Extracto
cáncer de tiroides-1 (CT-1), una proteína nativa desordenada, es ampliamente expresada en los vertebrados y sobreexpresa en muchos tipos de tumores. Sin embargo, su función exacta y el mecanismo de regulación en el cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM) aún no están claros. En el presente estudio, encontramos que el TC-1 es altamente expresado en NSCLC y que su expresión aberrante está fuertemente asociada con la proliferación de células de NSCLC. Exógenos TC-1 sobreexpresión promueve la proliferación celular, acelera la transición de células-G1 a la fase S, y reduce la apoptosis en NSCLC. La caída de TC-1, sin embargo, inhibe la proliferación de células NSCLC, transición del ciclo, y la resistencia a apoptosis. Además, también hemos demostrado que PD173074, que funciona como un inhibidor de la TC-1 en el CPNM, disminuye la expresión de TC-1 e inhibe la TC-1 la proliferación celular mediada por la sobreexpresión
in vitro
y
en
vivo. Sin embargo, la función de inhibición de PD173074 en la proliferación celular NSCLC fue eliminado en las células con TC-1 desmontables. Estos resultados sugieren que PD173074 juega un papel significativo en la sobreexpresión mediada 1 TC-proliferación de células NSCLC y puede ser un objetivo potencial de intervención para la prevención de la proliferación celular en NSCLC
Visto:. Lei J, Li W, Yang Y , Lu Q, Zhang N, Bai G, et al. (2014) TC-1 sobreexpresión promueve la proliferación celular en humanos de células no pequeñas cáncer de pulmón que puede ser inhibida por PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10.1371 /journal.pone.0100075
Editor: Philip C. Trackman, Universidad de Boston Escuela de Medicina Dental Goldman, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2014; Aceptado: 21 de mayo de 2014; Publicado: 18 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Lei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las principales causas de morbilidad en todo el mundo. En 2013, se estima que aproximadamente 228.190 nuevos casos que se producen en los Estados Unidos, que representan el 13,74% de todos los nuevos casos de cáncer. Aún más inquietante, a pesar del uso de un tratamiento de múltiples modalidades, incluida la gestión quirúrgica, quimioterapia, y radioterapia, el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de mortalidad por cáncer en hombres y mujeres; De hecho, aproximadamente 159.480 pacientes mueren a causa de enfermedades relacionadas con el cáncer de pulmón en los Estados Unidos [1]. Por lo tanto, se requieren urgentemente nuevas terapias que surgen de una mejor comprensión de los reguladores moleculares de crecimiento del tumor. En los últimos años, muchos biomarcadores que están implicados en la progresión del cáncer de pulmón se han investigado, pero pocos estudios han evaluado las funciones de TC-1 en el desarrollo del cáncer de pulmón.
TC-1 se clonó originalmente a partir de la sustracción la hibridación entre un carcinoma papilar de tiroides y su tejido tiroideo normal circundante [2]. Se expresa de forma ubicua en una amplia gama de vertebrados con el más alto de conservación a través de especies se centraron en el marco de lectura abierto (ORF). Su expresión ubicua y conservación de la secuencia sugieren que TC-1 puede desempeñar un papel importante en la biología celular [3]. Codifica una proteína de 106 aminoácidos sin un dominio funcional identificado, lo que indica que la proteína TC-1 es un miembro del grupo de la proteína nativa desordenada que se ha demostrado para realizar funciones fundamentales en el control del ciclo celular, la proliferación, la metástasis, y de transducción de señales [3], [4]. Un creciente número de estudios han demostrado que la TC-1 es altamente expresado en varios carcinomas, y su expresión aberrante fue implicado en la proliferación de células normales y cancerosas [5] - [9]. Margaret Sunde y col. confirmó que TC-1 es una proteína tumorigénico novela asociado con el cáncer de tiroides y se encontró que la sobreexpresión de TC-1 en las células normales de la tiroides aumentó su tasa de proliferación, mejora su crecimiento independiente de anclaje en agar blando, y la disminución de su tasa de apoptosis [3] . TC-1, que se encuentra en la región genómica del cáncer de mama sensible (8p
11-12), se encontró que se upregulated significativamente en líneas celulares y tejidos de cáncer de mama humano que implicaban a esta proteína en el desarrollo del cáncer de mama [8]. En el cáncer gástrico, TC-1 se encontró que era uno de los genes regulados positivamente en ambas líneas celulares y tejido de carcinoma, y su expresión se correlaciona fuertemente con casi todas las variables clinicopatológicas de comportamiento agresivo biológico de los cánceres, incluyendo el tamaño, etapa avanzada, y pobres la supervivencia [10], [11]. Sin embargo, el nivel de expresión y la función biológica de la CT-1 en el CPNM han Hasta ahora no se han dilucidado.
Recientemente, Olivier Pardo E. et al. informaron de que el receptor de factor de crecimiento de fibroblastos selectiva (FGFR) inhibidor de bloques PD173074 la proliferación y el crecimiento clonogénico de dos líneas de células pequeñas de pulmón de células de cáncer (H69 y H510) de una manera dependiente de la dosis y evita quimiorresistencia inducida por FGF-2. Sorprendentemente, en xenoinjertos de H510, el crecimiento tumoral se vio afectada con el tratamiento PD173074, lo que resulta en un aumento de la mediana de supervivencia en comparación con el control de animales tratados con placebo, de manera similar al efecto observado con la administración de un solo agente de cisplatino; en H69 xenoinjertos, PD173074 indujo una respuesta completa que duró al menos 6 meses en el 50% de los ratones. Además, el efecto del cisplatino se potenció significativamente por su coadministración con PD173074. Estos efectos fueron explicados por el hallazgo de que el tratamiento PD173074 disminución de la proliferación intratumoral y el aumento de la apoptosis de células con una alta aparición del marcador de la muerte celular apoptótica caspasa-3 [12]. Estos alentadores resultados promueven una mayor investigación del efecto de PD173074 en células de NSCLC.
Para estudiar el papel de TC-1 en la proliferación celular y para evaluar el efecto de PD173074 en la proliferación celular mediada por TC-1, en este estudio, se investigó la relación entre el TC-1 de expresión y la proliferación celular en el CPNM mediante técnicas de inmunohistoquímica, y el efecto de PD173074 en la proliferación de células TC-1 mediada por el uso de una serie de
in vitro
y
In vivo
pérdida de la función y los estudios de ganancia de función.
Materiales y Métodos
2.1 Ética Declaración
el estudio en humanos fue aprobado por el hospital Tangdu Comité de Ética institucional, y el estudio de investigación se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki de 2008. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio.
Todos los estudios con animales se realizaron con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del hospital Tangdu.
2.2 la inmunohistoquímica y Evaluación
Inmediatamente después de la extirpación quirúrgica, las muestras de 122 pacientes con CPNM fueron disecados por los patólogos y snap-congelado en el líquido nitrógeno. Las muestras de cáncer se recogieron desde el centro de los nódulos, y las muestras normales se obtuvieron de un área de 5 cm de distancia de los nódulos. Cada una de las muestras se fijaron con paraformaldehído al 4% y embebidas con parafina. Los tejidos se cortaron para obtener secciones 4-micras de espesor, y las secciones fueron desparafinados con una serie de xileno y rehidratada a través de una serie graduada de alcohol. la recuperación de antígenos de microondas se realizó a 750 W durante 10 minutos en tampón de citrato (pH 6,0) para mejorar la inmunorreactividad. La actividad de la peroxidasa endógena de las secciones se bloqueó con 3% de peroxidasa de hidrógeno durante 30 min, y las secciones fueron incubadas con suero normal de cabra al 5% en PBS durante 30 min a 25 ° C para bloquear cualquier reacción anticuerpo no específica. Las secciones se lavaron tres veces con PBS durante 10 min, se incubaron con los anticuerpos primarios (TC-1, 1:100, Gene Tex, Estados Unidos; Ki-67, 1:300, Neomarkers Lab Vision Corp, CA, EE.UU.) la noche a 4 ° C, y después se tiñeron con un Kit de detección ™ Envision (Dako, Dinamarca) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secciones se trataron a continuación con 0,003% 3, 30-diaminobencidina y contratinción con hematoxilina
.
La evaluación de TC-1 de expresión se llevó a cabo por dos patólogos sin acceso a los datos clínicos y se basa tanto en el grado de TC-1 etiquetado y la intensidad de TC-1 tinción. El grado de TC-1 etiquetado se midió de acuerdo con el porcentaje de células positivas: 0 = 0 a 5%, 1 = 6-25%, 2 = 26 a 50%, 3 = 51 a 75%, y 4 = 76- 100%. La intensidad de TC-1 tinción se estimó visualmente y estratificado en cuatro grupos: 0 = negativo; 1 = débil; 2 = moderado; y 3 = intensa. La puntuación TC-1 se determinó como el grado de TC-1 etiquetado multiplicado por la intensidad de TC-1 tinción: 0 = 0, 1+ = 1-4, 2+ = 5-8, 3+ = 9-12. Los tumores con una puntuación de 0 se consideran TC-1-negativos, mientras que los otros (1+ a 3+) se consideraron positivos. Los porcentajes de células tumorales Ki-67-reactivos se evaluaron en un campo de alta potencia (400 ×) contando más de 1000 células tumorales en las partes representativas seleccionadas al azar del tumor [13].
2,3 Cell Culture
NSCLC A549, SPC-a-1, 95D, y NCI-H520 células y las células del epitelio 16HBE bronchiorum túnica mucosa se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en nuestro laboratorio . Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) y 100 unidades /ml de estreptomicina /penicilina y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. Para los experimentos de PD173074, se cultivaron células A549 y A549- plenti-shRNA1 en libre de suero y factor de crecimiento epidérmico (EGF) medio exento de (SITA: RPMI 1640 suplementado con 5 mg /ml de insulina, 10 mg /ml de transferrina, 30 nmol /selenito L de sodio, y 0,25% de albúmina de suero bovino) suplementado con PD173074 (disuelto en DMSO, Cayman, EE.UU.) a una concentración final de 1 μΜ. El medio de crecimiento para las células de control se complementa con volúmenes equivalentes de DMSO sin inhibidor.
2.4 Derribo de TC-1 por la interferencia de ARN
Cuatro candidatos RNAi objetivo secuencias humana a TC-1 (Tabla 1) se diseñaron y se clonaron en el vector pGCSIL-GFP por Shanghai GeneChem Co., Ltd. (china). TC-1 shRNA1 (Tabla 1) exhibió la mejor eficiencia de caída en células 293T cotransfectadas con TC-1 y de expresión shRNA construcciones, según lo revelado por ensayos de transferencia e inmunofluorescencia occidentales, y por lo tanto fue seleccionado para el derribo del TC-1 endógena en el CPNM Células. se utilizó para no silenciamiento-shRNA (NSRNA) como un control negativo. Los oligonucleótidos que codifican el TC-1 shRNA1 o NSRNA secuencia y una secuencia de bucle que separa los dominios complementarios se sintetizaron y se insertan en el pGCSIL-GFP por Shanghai GeneChem Co., Ltd. (China). El virus recombinante fue empaquetado usando sistemas de expresión LentiVector (Shanghai GeneChem Co., Ltd., China). Las células A549 se infectaron con una solución infección mejorada y se cultivaron en medio RPMI-1640. Una semana después de la infección, las células GFP-positivas fueron ordenados usando un citómetro de flujo (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). La GFP ordenados
+ células (pureza & gt; 97%) se usaron entonces en los experimentos posteriores
2,5 Lentivirus construcción y la transducción de células
El HA-TC1 construcción. en el vector PLENTI-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se describió anteriormente [14]. En pocas palabras, un clon de entrada que contiene el de larga duración TC-1 fue creado por primera vez por nuestro equipo utilizando el kit de clonación direccional TOPO pENTR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después se generó el clon de entrada, la reacción de recombinación LR se realizó para transferir el gen en el vector de plenti-DEST con el fin de crear el clon de expresión. El constructo se secuenció para asegurarse de que las secuencias y la orientación eran correctas. El lentivirus fue producido por co-transfección de células 293T con la construcción de expresión PLENTI utilizando la mezcla de embalaje optimizado (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). células NCI-H520 se transdujeron con lentivirus y el virus plenti-LacZ se utilizó como control. La selección se inició 48 h después de la infección en medio RPMI-1640 con 10 mg /ml blasticidin en ausencia de insulina o EGF. Al llegar a la confluencia, se pasaron las células seleccionadas y cultivadas en serie.
2.6 Real-Time reacción de polimerasa en cadena
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) , y el cDNA se sintetizó usando el PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japón). PCR cuantitativa se realizó utilizando una fluorescencia continua detectar Sistema termociclador ABI PRISM 7500 de detección de secuencias (ABI, CA, EE.UU.) con SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Japón). Las mediciones se realizaron por triplicado usando GAPDH como control endógeno. QRT-PCR se realizó usando los cebadores para TC-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) y GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA AT-3).
2,7 Western Blot
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [10]. Las células se recogieron y se lavaron con PBS después del cultivo durante 48 h con MG-132 (disuelto en DMSO, Cayman, América) a una concentración final de 500 nM. las cantidades de proteína iguales de las muestras se separaron por 10% SDS-PAGE. Después de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva York, EE.UU.), la membrana se incubó en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con Tris (TBS), que contiene 0,1% de Tween 20 y 5% de leche desnatada] durante 1 h a 25 ° C y luego con el anticuerpo primario (TC-1, 1:300, gene Tex, América; ß-actina, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. A continuación, la membrana se lavó tres veces con TBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano durante 2 horas a 25 ° C. Las bandas inmunorreactivas se revelaron usando un sistema de quimioluminiscencia (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), y las fotografías de las bandas se analizaron mediante FluorChemTMIS-8900 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, EE.UU.).
2.8 Ensayo MTT
Las células (1 × 10
3 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos. En una serie de puntos de tiempo, se añadieron 20 l de MTT a cada pocillo, y las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 4 h. Entonces, 150 l de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, EE.UU.) se añadió a cada pocillo. Las placas se agitaron durante 10 min, y se midió el valor de la densidad óptica (DO) a 490 nm usando un lector de microplacas (Bio-Rad Modelo 680, EE.UU.). Las curvas de crecimiento de células fueron entonces cerradas. Todos los experimentos se repitieron tres veces, y se adoptaron los valores medios.
2.9 Placa de formación de colonias de ensayo
Las células (4 × 10
2 células /pocillo) fueron sembradas en seis -Bueno placas y se dispersaron uniformemente agitando ligeramente las placas. Las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 hasta que las colonias visibles aparecieron. Las colonias se fijaron con etanol al 95% y se tiñeron con solución de tinción de cristal violeta. Las colonias con más de 40 células se contaron usando un microscopio invertido, y la tasa de formación de colonias se calculó por la siguiente fórmula: eficiencia de formación de colonias de la placa = (número de colonias /número de células inculcados) x 100%. Todos los experimentos se repitieron tres veces, y se adoptaron los valores medios.
2.10 Flujo Análisis de Citometría del ciclo celular
Las células se recogieron por tratamiento con tripsina y se recogieron en tubos de centrífuga (2 × 10
6 células /tubo). Después, se añadieron 1 ml de PBS y 2 ml de alcohol deshidratado a cada tubo (4 ° C durante la noche) para fijar las células. Después del tratamiento con ARNasa y PI, el porcentaje de células en la fase S se midió utilizando un flujo BD FACSAria citómetro (Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Los datos fueron analizados utilizando el software ModFit LT (Verity Software House, EE.UU.).
2.11 Flujo Análisis de citometría de apoptosis de las células
Las células se recogieron por tratamiento con tripsina y se recogieron en tubos de centrifugación (1 × 10
6 células /tubo). Después de dos lavados con PBS enfriado en hielo, las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en una solución que contiene PE-A y PerCP-Cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, EE.UU.) para células activadas por fluorescencia el análisis clasificador (FACS) usando un instrumento FACS equipado con un módulo discriminador doblete (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Los datos fueron analizados utilizando el software CellQuest (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Se analizaron diez mil a 20.000 células por muestra.
2.12
En vivo
tumorigenicidad Ensayo
Para el ensayo de tumorigenicidad, de 4 a 6 semanas de edad BALB /c atímicos ratones desnudos (Experimental Animal Center, adelante Military Medical University, Xi'an, China) se administraron por vía subcutánea 5 x 10
6 A549- PLENTI-shRNA1, A549- PLENTI-NSRNA, NCI-H520-PLENTI-TC-1 o células NCI-H520-PLENTI-LacZ. Las dimensiones de los tumores se midieron cada cinco días durante un período de 30 días usando un calibre lineal. El volumen del tumor se calculó usando la siguiente ecuación: V (mm
3) = a × b
2/2, donde "a" es la dimensión más grande y "b" es el diámetro perpendicular. Cada grupo incluyó cinco ratones. Los animales fueron sacrificados después de 30 días, y los tumores se midieron y se retiran para su posterior estudio.
2.13
En vivo
PD173074 Ensayo Tratamiento
Un total de 5 × 10
6 A549- células A549 (01:01 en suspensión de células; Matrigel) plenti-shRNA1 o se implantaron en el flanco de 4 a 6 semanas de edad ratones desnudos BALB /c atímicos. Cuando los tumores se hicieron medible, se administró 50 mg /PD173074 /ratones kg o un volumen equivalente de tampón solo día durante un total de 28 días. Además, los ratones recibieron o no recibieron dos dosis de 5 mg /kg de cisplatino por vía i.v. en los días 1 y 15. Se monitorizó el volumen del tumor usando un calibre lineal. Los animales fueron sacrificados cuando la carga tumoral alcanzó los 15 mm en cualquier dimensión, y la supervivencia se registró mediante un gráfico de Kaplan-Meier.
2.14 Análisis estadístico
Los datos se expresan como las medias ± norma error (SE). El paquete de software SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico. Se aplicó la prueba de Mann-Whitney para los datos no paramétricos, y el estudiante
t
prueba se utiliza para las comparaciones de las medias entre los dos grupos de datos de medición. Se aplicó el análisis de varianza (ANOVA) para las comparaciones de los medios de múltiples grupos de datos de medición, y se utilizó la prueba de Student-Newman-Keuls (SNK) para más comparaciones de cada grupo. Se utilizó la prueba de log-rank (Mantel-Cox) para analizar la curva de supervivencia. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
3.1 TC-1 se expresa en altos niveles y fuertemente asociados con la proliferación celular en el CPNM humanos primarios
Para evaluar la expresión de TC-1 en NSCLC primario humano, inmunohistoquímica se realizó utilizando 122 muestras de NSCLC, incluyendo el carcinoma de células escamosas 68 y 54 muestras de adenocarcinoma, que se obtuvieron de 83 machos y 39 hembras (Tabla 2). TC-1 expresión fue evidente en 49 (72,06%) de las muestras de carcinoma de células escamosas y 41 (75,93%) de las muestras de adenocarcinoma. La expresión de TC-1 se localizó principalmente en el citoplasma, pero la tinción nuclear fue también parcialmente presente. En el tejido pulmonar normal, las células epiteliales bronquiales no neoplásico y alveolares fueron consistentemente no reactivos o de bajo reactivo para TC-1 (Fig. 1). Además, TC-1 de expresión presenta ligeras diferencias entre el género, la edad y los subtipos histológicos (p & gt; 0,05, Tabla 2).
tinción inmunohistoquímica intensivo para TC-1 en adenocarcinomas de pulmón (A) y carcinomas de células escamosas (SEGUNDO). No reactividad para TC-1 en las células epiteliales alveolares normales (C). (Aumento x 200).
La correlación entre el TC-1 de expresión y la proliferación de células de NSCLC se analizó mediante la detección de la expresión de Ki-67. Como se resume en la Tabla 2, se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de alto proliferación (Ki-67 etiquetado índice & gt; 10%) y el grupo de bajo proliferación (Ki-67 etiquetado índice ≤10%) tanto en el escamoso de pulmón muestras de carcinoma de célula y adenocarcinoma (P & lt; 0,05), lo que sugiere que el TC-1 de expresión está fuertemente correlacionada con la proliferación de células de NSCLC
3.2 Generación de clones estables de células de NSCLC que sobreexpresan o regulación a la baja de TC-1 |.
Para estudiar el efecto de la CT-1 y la expresión aberrante de las células NSCLC, qReal-Time PCR y Western Blot se realizaron con el CPNM líneas celulares A549 humana, SPC-a-1, 95D, y NCI-H520 y el 16HBE línea celular se utilizó como grupo control. Como se muestra en la Fig. 2A, el nivel de expresión de TC-1 en A549, SPC-A-1, y 95D células fue mayor que la obtenida en las células 16HBE, y el nivel de expresión de TC-1 en las células NCI-H520 fue menor que la observada en las células 16HBE. Basándose en estos resultados, A549 y NCI-H520 se encontró que eran células representativas que muestran el un nivel de expresión inferior de TC-1 y más alta y se seleccionaron para un estudio adicional. Entonces, plenti-shRNA1 se transfectó en células A549, y plenti-TC-1 se transfectó en células NCI-H520. clones estables se aislaron después de su examen por el clon de clasificación de células activadas por fluorescencia o blasticidina, respectivamente. La PCR qReal-Time y los resultados de transferencia Western mostraron que TC-1 expresión marcadamente se redujo o se incrementa en las células tratadas en comparación con el control, mientras que el control negativo no mostró ningún cambio en el nivel de TC-1 expresión (Figs. 2B y 2C).
QRT-PCR y Western Blot mostró que A549, SPC-A-1, y 95D células expresan altos niveles de TC 1-mRNA y de la proteína y que las células NCI-H520 expresan niveles bajos de TC -1 mRNA y de la proteína (A). Los resultados de transferencia de QRT-PCR y Western mostrados en B y C, respectivamente, muestran que TC-1 mRNA y proteínas son downregulated significativamente en las células A549-plenti-shRNA1 y upregulated significativamente en células NCI-H520-plenti-TC-1 en comparación con los controles. Las columnas representan la media de la cantidad de ARNm relativa de al menos tres experimentos independientes. Las barras muestran la SE. * Indica cambios estadísticamente significativos (P & lt; 0,05). Entre los cinco grupos (A) o tres grupos (B, C)
3.3 TC-1 promueve la proliferación celular y la transición del ciclo celular e inhibe la apoptosis de las células en CPNM
in vitro
Para investigar la función de la CT-1 de expresión en la proliferación de células NSCLC, por pérdida de la función y se realizaron ganancia de estudios de la función. En particular, en el ensayo de MTT, la transfección de plenti-TC1 transfección aumentó la proliferación de las células NCI-H520 en comparación con las células de control. Alternativamente, TC1 desmontables mediante TC1-shRNA1 mostró regulación a la baja significativa de la proliferación de células A549-PLENTI-shRNA1 en comparación con las células transfectadas con NSRNA (Fig. 3A). Además, los números de colonias de los grupos de ARN plenti-TC-1 y plenti-NS eran más altos que los obtenidos para los grupos plenti-lacZ y plenti-shRNA1, respectivamente (Fig. 3B). Estos resultados sugieren que TC-1 promueve la proliferación celular en NSCLC
vitro
.
(A) ensayo de MTT en. Se detectó el valor de la densidad óptica a una serie de puntos de tiempo para evaluar la proliferación celular. (B) ensayo de formación de colonias de la placa. Las colonias se tiñeron con solución de tinción de cristal violeta y se cuentan, y luego se calculó la tasa de formación de clon. ensayo de ciclo (C) de la célula. El porcentaje de células en la fase S se midió usando un citómetro de flujo, y se analizaron los datos utilizando el software ModFit LT. (D) ensayo de apoptosis de la célula. Las células se incubaron en la oscuridad en una solución que contiene PE-A y PerCP-Cy5.5. El porcentaje de células apoptóticas (cuadrante inferior derecho) se analizó utilizando un FACS equipado con un módulo discriminador doblete, y los datos se analizaron usando el software CellQuest. Las columnas representan la tasa media de formación de colonias (B), velocidad de células de la fase S (C), y velocidad de células de la apoptosis (D) de al menos tres experimentos independientes. Las barras muestran la SE. * Indica los cambios estadísticamente significativos (P & lt; 0,05) entre los tres grupos
La distribución de fase del ciclo celular se midió por citometría de flujo.. Los resultados mostraron que el porcentaje de células en la fase S fue significativamente mayor después del tratamiento con plenti-TC1 en comparación con la obtenida después del tratamiento con plenti-LacZ. En contraste, el porcentaje de células en la fase S disminuyó significativamente después del tratamiento con pLenti- shRNA1 en comparación con la obtenida con plenti-NSRNA (Fig. 3C). Estos resultados indican que TC-1 promueve la transición de G1 a la fase S.
Además, el efecto de TC-1 sobre la apoptosis de células NSCLC se analizó por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3D, las células transfectadas con plenti-TC-1 muestra las tasas de apoptosis más bajas en comparación con las células transfectadas con plenti-LacZ, y las células transfectadas con plenti-shRNA1 muestra las tasas de apoptosis más altas en comparación con las células transfectadas con plenti-NSRNA, lo que sugiere que TC -1 inhibe la apoptosis de las células en el CPNM.
3.4 TC-1 promueve la proliferación celular CPNM
in vivo
Para evaluar la función del TC-1 de expresión en la proliferación de células NSCLC
in vivo
, un
in vivo se realizó
ensayo de tumorigenicidad en. Las dimensiones de los tumores se midieron cada cinco días durante un período de 30 días (Figs. 4B y 4D). Al final del experimento, los ratones se sacrificaron, y los tumores se retiraron y se fotografiaron (Figs. 4A y 4C). Como se muestra en la Fig. 4, los resultados de ensayo de tumorigenicidad indican que la regulación al alza del nivel de expresión de TC-1 promueve la proliferación celular
in vivo
, mientras que la caída del nivel de expresión de TC-1 inhibe la proliferación celular
in vivo
.
modelo de tumor subcutáneo (n = 5). Las células se inyectaron subcutáneamente en el flanco de ratones desnudos atímicos, y el volumen del tumor se registró cada cinco días (C, D). Los ratones se sacrificaron 30 días después de la inyección, se extrajeron los tumores, y se tomaron fotografías (A, B).
Parte de cada nódulo subcutáneo se seccionó y se sometió a inmunohistoquímica para Ki-67. Nuestros resultados mostraron que no había una diferencia significativa en el número de células tumorales Ki-67-reactivos en los nódulos subcutáneos entre los dos grupos (los Ki-67 índices de los nódulos subcutáneos fueron los siguientes: A549- plenti-NSRNA, 68,98 ± 2,56%; A549- PLENTI-shRNA1, 28,63 ± 2,38%; P & lt; 0,05; NCI-H520- PLENTI-TC-1, 86.26 ± 3.16%; NCI-H520- PLENTI-LacZ, 51,34 ± 1,78%; P & lt; 0,05) . Estos hallazgos indican que TC-1 mejora significativamente la capacidad de proliferación de células de NSCLC
in vivo
.
3,5 PD173074 disminuye la expresión de TC-1 de una manera dosis-dependiendo largo de un cierto rango
Para probar si la adición de PD173074 influye en la expresión de CT-1 en el CPNM, A549 y A549 células-PLENTI-shRNA1 en SITA se trataron con PD173074. Los resultados de RT-PCR y Western Blot mostró que el nivel de expresión de TC-1 disminuyó con un aumento en la concentración de PD173074 y los niveles de salida cuando la concentración de PD173074 alcanza 1 μΜ (Fig. 5). La concentración de 1 μΜ fue así seleccionados para estudio adicional.
El QRT-PCR y los resultados de transferencia Western mostraron que el nivel de expresión de TC-1 disminuyó con un aumento en la concentración de PD173074 y los niveles a cabo cuando la concentración de PD173074 alcanza 1 μΜ en A549 (a) y células A549-PLENTI-shRNA1 (B). Las columnas representan la media de la cantidad de ARNm relativa de al menos tres experimentos independientes. Las barras muestran la SE. * Indica los cambios estadísticamente significativas (P & lt; 0,05). Entre los cinco grupos
3.6 PD173074 Inhibición de la proliferación celular, la transición del ciclo, y resistencia a la apoptosis Depende del TC-1 nivel de expresión
in vitro
Para estudiar el efecto de PD173074 sobre la proliferación celular mediada por el TC-1 en el CPNM, un ensayo de MTT, se realizaron ensayo de placa de formación de colonias, análisis del ciclo celular, la apoptosis y análisis celular. Como se muestra en la Fig. 6A, el tratamiento PD173074 tiene una marcada influencia en las curvas de crecimiento celular de las células no transfectadas, como se ilustra por la diferencia entre el grupo de A549 + PD173074 y el grupo A549, pero tiene poca influencia en las curvas de crecimiento celular de las células transfectadas, como se indica por la diferencia entre el grupo A549-PLENTI-shRNA1 + PD173074 y el grupo-A549-PLENTI shRNA1. Un resultado similar se observó en el ensayo de formación de colonias de la placa: no había una diferencia significativa en la tasa de formación de colonias de entre el grupo de A549 + PD173074 y el grupo A549, pero sólo ligeras diferencias en la tasa de formación de colonias se observó entre el A549-pLenti- grupo shRNA1 + PD173074 y el grupo-A549-PLENTI shRNA1 (Fig. 6B). Como se muestra en la Fig. 6C, los porcentajes de células en la fase S en las poblaciones de células A549 PD173074 tratadas, células A549, células A549-plenti-shRNA1 PD173074 tratados, y A549-plenti-shRNA1 células fueron 29,47 ± 0,62%, 49,5 ± 1,89% , 28,02 ± 0,97% y 29.5 ± 1.02%, respectivamente. Obviamente, hay una diferencia significativa entre el grupo de A549 + PD173074 y el grupo A549, pero sólo una ligera diferencia entre el grupo A549-plenti-shRNA1 + PD173074 y el grupo A549-plenti-shRNA1. Como se muestra en la Fig. 6D, las tasas de apoptosis de las células A549 PD173074 tratados fueron significativamente más alta que la de las células A549; sin embargo, no había ninguna diferencia notable en la tasa de apoptosis entre las células A549-plenti-shRNA1 PD173074 tratadas y células A549-plenti-shRNA1. Tomados en conjunto, estos datos indican que PD173074 inhibe la proliferación TC-1-mediada por células, la transición del ciclo celular, y la resistencia a la apoptosis de células cuando TC-1 se expresa altamente o moderadamente, pero no cuando se expresa humilde.
(A ) ensayo de MTT. Se detectó el valor de la densidad óptica a una serie de puntos de tiempo para evaluar la proliferación celular. (B) ensayo de formación de colonias de la placa. Las colonias se tiñeron con solución de tinción de cristal violeta y se cuentan, y luego se calculó la tasa de formación de clon. ensayo de ciclo (C) de la célula. El porcentaje de células en la fase S se midió usando un citómetro de flujo, y se analizaron los datos utilizando el software ModFit LT. (D) ensayo de apoptosis de la célula. Las células se incubaron en la oscuridad en una solución que contiene PE-A y PerCP-Cy5.5. El porcentaje de células apoptóticas (cuadrante inferior derecho) se analizaron utilizando un FACS equipado con un módulo discriminador doblete, y los datos se analizaron usando el software CellQuest. Las columnas representan la tasa media de formación de colonias (B), velocidad de células de la fase S (C), y velocidad de células de la apoptosis (D) de al menos tres experimentos independientes. Las barras muestran la SE. * Indica los cambios estadísticamente significativos (P & lt; 0,05). A549 entre el grupo y el grupo A549 + PD173074
3.7 PD173074 Inhibición de la proliferación celular, la transición del ciclo, y resistencia a la apoptosis dependen de la expresión de CT-1 Como se muestra en las Figs.