínas indicadas o i) ARN total cuantificados para
BIRC3
mRNA (n = 3; ± SD) . j) las células A549 fueron transfectadas con siRNA se indica durante 72 h y extractos de ARN total se sometieron a QRT-PCR para
BIRC3
mRNA (n = 3; ± S.D.). k) Las células A549 se infectaron con lentivirus indicada y en 120 h el número de células después de la infección cuentan como se describe en Materiales y Métodos (n = 3, ± SEM, * = p & lt;. 0.05)
RelB Actividad contribuye a TBK1 y la autofagia 'Addiction'
confirma observaciones anteriores [1], [11] que el silenciamiento crónica de
ATG5
o
TBK1
, por la orientación shRNA lentiviral, dado lugar a una disminución del número de células en células A549, al igual que el ARNi de
KRAS gratis (Fig. S5a-f). Es importante destacar que, lentiviral ARNi de
RELB también llevó a
marcada reducción en el número de células (Fig. 3k). Esto sugiere TBK1- y regulación de la autofagia mediada por RelB puede, al menos en parte, la base de TBK1- y la autofagia-adicción.
La autofagia y Ndp52 /Tax1bp1 mediada RelB de señalización puede ser independiente de Optineurin y Tax1bp1 no promueve canónica NF-kB señalización:
en las células A549, el otro receptor de carga autofagia previamente implicado en la función TBK1, Optineurin [16], parece tener una participación limitada en la señalización RelB. Sólo hay una pequeña, aunque significativa, reducción en RelB localización nuclear en
OPTN
RNAi (Fig. 4a, b). Sin embargo, estos resultados no excluyen un papel para Optineurin en diferentes fondos genéticos o bajo condiciones de estrés, y estas posibilidades se tratan en el trabajo futuro. En las células A549, el papel de Tax1bp1 en la promoción de la señalización de NF-kappa B también es específico de la nueva vía autofagia-RelB describe en este documento. La estimulación de la señalización de NF-kB canónica mediante tratamiento TNFa, según la evaluación de la localización nuclear de Rela no es perturbado por
TAX1BP1
ARNi, al menos en la medida en que no se observa reducción de la translocación nuclear de TNFa inducida (Fig. 4c , d). Así, el papel estimulador de Tax1bp1 en NF-kappa B parece ser específica para la señalización RelB no canónica. Sin embargo, es importante señalar que este ensayo no aborda el papel inhibitorio ya bien descrito de Tax1bp1 de la duración y magnitud de NF-kappa B canónica de señalización [24].
células A549 fueron transfectadas con siRNA indicada (
NTC
= no director de control) durante 72 h y a) extractos de células borrado para las proteínas indicadas o b) células de manchado y cuantificado para RelB nuclear (n = 3, ± SEM, * = p & lt; 0,05) . C, D) células A549 fueron transfectadas con siRNA se indica (
NTC
= no director de control) y se estimularon con 5 ng /ml de TNF-α durante 3 h y c) manchadas y d) cuantificado RELA nuclear ( n = 3, ± SEM). Barra de escala = 25 micras.
RelB activación por autofagia y Ndp52 /Tax1bp1 también se observa en las células NSCLC, K-Ras-dependiente p53 mutado
Se ha propuesto que, en líneas de NSCLC p53 mutado, tales como NCI-H23, la señalización canónica basal NF-kappa B es mucho mayor que en las líneas de tipo salvaje de p53, tales como A549. Sin embargo, al menos en NCI-H23, todavía encontramos el compromiso constitutiva de señalización RelB, depende de la función de la autofagia basal, lo que sugiere que la señalización de NF-kB no canónica y canónico basal puede ser coincidente (Fig. 5a-e). Específicamente, se encontró que las células NCI-H23 tenían autofagia constitutivo, tal como se evaluó con proteína marcadora LC3 tándem-fluorescente, que se downregulated por
TBK1
RNAi (Fig. 5a-c), y que la localización nuclear constitutiva de RelB en esta línea celular fue sensible a la inhibición mediada por ARNi de
TBK1
,
ATG5
,
NDP52
o
TAX1BP1 gratis (Fig. 5d, e) .
células NCI-H23 fueron transfectadas con siRNA se indica (CNT = no director de control) durante 72 h y a) los extractos celulares se transfirieron las proteínas indicadas. b, c) células LC3B tándem fluorescente NCI-H23 fueron transfectadas con siRNA se indica y se analizaron como se describe en Materiales y Métodos. d, e) las células NCI-H23 fueron transfectadas con siRNA se indica durante 72 h y las células fueron d) teñidas y e) cuantificado para RelB nuclear (n = 3, ± SEM, * = p & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01) . Barra de escala = 50 micras de todos los paneles.
Un modelo para el compromiso de RelB basal de señalización en K-Ras dependientes de las células del cáncer de pulmón
Los datos presentados en este manuscrito al plomo formulación de la siguiente modelo (Fig. 6). Mientras que la actividad de los receptores de carga unión TBK1-Optineurin, Ndp52 y, potencialmente, Tax1bp1, impulsa la autofagia de las células bacterianas durante xenophagy, un secuestro de autofagia TBK1 mediada similar de Tax1bp1 y Ndp52 es impulsado por la autofagia basal en las células NSCLC K-Ras-dependientes . Esto conduce a la participación de la señalización y la proliferación celular y /o supervivencia no canónica NF-kB. Ya sea TBK1 también regula la función directa, lisosomal de la autofagia en el metabolismo celular es desconocida; También queda por abordar si este papel de la autofagia es disociable de forma experimental el secuestro selectivo de Tax1bp1 y Ndp52. De manera mecánica, sino que también no está claro cómo TBK1 impulsa la autofagia. Sin embargo, como este manuscrito se encontraba en la etapa final de revisión, el grupo de Deretic publicó que la fosforilación de la función del receptor autofagia general y facilitador de la biogénesis autofagosoma, p62 /SQSTM1, en el dominio de unión a ubiquitina (UBA), puede estar implicado en un nuevo papel para TBK1 en la inanición inducida por la autofagia [26], [27]. De hecho, los resultados iniciales de este laboratorio sugieren que las células A549 tienen p62 fosforilada, basales que se redujo en abundancia por el tratamiento TBKi (Fig. S6).
Véase el texto para una discusión detallada. Ub = ubiquitina.
Discusión
La autofagia es un proceso multifacético, la promulgación de los cambios en el destino celular por parte de ambos mecanismos no selectivos y selectivos [12]. Es probable que el compromiso de la autofagia en células de cáncer actúa directamente sobre tanto el metabolismo de [10], [11], [13] y la señalización celular, en una respuesta integrada. Es tentador especular que xenophagy está acoplado a una respuesta de señalización inmune innato a través de no canónica NF-kappa B, y este mecanismo es simplemente aberrante enganchada por la autofagia oncogén impulsada en células de NSCLC. El papel de TBK1 en la conducción de la autofagia también puede explicar por qué la autofagia se dedica, a pesar de la actividad de mTOR basal alta predicho, en las células NSCLC. Mecánicamente, la fosforilación p62 puede jugar un papel en este proceso [26]. Sin embargo, se especula que TBK1 es una quinasa promiscua con numerosos sustratos, y predecir que p62, y de hecho Optineurin (adyacente a LIR motivo) fosforilación [16], representan sólo un subconjunto de los objetivos funcionalmente relevantes de TBK1 en la autofagia. Por lo tanto, es posible que diferentes sustratos de acto TBK1 en diferentes etapas de la autofagia, ya sea en los primeros pasos, ya que nuestros datos sugieren, o en las etapas de maduración posteriores, como se ha propuesto recientemente [26].
En general, la señalización de NF-kB se ha pensado que se encuentran aguas arriba de la autofagia [28], [29], [30]. Sin embargo, recientemente se ha propuesto la regulación directa de la señalización de NF-kB canónico por la autofagia. planteó la hipótesis de mecanismos han incluido el secuestro de p62, I? B, NEMO o Bcl10 [31], [32], [33], [34], [35]. La diversidad de los mecanismos de acción de la autofagia ilustra las diversas funciones de este proceso; Aquí añadimos otro mecanismo de regulación de NF-kappa B, esta vez en la regulación de la vía RelB no canónica. Recientemente, la actividad aberrante RelB se ha identificado en los tumores de pulmón, encajando con nuestro modelo [36]. Sin embargo, p53 de tipo salvaje NSCLC también puede depender, en cierta medida, al canónica NF-kB de señalización [37], [38]. De hecho, las células A549 (p53 de tipo salvaje) son dependientes de la actividad de c-Rel para la proliferación y la supervivencia [1]. Esto no es mutuamente excluyente con nuestros resultados; una cantidad indetectable de nuclear c-Rel podría ser necesaria para la proliferación /supervivencia, junto con RelB. De hecho, el contexto de p53 mutado NSCLC, donde el compromiso de la señalización de NF-kB canónica es mucho más evidente [39], será un buen escenario para diseccionar dicha interacción. Curiosamente, se ha demostrado en este manuscrito que en al menos algunas líneas de células con la mutación de p53, y reportado prominente basal canónica de señalización NF-kappa B (por ejemplo, NCI-H23), que basal, la localización nuclear RelB autofagia guiado puede ser detectada, no obstante. Las investigaciones futuras de los cargamentos traídos a la autofagia autophagosomal membranas por Tax1bp1 y Ndp52, ubiquitinated o de otra manera, también arrojará luz sobre el mecanismo por el cual estos receptores de carga están implicados en la mediación de la señalización de NF-kB no canónica. experimentos proteómicos para determinar la identidad de estas cargas están en marcha en nuestro laboratorio.
Dado el interés en el desarrollo de inhibidores TBK1 para el tratamiento del cáncer, tenemos que entender en detalle las consecuencias de la pérdida de la vía se describe aquí. En el
in vivo
entorno, los efectos de la regulación de la autofagia y RelB TBK1 son poco probable que sea completamente autónomo de la célula, dado el papel bien establecido de señalización NF-kB en el control de la comunicación celular y la inflamación. Curiosamente,
TAX1BP1
podrán regular la génesis tumoral intestinal en modelos de ratón de cáncer [40]. Además, la línea germinal
TAX1BP1
knockout ratones muestran un fenotipo inflamatorio de órganos específicos [41]. Es posible que estas observaciones pueden estar relacionados con el papel para Tax1bp1 describe aquí o, alternativamente, al papel se describe mejor en la represión de canónica NF-kB de señalización [24]. Por último, la orientación de la autofagia También se propone como medio de tratamiento del cáncer, al menos en algunos fondos genéticos. Los datos aquí presentados sugieren precaución en la extrapolación de los resultados de la inhibición de la autofagia genética apuntando a la formación autofagosoma y secuestro, a la acción de los fármacos que se dirigen a la función lisosomal, como la cloroquina, inhibidores de la proteasa o bafilomycin A1. No está claro que los agentes de este tipo afectarán a todos los cambios, como la actividad de NF-kB, que la orientación de las etapas iniciales de la autofagia voluntad y
viceversa
.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y plásmidos
Todas las células se cultivaron en DMEM (Sigma) + 10% de FCS (Sigma) por debajo del 5% de CO2 a 37 ° C. células HEK293FT eran de Invitrogen. Las células A549 utilizados se obtuvieron del Instituto de Investigación del Cáncer (Londres, Reino Unido) y la identidad verificada por microsatélite genotipado (Agencia de Protección de la Salud, Reino Unido). células NCI-H23 fueron comprados directamente de la ATCC. Se derivatizan las células A549 y NCI-H23 para expresar Ecotropic receptor utilizando Pecor-neo y selección en G418. Retrovirus para hacer infectantes estables fue generada en las células Phoenix-Eco por técnicas estándar. Estos virus fueron: pBabe GFP-LC3B puro [42]: rata LC3B ADNc fusionado al extremo N-terminal de GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- & gt; A Puro: por encima de la proteína truncada plásmido que codifica por lo que C-ter Gly expuesta por el procesamiento de C-terminal por Atg4 es constitutivamente expuestos. Gly Esta ter-C está mutado a Ala pBabe tfLC3B puro:. PBabe puro con el tándem LC3B fluorescente [21] clonado en NheI (romo) /SaII en SnaBI /SalI sitio. pWZL GFP-TBK1 HIGRO: pWZL GFP DEST IRES HIGRO vector (sin publicar) con TBK1 de longitud completa fusionado al extremo C-terminal de GFP mediante recombinación con pDONR 223 TBK1 (no publicado) por la tecnología Gateway (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: pBabe cereza DEST vector BLAST (sin publicar) con LC3C de longitud completa fusionado al extremo C-terminal de mCherry por recombinación con pDONR 223 LC3C [43] por la tecnología Gateway (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Como se describe en la literatura {Behrends 2010 No. 4}. MSCV FLAG-HA- TAX1BP1 (WT y mutantes LIR): TAX1BP1 cDNA fue clonado en pDONR 223 por técnicas de clonación de puerta de enlace estándar utilizando pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1 (abajo) como plantilla. TAX1BP1 cDNA fue entonces de puerta de enlace clonado en MSCV NTAP IRES PURO [43]. La mutagénesis dirigida se realizó en pDONR antes de la recombinación en MSCV NTAP IRES PURO para producir ADNc que codifica TAX1BP1 con mutaciones en el putativo motivo canónico o no canónico LIR (mutaciones, como se describe en el texto). Todos los ADNc mutados fueron totalmente secuenciados
Otros plásmidos utilizados en este estudio fueron:. PcDNA 3.1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 ADNc de longitud completa (NCBI isoforma 1) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores de un clon de imagen y clonado BamHI-XhoI en pCDNA 3.1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG TCA TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC TTT CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC y CTC GAG CTA GTC AAA ATT ATT TAG AAC CTG ATC AAA ATG GGT C. el ADNc resultante codifica la variante de esta proteína 307I (polimorfismo). vector pDEST15 vacío (para la expresión de la proteína de control GST): creado por la inserción de una parada en marco que contiene el codón casete en pDEST15 por Gateway clonación de un plásmido pDONR223 especialmente construido. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C y pDEST15-GABARAP (para la expresión de proteínas de fusión GST) se crearon por recombinación con pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C o pDONR 223 GABARAP [43] por la tecnología Gateway (Invitrogen).
Productos Químicos
p> cloroquina
Los anticuerpos
Los anticuerpos utilizados en este estudio son las siguientes:. (Monoclonal AOW9 conejo, Millipore) TBK1, fosfo-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), ATG5 (por ATG5-12, policlonal de conejo, señalización celular Tecnología), ULK1 (policlonal de conejo A705, señalización Cell Technology), LC3B (inmunotransferencia, D11 monoclonal de conejo, señalización celular Tecnología), LC3B (inmunofluorescencia, ratón monoclonal 2G6, Nanotools), GABARAP (policlonal de conejo Ap1821a, Abgent), ERK (conejo policlonal 9102, señalización Cell Technology), RelB (monoclonal C1E4 conejo, señalización celular Tecnología), histona H3 (H3, ratón monoclonal 6-6-2 , Millipore), Tax1bp1 (conejo poli HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (ab68588 poli conejo, Abcam), p62 (ratón 3 /p62 monoclonal, BD Pharmingen), etiqueta myc (Rata JAC6 monoclonal, AbD Serotec [experimentos TBK1 coIP] o monoclonal de ratón 4A6, Millipore [experimentos desplegables GST]), c-Rel (policlonal de conejo, 4727, señalización Cell Technology), de RelA (C22B4 monoclonal de conejo, señalización celular Tecnología), α-tubulina (ratón monoclonal DM1A, Sigma), HA ( 3F10 monoclonal de rata, Roche), GST (GST-2 monoclonal de ratón, Sigma), Optineurin (conejo policlonal Nr. 100000, Cayman Chemical), K-Ras (ratón monoclonal 3B10-2F2, Sigma). Anti-fosfo-S403-p62 fue una especie de regalo de Nobuyuki Nukina (RIKEN, Japón). fosfato anticuerpos específicos a IRF3, de RelA y JNK se obtuvieron de señalización Cell Technology.
siRNA transfección
En placas de 35 mm, 0,8 × 10
5 A549 o 1,2 × 10
5 NCI-H23 se cultivaron durante la noche. Las células fueron transfectadas durante 8 h con Oligofectamine (Invitrogen) y 10 nM siRNA (A549) o 20 nM siRNA (NCI-H23), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.