Extracto
TCTP ha sido implicado en una plétora de procesos celulares importantes relacionados con el crecimiento celular, la progresión del ciclo celular, la transformación maligna y la inhibición de la apoptosis . Además de estas funciones intracelulares, TCTP tiene funciones extracelulares y juega un papel importante en las células inmunes. TCTP expresión se había demostrado que ser desregulado en el cáncer de próstata, pero su función en las células de cáncer de próstata es en gran parte desconocida. Aquí mostramos que la expresión TCTP está regulada por andrógenos en las células de cáncer de próstata LNCaP
in vitro
, así como xenoinjertos de cáncer de próstata humano
in vivo
. Desmontables de
TCTP
formación reducida colonia y aumento de la apoptosis en las células LNCaP, lo que implica que como un factor importante para el crecimiento de células de cáncer de próstata. de perfiles de expresión génica global en las células LNCaP TCTP desmontables demostró que varios genes de interferón regulados están regulados por TCTP, lo que sugiere que puede tener un papel en la regulación de la función inmune en el cáncer de próstata. Además, el tratamiento TCTP recombinante aumenta la formación de colonias en las células LNCaP que sugieren que TCTP secretada puede funcionar como un factor de proliferación en el cáncer de próstata. Estos resultados sugieren que TCTP puede tener un papel en el desarrollo del cáncer de próstata
Visto:. Kaarbø M, ML tormenta, Qu S, Wæhre H, Risberg B, Danielsen SE, et al. (2013) TCTP es un gen regulado por andrógenos-implicado en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e69398. doi: 10.1371 /journal.pone.0069398
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: June 10, 2013; Publicado: July 22, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kaarbø et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Noruega (Grant#193337 /V50, www.forskningsradet.no) y la Sociedad Noruega del cáncer (Grant#71395 - PR-2006-0335). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el tumor maligno no cutáneo más frecuentemente diagnosticado y la tercera causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los países occidentales industrializados [1]. La importancia de los andrógenos para el desarrollo y progresión del cáncer de próstata se mostró a principios de la 20
siglo XX. Esto dio como resultado enfoque significativo en andrógenos y el receptor al que se unen, el receptor de andrógenos (AR) [2], y la terapia de ablación de andrógenos se convirtió en la línea principal de la terapia. A pesar de que AR y acción de los andrógenos son aspectos de importancia crítica en el cáncer de próstata, se ha hecho evidente que otras vías de señalización, así como alteraciones no genómicos y genómicos, están involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata (revisado en [3]) .
proteína de tumor en traslación controlada (TCTP) es un factor de múltiples facetas, que está altamente conservada en un número de especies. Fue descubierto originalmente en una línea celular de sarcoma de ratón como una proteína regulada a nivel de traducción [4]. TCTP desde entonces ha sido implicado en una serie de procesos celulares importantes, tales como el crecimiento celular, la transformación maligna y la inhibición de la apoptosis. TCTP no se encuentra exclusivamente en las células tumorales, pero tiene un perfil de expresión generalizada de que no se limita a un tipo de tejido o célula específico. Sin embargo, la expresión de TCTP es generalmente más alta en los tumores en comparación con tejido normal correspondiente (revisado en [5]).
TCTP tiene un papel anti-apoptótica en un número de líneas celulares (revisado en [6]). TCTP ratones knockout son embriónicamente letal con reducción del número de células y una mayor incidencia de la apoptosis en los embriones, destacando su importancia en el desarrollo temprano [7], [8]. Además, TCTP se ha demostrado que se unen de calcio [9] - [12]; esta propiedad puede estar relacionado con su actividad anti-apoptótica como la concentración de calcio libre intracelular se sabe que aumenta durante la apoptosis, lo que provocó una secuencia de eventos que conducen a la muerte celular [13]. TCTP está comprometida en una variedad de interacciones proteína-proteína y se une tubulina, PLK 1, p53 y el factor de intercambio de nucleótidos de guanina Rheb, entre otros [14]. Además,
TCTP
mRNA es muy estructurado y activa PKR, una quinasa proteína implicada en la respuesta inflamatoria [15]. Aunque estos estudios ofrecen explicaciones plausibles de los muchos efectos reportados de TCTP, los mecanismos exactos por los que las funciones TCTP aún no se han delineado.
TCTP es también una proteína secretada con funciones extracelulares [16]. La forma secretada de TCTP fue identificado originalmente por su capacidad para promover la liberación de histamina de los basófilos en un subconjunto de los donantes alérgicas y por lo tanto el nombre de histamina Factor de Liberación (HRF) [17]. Además, TCTP estimuló la proliferación de células B, la expresión inducida de IL-1, IL-6, y la producción de inmunoglobulina consistentes con un papel como factor de crecimiento de células B [16]. TCTP no contiene una secuencia señal N-terminal típico de las proteínas secretadas y se secreta a través de una vía que implica no clásicos exosomas [18]. Curiosamente, nanovesículas secretada a partir de células endoteliales apoptóticas que actúan de una manera paracrina contener TCTP, que se extiende aún más la modalidad de su acción extracelular [19].
Expresión TCTP
Estudios recientes han identificado en la próstata humana. TCTP se encontró que se expresa en tejidos prostáticos de hombres sometidos a adenomectomía quirúrgico para la hiperplasia prostática benigna (BPH) y en líneas celulares derivadas de la próstata normal, tales como la línea celular PWR-1E, y el cáncer de próstata [12]. También se encontró expresión TCTP a ser más alta que otras proteínas de unión a calcio (PBC) en la próstata humana. Además, los análisis de inmunohistoquímica de próstata normal indicó que TCTP fue expresado principalmente por las células luminales secretoras y en un menor grado por las células basales. TCTP también fue identificado en los fluidos prostáticos, lo que sugiere que puede tener un papel extracelular en la próstata [12]. Además, TCTP puede afectar a la proliferación y la viabilidad en las células de cáncer de próstata [20]. células LNCaP tratadas con siRNA dirigidos TCTP indicaron que desmontables de TCTP aumenta la apoptosis a través de la caspasa 3 y caspasa 8 y reduce la proliferación celular en las células LNCaP [20]. Además, los resultados de un estudio reciente indican que la proteína de choque térmico 27 (Hsp27) interactúa con TCTP en células de cáncer de próstata y la protege de la degradación de [21]. Además, los niveles de expresión TCTP correlacionan con progresión de la enfermedad, en la que se regula positivamente en el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [21]. Estos estudios implican TCTP en el cáncer de próstata; Sin embargo, existe poca información sobre su regulación y función de las células de cáncer de próstata.
Aquí mostramos que TCTP está regulada por andrógenos, importantes factores de supervivencia de las células del cáncer de próstata, así como la próstata normal. La expresión ectópica de TCTP y su caída, así como experimentos con TCTP recombinante, muestran que contribuye al crecimiento y la proliferación celular, lo que implica que como un factor importante en el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité regional de Ética, REK Sør-ost (S-07443a), y material procedentes de pacientes que aún viven se incluyó después de su consentimiento por escrito. El uso de materiales de pacientes fallecidos fue permitido por el Comité de Ética. Los experimentos con animales fueron aprobados por las directrices de la Universidad Case Western Reserve IACUC. Todas las medidas adoptadas por el bienestar de los animales y para reducir al mínimo el sufrimiento estaban de acuerdo con las directrices del IACUC y se han descrito previamente [22], [23].
Cell Cultura y
células LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal de ternera (FCS), 2 mM L-glutamina, 50 U /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina (Lonza). La línea de epitelio bronquial humano BEAS-2B células transformadas con SV40 fue un generoso regalo de Sten Mollerup (Departamento de Toxicología, Instituto Nacional de Salud Ocupacional, Oslo, Noruega) [24]. células BEAS-2B se mantuvieron en LHC-9 el medio suplementado con 1,8 mg /ml de albúmina de suero bovino (BSA) en placas recubiertas con 0,01 mg /ml de fibronectina y 0,03 mg /ml de colágeno bovino disuelto en PBS.
Para ambas líneas celulares del medio de cultivo se cambió cada dos a tres días, y las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2, 95% incubadora de aire. Para los experimentos de inducción de andrógenos, se mueren de inanición células LNCaP durante 48 h en medio RPMI 1640 que contiene 2% de carbón tratado (CT) -FCS, seguido por 24 h adicionales en RPMI 1640 que contenían 0,5% CT-FCS antes del tratamiento con 10
- 8 M R1881 (andrógeno sintético). R1881 se obtuvo de NEN.
Los experimentos de xenoinjertos
Trasplante, el crecimiento y la cosecha de los tumores de los ratones portadores de xenoinjertos CWR22 eran como se describe anteriormente [22], [23]. xenoinjertos CWR22 se cultivaron en ratones desnudos en presencia de un pellet de testosterona de liberación sostenida. Después del crecimiento del tumor, los ratones fueron castrados, se retiraron los gránulos de testosterona y se recogieron los tumores en regresión a los 1, 2, o 4 semanas después de la castración. Los animales fueron alojados y tratados de acuerdo con las directrices del IACUC.
PCR cuantitativa (qPCR)
Tras la cosecha, el ARN total fue extraído de células usando el reactivo Trizol® (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 1-5 g de ARN se utiliza para la síntesis de ADNc de primera cadena con el sistema Superscript II (Invitrogen) y oligo-dT. Se realizaron análisis de qPCR en el instrumento LightCycler 480 (Roche) con la mezcla de SYBR Green I Maestro LightCycler 480 (Roche). Una curva estándar a partir de diluciones en serie de cDNA se hizo para calcular la cantidad relativa de la diana y de referencia de genes para cada muestra. Estos valores se normalizaron luego a la cantidad relativa del gen de referencia. Los cebadores están disponibles bajo petición. Se evaluaron las diferencias entre los grupos utilizando una de dos colas, emparejado
t-
de Student, con
P
. & lt; 0,05 se consideró como significativo
y extracción de proteínas Análisis Western
extractos de células enteras se realizaron como se describe anteriormente [25], resuelto por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad). La membrana sometida a transferencia se bloqueó en leche descremada en polvo 10% en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween (TBS-Tween) durante 1 h seguido por incubación con anticuerpo primario en TBS-Tween que contiene 5% de albúmina de suero bovino (BSA) de 14-16 horas a 4 ° C. Se utilizaron anticuerpos contra cualquiera de TCTP (1:1000) [12], o GAPDH (1:500) (Santa Cruz). Mejora de reactivos de quimioluminiscencia Western Blot de detección (Amersham Biosciences) y el sistema de análisis se utilizaron para la detección de las proteínas marcado con HRP. Para la cuantificación, transferencias Western fueron digitalizadas con una máquina escáner (Epson Perfection V700 Photo) y la densidad óptica se midió con el TL ImageQuant software (Amersham Biosciences). anticuerpo monoclonal de ratón TCTP humana fue un generoso regalo del grupo de Del Vecchio.
ARN de interferencia
ARNsi sintético dirigido TCTP (secuencia diana 5'AACCATCACCTGCAGGAAACA-3 ') se obtuvo [12] de Dharmacon, mientras siRNA para la luciferasa (secuencia diana: 5'-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ') fue de Qiagen. células LNCaP fueron sembradas en total de 24 h antes de la transfección medianas. El medio se cambió a medio RPMI 1640 sin FCS y antibióticos antes de la transfección, y las células se transfectaron con 100 nM de ARNsi por pocillo usando Oligofectamine (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ensayo de formación de colonias
células LNCaP fueron transfectadas con siRNA como se describe anteriormente y se sembraron en placas de 10 cm a una densidad de 100000 células /pocillo. Las colonias se hicieron crecer durante tres semanas. células LNCaP tratadas con TCTP recombinante se sembraron a una densidad de 2500 células por pocillo en una placa de seis pocillos en medio RPMI suplementado con 10% FCS. TCTP recombinante, GST, o vehículo de control se añadió cada dos o tres días. La formación de colonias se evaluó después de dos semanas de crecimiento. Las células se fijaron en metanol a -20 ° C durante 30 min, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 20 minutos y después se lavaron con agua MQ. El área cubierta por las colonias se cuantificó usando el software de GeneTools SynGene.
TUNEL ensayo
células LNCaP fueron sembradas en cubres, hambre y transfectadas con siRNA como se ha descrito anteriormente. Para thapsigargin inducción (TG), las células se trataron con vehículo o 100 nM TG para el último 36 h del período de la transfección 72 h. Para detectar la apoptosis, un TUNEL
In Situ
kit de detección de muerte celular (Roche) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se detecta utilizando un microscopio de imagen Axioplan2 (Zeiss) y las imágenes fueron tomadas con una cámara AxioCam HRc (Zeiss). El número de células TUNEL positivas se expresó como un porcentaje del número total de células.
perfiles de expresión génica
ARN total de las células tratadas con ARNsi fue aislado utilizando el reactivo TRIzol® según las instrucciones del fabricante y se analizó en la Microarray Consorcio de Noruega (NMC), hospital de la Universidad de Oslo, Oslo, Noruega. El ARN se amplificó utilizando el kit de amplificación del ARN Illumina® TotalPrep (iluminación). 500 ng de ARN total se utilizó en la reacción de amplificación y el etiquetado. La calidad de la cRNA se evaluó mediante una Bioanalyser. Biotina cRNA marcado (1,5 g) se utilizó entonces para hibridar a Illumina humano-6 v3 Expresión BeadChips utilizando la expresión de genes de ensayo de hibridación directa de todo el genoma de Illumina. Después de la exploración, los resultados fueron importados en Illumina BeadStudio, donde se pusieron a prueba la calidad de cada matriz y exploración.
Generación de y el tratamiento con recombinante TCTP
El marco de lectura abierta (ORF) de hTCTP se clonó en pET-28a para la expresión de TCTP recombinante. IPTG 0,1 mM fue utilizado para inducir la expresión, y después de la cosecha el sedimento se resuspendió en tampón de unión (20 mM NaH
2 PO
4, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4). Se añadieron inhibidores de la proteasa y la suspensión celular se sonicó a 4 ° C. Marcado con his hTCTP se purificó en condiciones nativas utilizando una columna HiTrap ™ quelante HP (GE Healthcare) cargadas con Ni
2 + iones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La muestra se esterilizó por filtración y se diluyó con tampón de unión antes de la aplicación en la columna. La columna se lavó con tampón de unión hasta que la absorbancia (280 nm) se estabilizó. Las proteínas unidas se eluyeron luego con tampón de elución (20 mM NaH
2 PO
4, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, pH 7,4). El procedimiento de purificación se realizó a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas. El eluido se dializa frente a PBS usando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer® 10K con un valor de corte de 10 kDa. Para obtener GST recombinante, pGEX-4T se cultivó en células BL21, inducida con IPTG 0,1 mM y se purificó por incubación con 50% de suspensión Glutathione Sepharose 4B. Las perlas se lavaron con PBS antes de la elución (Tris-HCl 50, 10 mM de glutationa reducida, pH 8,0). Las proteínas purificadas se pasan al lado Precision Plus de doble color de proteínas convencionales, prestained marcadores de proteínas, Rango amplio (7-175 kDa) y marcadores de proteínas sin teñir, Rango amplio (2-212 kDa) (Biorad) para estimar la cantidad de proteína.
BEAS-2B células fueron tratadas con TCTP /GST recombinante durante una hora antes de la cosecha.
la inmunohistoquímica
microarrays de tejidos (TMA) se prepararon a partir de la prostatectomía radical muestras de pacientes operados en el Norwegian Radium hospital entre 1988 y 1996 y seguidos después de la cirugía. antígeno (PSA) específico de la próstata se realizaron antes y después de la operación y en cada examen clínico posterior. Los períodos de seguimiento variaron desde 2 hasta 176 meses (media, 73,3 meses). Los pacientes se considera que tiene evidencia clínica de recidiva de la enfermedad si alguno de los Estuvieron presentes: (
a
) evidencia de recurrencia local (confirmado por biopsias histológicas o ultrasonido) o (
b
) pruebas de metástasis a distancia (detectado por la gammagrafía ósea y /o de formación de imágenes por resonancia magnética). Si un paciente que sufría de recaída tenía niveles séricos de PSA postoperatorio de & gt; 4 ng /ml antes de la fecha de recidiva local o metástasis, la fecha de PSA elevado fue fijado como fecha de recaída. H & amp; E-manchado secciones se hicieron de cada bloque seleccionado del tumor primario (bloques donantes) de material incluido en parafina para definir las regiones representativas de tumores. Con el uso del instrumento de array de tejidos (Beecher Instruments), dos cilindros de tejido (0,6 mm de diámetro) se perforaron a partir de las regiones del bloque donante. También se tomaron muestras de control de tejido no cáncer de los bloques de parafina. La puntuación de Gleason utiliza en el análisis fue la más alta puntuación de Gleason en cada una de las series de prostatectomía.
El TMA fueron los primeros de-xileno con parafina por diluciones en serie y etanol y se lavaron en H
2O antes de la extinción de peroxidasa endógena en 0,3% H
2O
2 en H
2O para 30 min. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en autoclave a 121 ° C durante 20 min en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,4). El kit de detección de IHC BioGenex sensible estupendo Enlace en etiquetas (BioGenex) se utilizó para la detección de antígeno. Las secciones se equilibraron en TBS-Tween (0,05 M Tris, pH 7,5, 0,3 M NaCl, 0,1% de Tween 20) durante 5 min antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo monoclonal de ratón anti-TCTP humano diluido en TBS 1:100 Tween con 1% de BSA. a continuación, las secciones se lavaron con TBS-Tween antes de la incubación con secundario biotinilado anti-IgG imouse (enlace) durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar en TBS-Tween, el anticuerpo secundario se incubó con estreptavidina marcada con HRP enzima durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron en TBS-Tween y se tiñeron con DAB durante 5 minutos y las reacciones se detuvieron en H
2O. Contratinción se realizó mediante hematoxilina (Dako) tinción y los portaobjetos se montaron con medio de montaje acuoso DAKO Faramount. suero no inmune de ratón se aplicó como control negativo. secciones de tejido normal de la próstata se utilizaron como controles positivos. La intensidad fue calificada usando una escala de 0-3, correspondiente al ausente, débil, moderada e intensa tinción, respectivamente. Se evaluaron las diferencias entre los grupos utilizando
t-
prueba de una de dos colas, no emparejado de Student, con
P
. & lt; 0,05 se consideró como significativo
Estadísticas
a excepción de análisis de microarrays, las estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student donde los valores & lt; p.. 0,05 se consideraron significativos
el análisis estadístico de los datos de expresión génica
el análisis estadístico se llevó a cabo sobre la base de los valores de expresión de resumen para cada sonda y normalizado por cuantil normalización que se traduce en los chips que tienen distribución de intensidad idénticos. Los datos fueron analizados mediante el software v2.7 J-Express (http://www.molmine.com). Análisis Estadístico de Microarrays (SAM) y característica subconjunto de selección (SFS) se utilizaron para los análisis estadísticos.
Resultados
Expresión TCTP es inducida por andrógenos
En primer lugar, investigó la posible regulación de la expresión TCTP por los andrógenos en la línea celular de próstata andrógeno sensibles LNCaP del cáncer en un tiempo experimento. Como se muestra en
Figuras 1A y 1B
, hubo un aumento inducida por andrógenos, tanto en mRNA TCTP y la acumulación de proteínas en el tiempo, que alcanzó aproximadamente cuatro veces mayores niveles en comparación con las células no tratadas a las 48 h. Para determinar si la expresión TCTP también está regulada por andrógenos
in vivo
, se utilizó el modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata humana CWR22 andrógeno-dependiente y que vuelve notablemente después de la castración [22], [23]. El análisis de Western de los tumores CWR22 recogidos de los ratones en diferentes momentos después de la castración mostró que la expresión TCTP disminuyó significativamente de una manera dependiente del tiempo y casi se perdió a las cuatro semanas (
Figura 1C
). Estos resultados muestran que la expresión TCTP está regulada por andrógenos en células de cáncer de próstata, tanto
in vitro en
y
in vivo
.
A. células LNCaP se dejaron sin tratar o se trataron con el andrógeno sintético R1881 (10
-8 M) durante los tiempos indicados. El ARN total se aisló y se realizaron análisis qPCR.
TCTP
expresión de ARNm se normalizó a
GAPDH
. El gráfico ilustra un experimento representativo realizado por triplicado con barras de error indican ± SEM, los niveles de expresión son en relación con las células tratadas y sin andrógenos (ajustado a 1). El experimento se repitió tres veces más de B. Western Los análisis se realizaron en extractos de células enteras hechas de células tratadas en la ausencia o presencia de R1881 (10
-8 M) para los puntos de tiempo indicados. Los niveles de expresión se normalizaron a GAPDH. Los valores presentados son en relación con las muestras no tratadas (puesto a 1). El gráfico ilustra los datos de dos experimentos realizados por triplicado con barras de error que ilustran ± SEM. xenoinjertos C. CWR22 se cultivaron en ratones y muestras de tumores nude fueron recogidos ya sea antes (T = 0) o 1, 2 y 4 semanas después de la castración. extractos de células totales se hicieron y se utilizaron para los análisis de Western blot. La figura muestra una mancha representativo para TCTP y GAPDH, con valores relativos de TCTP (t = 0 se establece en 1) normalizaron a GAPDH. Las diferencias entre los grupos se evaluaron utilizando dos colas, emparejado prueba t de Student comparación con las muestras no tratadas, con P & lt; 0,05 se consideró como significativo. La significación se indica mediante asteriscos; un asterisco indica P & lt; 0,05, dos asteriscos indican p. & lt; 0,01
Desmontables de TCTP Disminuye la formación de colonias de células LNCaP
regulación de la expresión de andrógenos TCTP, según lo indicado supra, sugirieron que puede tener un papel en el crecimiento de células de cáncer de próstata. Esto podría ser a través de la inducción de la proliferación o inhibición de la apoptosis, o una combinación de ambos. Para investigar el posible papel de TCTP en el crecimiento celular, su expresión se inhibe en células LNCaP por la formación de tratamiento y colonia siRNA se evaluó en comparación con las células tratadas de control de siRNA. Como se muestra en la Figura 2A, la expresión de proteínas TCTP se redujo en un 85% después de 72 h de la transfección con siRNA dirigidos TCTP. La formación de colonias de células desmontables TCTP se redujo en 50% en comparación con células de control (Figuras 2B y 2C). Estos datos indicaron que TCTP puede tener un papel en la proliferación y /o viabilidad de las células LNCaP.
A. siRNA mediada desmontables de
TCTP
en células LNCaP. células LNCaP fueron transfectadas con siRNA (100 nM) o bien
luciferasa (Luc)
la orientación o
TCTP
. A la hora indicada se recogieron las células puntos, extractos de proteínas se prepararon y analizaron por análisis de Western. Los antisueros contra TCTP y GAPDH se utilizaron secuencialmente en la misma mancha. células B. LNCaP fueron transfectadas con 100 nM siRNA dirigidos
Luc
o
TCTP
, se siembran en placas de 10 cm y se ensayó la capacidad de formación de colonias mediante tinción de cristal violeta después de tres semanas de crecimiento. se muestran imágenes representativas. C. La cuantificación de la formación de colonias de células LNCaP después de siRNA mediada desmontables de TCTP. La gráfica representa dos experimentos por triplicado. Se evaluaron las diferencias entre los grupos utilizando dos colas, se combina la prueba t de Student en comparación con Luc-siRNA muestras tratadas, como *: P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa
El descenso de regulación de los aumentos de TCTP. la apoptosis de las células LNCaP
TCTP se había informado anteriormente para inhibir la apoptosis en varias líneas celulares [20], [26] - [28]. Además, desmontables de TCTP en las células LNCaP activado caspasa 3 y caspasa 8, indicativo de aumento de la apoptosis [20], [21] RNAi mediada. por tanto, se investigó el posible papel de TCTP sobre la apoptosis en las células LNCaP. El trabajo previo de nuestro laboratorio ha establecido que tapsigargina (TG) induce la apoptosis significativa después de 36 h de tratamiento en las células LNCaP [25]. por lo tanto, determinar si TCTP puede alterar la apoptosis inducida por TG. células LNCaP fueron transfectadas con o bien siRNA contra TCTP o control (luciferasa) siRNA, a continuación, se dejaron sin tratar o se expone a TG, después de lo cual se determinó el grado de apoptosis mediante el ensayo TUNEL. Como se muestra en las figuras 3A y 3B, en ausencia de tratamiento TG, hubo un aumento de aproximadamente tres veces en la apoptosis en las células desmontables TCTP comparación con las células de control. Como era de esperar, TG aumentó significativamente la apoptosis tanto en células TCTP-siRNA tratados de control o, sin embargo, fue aproximadamente 2,5 veces superior a TCTP caída. La caída de
TCTP
se verificó mediante qPCR para todos los experimentos (datos no mostrados). Estos datos sugieren que TCTP está implicado en la regulación de la apoptosis en células de cáncer de próstata.
células LNCaP se cultivaron en cubreobjetos y se transfectaron con ARNsi contra
TCTP
o
luciferasa (Luc)
por 72 h. La apoptosis fue inducida por 100 nM TG durante 36 h durante el tratamiento siRNA. Después del tratamiento y la fijación, la muerte celular apoptótica se detectó usando el ensayo de TUNEL, los núcleos celulares se tiñeron con DAPI y las células se visualizaron utilizando microscopio de formación de imágenes Axioplan. A. cuadros representativos de las células LNCaP transfectadas con cualquiera de
TCTP CD - o
Luc
-siRNA durante 72 horas y se trató con DSMO o TG durante 36 horas durante la transfección. células TUNEL positivas aparecen como puntos rojos. Las flechas indican células apoptóticas. B. Cuantificación de incidencia apoptosis. Los datos muestran el porcentaje de células viables después del tratamiento de 36 h con TG en las células transfectadas con
TCTP
o
Luc siRNA
. Las columnas representan la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado y las barras representan ± SEM con *: P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa
El descenso de regulación de TCTP Los resultados en la regulación positiva de la respuesta inmune genes en las células LNCaP.
con el fin de dilucidar las vías TCTP pueden afectar en células de cáncer de próstata, se realizó un perfilado de la expresión génica global en las células TCTP desmontables en comparación con las células de control LNCaP. knockdown TCTP significativa se confirmó tanto en ARNm y proteínas (datos no presentados). Los datos fueron analizados utilizando dos métodos: el análisis estadístico de microarrays (SAM) y la función de selección de subconjuntos (SFS) herramientas implementadas en J-Express [29]. De los 15 genes más significativamente regulado determinados por cada análisis, nueve resultaron ser significativo por ambos métodos, como se ilustra en el diagrama de Venn en la Figura 4A. La figura 4B muestra la altura o baja regulación de algunos de los genes, mientras que la lista lo largo de los genes regulados significativamente mayor en la matriz, su ontología, función conocida y definición se representan en la Figura 4C. La mayoría de los genes predichos ser regulada de manera significativa sobre TCTP desmontables están involucrados en la vía de señalización de interferón y /o relacionados con las respuestas inmunes. La expresión de seis de estos genes (IFIT1, SLITRK3, IFI44L, IFIT3, OAS2 y MX1) fue validado por qPCR (Figuras 5A-F). Estos resultados implican que TCTP modula la respuesta inmune en células de cáncer de próstata.
células LNCaP fueron transfectadas con siRNA contra
TCTP
o
Luciferase
durante 72 h, el ARN se aisló y se utilizó en perfiles de expresión génica global como se describe en Materiales y Métodos. A. diagrama de Venn de los genes que son regulados de manera significativa por perfiles de expresión génica. B. representación de mapa de calor de los genes altura o hacia abajo-regulada en respuesta a
TCTP
caída. El rojo y el verde representan los genes regulados negativamente hacia arriba y, respectivamente. C. Lista de los diez genes regulados significativamente mayor con sus números de acceso, y el proceso de definición de ontologías para el que están implicados en. El factor de cambio en relación con las células tratadas se indican
luciferasa
siRNA.
A-F. qPCR se utiliza para evaluar la expresión de genes previsto que se expresó diferencialmente en las células transfectadas con siRNA-Luc frente TCTP-siRNA. La expresión de mRNA se normalizó a
GAPDH Opiniones y se calculó con relación a las muestras Luc-siRNA (puesto a 1). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Todas las barras de error representan ± SEM. La significación estadística se evaluó a través de dos colas, se combina la prueba t de Student con *: P & lt; 0,05 y **: P & lt; 0,01 se consideraron como significativos
Crecimiento de células recombinantes TCTP induce el cáncer de próstata
La forma secretada de TCTP previamente se ha demostrado que induce la expresión de varios mediadores, iniciar los eventos de señalización distintas y conducir a un aumento en la proliferación celular de las células inmunes [30] - [32]. Desde TCTP está presente en los fluidos prostáticos [12], puede tener una función extracelular en células de cáncer de próstata. Para evaluar esta posibilidad, hemos hecho TCTP recombinante (rTCTP) en
E. coli Opiniones y determinó su actividad biológica en células BEAS-2B en comparación con glutatión S-transferasa recombinante (RGST) como control [33]. células BEAS-2B se trataron con rTCTP o RGST a una concentración final de 1,0 mg /ml durante 1 h y
producción-8 IL
ARNm se determinó por qPCR.
IL-8 expresión
mRNA fue significativamente mayor en las células tratadas con rTCTP en comparación con las células tratadas con RGST (Figura 6A) que indica que el rTCTP es biológicamente activa. células LNCaP se trataron con 1,0 mg /ml rTCTP o RGST y se realizó un ensayo de formación de colonias. Después de dos semanas en cultivo con la exposición continua a las proteínas recombinantes, las células fueron fijadas y teñidas para visualizar las colonias. Como se muestra en las figuras 6B y 6C, había un número significativamente mayor de colonias formadas por las células tratadas con rTCTP en comparación con las células tratadas con RGST. Estos datos indican que rTCTP tiene un efecto /pro-supervivencia proliferativa en las células LNCaP y sugieren un papel de TCTP secretada en el crecimiento de células de cáncer de próstata.
A. células BEAS-2B se trataron con TCTP recombinante o GST (rTCTP y RGST) a una concentración final de 1,0 mg /ml, se extrajo RNA total, ADNc sintetizados y qPCR realizaron. GAPDH se utilizó como gen de referencia y los valores presentados son en relación con GST (ajustado a 1). ensayo de formación de colonias en las células B. LNCaP tratadas con rTCTP o RGST. Las células se cultivaron en presencia de rTCTP o RGST a una concentración final de 1,0 mg /ml para dos semanas y las colonias formadas se visualizaron con 0,1% de cristal violeta. El área cubierta en cada placa por las colonias se midió y se representó como porcentaje de la superficie total de la placa. C. se muestran dos imágenes representativas. El experimento se llevó a cabo por triplicado en tres ocasiones. Las barras de error representan ± SEM. La significación estadística se evaluó a través de dos colas, emparejado prueba t de Student. La significación se indica con asterisco, p. & Lt; 0,05
Expresión TCTP está regulada positivamente en el cáncer de próstata en comparación con la próstata normal
Desde TCTP se expresa en la próstata normal, así como regulado por