Extracto
Antecedentes
Más de 100.000 productos químicos están en uso, pero no se han realizado pruebas para determinar su seguridad. Para superar las limitaciones en el bioensayo cáncer se exploran varias estrategias de ensayo alternativos. La incapacidad para controlar la aparición de forma no invasiva y la progresión de los límites de la enfermedad, sin embargo, el valor de las estrategias de prueba actuales. Aquí, se presenta la aplicación de
in vivo
de imágenes a un modelo de ratón transgénico c-Myc de cáncer de hígado para el desarrollo de un bioensayo cáncer de corto plazo.
Metodología /Principales conclusiones
μCT y
18 F-FDG μPET se utilizaron para detectar y cuantificar las lesiones tumorales después del tratamiento con el carcinógeno genotóxico NDEA, el tumor agente promotor de BHT o el paracetamol hepatotoxina. El crecimiento del tumor fue investigado entre las edades de 4 a 8,5 meses y de imagen μCT lesiones hepáticas detectado contraste mejorado, así como la diseminación metastásica con alta sensibilidad y precisión según lo confirmado por histopatología. Se observaron diferencias significativas en el inicio del crecimiento del tumor, la carga tumoral y metabolismo de la glucosa, cuando el grupo de tratamiento NDEA se comparó con cualquiera de los otros grupos de tratamiento. NDEA tratamiento de ratones transgénicos c-Myc se aceleró significativamente el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica causada por HC en al pulmón, pero este tratamiento también indujo el crecimiento del cáncer de pulmón primario. Por el contrario, el BHT y el paracetamol no promovieron hepatocarcinogénesis.
Conclusiones /Importancia
El presente estudio pone de manifiesto la exactitud de
in vivo
de imagen para definir el crecimiento del tumor, la carga tumoral, número lesión y la diseminación metastásica. En consecuencia, la aplicación de
in vivo
técnicas de imagen a modelos animales transgénicos pueda permitir la bioensayos de cáncer a corto plazo para mejorar significativamente la identificación de los peligros y el seguimiento de los exámenes de los diferentes órganos por métodos no invasivos.
Visto: Hueper K, M Elalfy, Laenger F, R halter, Rodt T, Galanski M, et al. (2012) PET /CT Imaging de c-Myc ratones transgénicos Identifica el genotóxico N-nitroso-dietilamina como carcinógeno en un corto plazo del cáncer del ensayo biológico. PLoS ONE 7 (2): e30432. doi: 10.1371 /journal.pone.0030432
Editor: Martin W. Brechbiel, Instituto Nacional de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2011; Aceptado 20 de diciembre de 2011; Publicado: 2 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Hueper et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Partes de los trabajos fueron financiados por el Ministerio de Ciencia y Cultura, Baja Sajonia, Alemania; el número de concesión: 25A.5-76251-99-3 /00 a Juergen Borlak, un PHD-beca del Ministerio egipcio de Educación Superior a Mahmoud Elalfy, una beca de investigación de GE Healthcare dado al Instituto Fraunhofer de Toxicología y Medicina Experimental, Hannover , Alemania y la Fundación alemana de Investigación (DFG) para cubrir los gastos de publicación. En particular, los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) se observa con frecuencia en los bioensayos de cáncer como resultado de la exposición de por vida a cualquiera de los fármacos experimentales o un rango diverso de productos químicos. En concreto, los carcinógenos se pueden distinguir por su modo de acción algunos de los cuales ejercen la actividad, ya sea a través de daño en el ADN y por lo tanto se define como carcinógenos genotóxicos tales como N-nitrosodietilamina (NDEA), mientras que otros no dañan el ADN, pero causan perturbaciones en el proceso biológico que, en última instancia conduce a un crecimiento incontrolado y se denominan agentes carcinógenos no genotóxicos. Este último grupo de carcinógenos es inherentemente más difícil de predecir. Además, los fármacos y productos químicos no pueden ser por sí mismos, pero tumorigénico promover el crecimiento del tumor.
Por otra parte, mientras que el proceso de evaluación de la seguridad de los productos químicos está armonizada a nivel internacional, sigue siendo costoso y consume mucho tiempo. Con el fin de reducir el tiempo necesario para una evaluación del riesgo carcinogénico de medicamentos y productos químicos, nuevos modelos de animales transgénicos se han desarrollado y outs de lectura biológicos de tales modelos se comparan con el bioensayo cáncer establecido. Sin embargo, los bioensayos de cáncer comunes requieren un periodo de observación de 2 años y utilizan un gran número de animales que se somete posteriormente a exámenes de histopatología [1].
Para superar las limitaciones en el bioensayo de cáncer de varias estrategias de experimentación alternativas están siendo explorado, ya sea con animales genéticamente modificados,
in vitro
ensayos basados en células o modelos informatizados [2] - [7]. En este sentido animales de laboratorio genéticamente modificados pueden resultar útiles en la detección temprana de los carcinógenos del hígado y por lo tanto pueden permitir estudios de carcinogenicidad a corto plazo. Hasta ahora, se han descrito varios modelos knock-out, así como modelos de ratones transgénicos de carcinoma hepatocelular [8]. Por ejemplo se evaluó la respuesta a la carcinógeno genotóxico NDEA en un [9], así como en el modelo p53 deficientes rasH2 transgénico [10] - [12]. Desafortunadamente, ambos modelos no identificaron NDEA como carcinógeno de hígado en bioensayos de cáncer a corto plazo de representación esta estrategia menos robusto para la detección de agentes carcinógenos específicos de órganos con estos dos modelos genéticos.
Además, los ensayos de carcinogenicidad en roedores estándar es de no puede supervisar la aparición de forma no invasiva y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, las técnicas de imagen como la tomografía computarizada micro (μCT) y tomografía por emisión de positrones micro (μPET) pueden llegar a ser un método de elección en estudios preclínicos para detectar
in vivo
lesiones tumorales y para cuantificar la carga de tumor.
In vivo
imágenes contribuirá así al refinamiento de bioensayos de cáncer y ofrecer información adicional, tal como una identificación de la diseminación metastásica y el crecimiento de tumores secundarios en el momento oportuno [13].
De hecho, el reciente avance en las tecnologías de formación de imágenes pequeñas animales nos animaron a examinar la utilidad de μCT y μPET para la detección de las lesiones tumorales en un modelo de ratón transgénico de cáncer de hígado. Con este tipo de tecnologías que permitan μCT ofrece una resolución de las estructuras anatómicas de aproximadamente 50 micras, por lo tanto, proporcionar una considerable información morfológica. Esto requiere, sin embargo, el uso de un agente de contraste específica de órganos para permitir formación de imágenes de la morfología parenquimatosa. En particular, el modelo de ratón transgénico c-Myc se desarrolla de manera eficiente el cáncer de hígado en un corto período de tiempo. En este modelo genético, c-Myc se dirige al hígado mediante el uso del promotor de α1-antitripsina que se activa exclusivamente en el hígado. Este modelo fue desarrollado originalmente por Dalemans et al. [14], pero no ha sido explorado por su utilidad en bioensayos de cáncer a corto plazo, hasta ahora. En particular, los estudios de patología molecular humanos identificados c-Myc como hiperactivos y sobreexpresa en la mayoría de carcinoma hepatocelular humano [15], por lo tanto proporcionar un racional para una evaluación de este modelo de enfermedad.
Mientras que algunos informes describen la aplicación de imágenes anatómicas y metabólicas de los tumores malignos primarios de hígado en roedores [16] - [19], el objetivo de este estudio fue, en primer lugar, el desarrollo de estrategias y definir los parámetros para la detección y la cuantificación de las lesiones hepáticas por
in vivo
con contraste μCT y
18 F-FDG μPET imagen metabólica de la captación de glucosa y en segundo lugar, para evaluar la exactitud de estos métodos cuando se compara con la histopatología y en tercer lugar, para determinar la utilidad del modelo de ratón transgénico c-Myc en predecir con precisión el carcinógeno de hígado en NDEA bioensayo corto plazo y por lo tanto para evaluar si una combinación de
in vivo
modalidades de imagen y el uso de modelos de ratón genéticos pueden contribuir al desarrollo de bioensayos de cáncer a corto plazo para la detección precoz de drogas peligrosas y productos químicos.
Materiales y Métodos
modelo de tumor transgénico
Todo el trabajo con animales sigue estrictamente la política de Servicio de Salud Pública en el cuidado humano y el uso de animales de laboratorio. El permiso para llevar a cabo el estudio se obtuvo por el animal ética de bienestar comité de la ciudad de Hannover, Alemania (Tierversuchsvorhaben 33.9-42502-04-08 /1619).
c-Myc ratones transgénicos eran el tipo de regalo Dalemans et al. [14]. Los animales se mantuvieron como homocigotos en el fondo C57 /Bl6 y este fondo se utiliza ampliamente en modelos de enfermedad transgénicos tales como la rasH2 y p53 modelo deficiente. Cabe destacar que el transgén (véase la figura S1) se compone del marco de lectura abierto c-Myc y secuencias reguladoras del promotor de α1-antitripsina para permitir la expresión de genes específicos de hígado de c-Myc. Este modelo de enfermedad genética tiene una incidencia de cáncer de hígado del 100%
El transgén se detectó por PCR utilizando el cebador directo:. CACTGCGAGGGGTTCTGGAGAGGC 5'-3 'y el cebador inverso: 5'-ATCGTCGTGGCTGTCTGCTGG-3' . Se utilizaron las siguientes condiciones de ensayo de PCR: 15 min., 95 ° C, 1 min 60 ° C, 1 min 70 ° C, 1 min 95 ° C, 31 ciclos
En total, 120 c-myc ratones transgénicos eran examinado por
in vivo
formación de imágenes y /o histopatología, mientras que los controles no transgénicos fueron estudiados por solamente histopatología, ya que estos animales no tienen tumores. Los ratones fueron mantenidos como grupos de animales con 1 a 4 ratones por jaula en serrín en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, y 50% de humedad relativa y una temperatura ambiente de 22 ° C. Los animales recibieron comida estandarizada y beber agua ad libitum (Zucht, Ssniff M- /, 10 mm, dieta completa para los ratones, Ssniff Especificaciones GmbH, DE-59494, www.ssniff.de).
Diseño del estudio y tratamiento de los animales con NDEA, hidroxi tolueno butilado (BHT) y paracetamol
Los animales se dividieron en 7 grupos de 24 animales cada uno y consistieron en n = 12 machos y n = 12 hembras. El tratamiento de ratones transgénicos con inyección intraperitoneal de NDEA, BHT o paracetamol (Sigma Aldrich, Alemania, con una pureza de & gt; 99%), se inició a la edad de 2 meses. El transgénicas y los animales de control no transgénicas fueron también tratados con sólo el vehículo, es decir, aceite de maíz o solución salina fisiológica (Sigma Aldrich, Alemania). ratones NDEA se trataron una vez a la semana por inyección de 75 mg /g NDEA en solución salina durante un periodo de 6 semanas, mientras que los animales que recibieron 300 mg /g BHT en aceite de maíz se trataron una vez a la semana durante 8 semanas. Por otra parte, 100 mg /g de paracetamol en solución salina sirvió como hepatotoxina no es cancerígeno, y este fármaco se administró una vez al día durante 5 días a la semana durante un período de 8 semanas (ver Tabla 1 para el régimen de dosificación).
Como C57BL /6 ratones son resistentes a hepatocarcinogénesis inducida por NDEA [9] un grupo de tratamiento no transgénico NDEA y BHT no se incluyó en el diseño del estudio es de gran interés que se informó de una falta similar de sensibilidad para p53 deficiente y para ratones transgénicos rasH2 /CB6F1 que fueron criados en el mismo C57BL /6 de fondo [11]. Del mismo modo, se ha demostrado anteriormente que BHT aumenta la formación de tumores solamente si se administra después de la exposición al uretano agente genotóxico, pero no tiene efecto en uno de sus [20] o es incluso de protección, si se administra antes de un carcinógeno [21], [22]. Un resumen de la pauta de tratamiento se da en la Tabla 1.
Dosis selección
Sobre la base de los datos publicados anteriormente, en los que se investigaron diferentes dosis de NDEA (intervalo de dosis 75 a 200 mg /g) a causa la formación de tumores en roedores no transgénicos [23], [24], [25], [26], una dosis de /g de peso corporal de 75 g se seleccionó y se administra una vez por semana durante 6 semanas por administración intraperitoneal. En el caso de BHT se administró una dosis de 300 mg /g de peso corporal. Esta dosis se informó para causar la inducción de tumores en el hígado [20]. Finalmente, paracetamol sirvió como el hepatotoxina no carcinogénico y una dosis de 100 mg /g de peso corporal se le dio i.p. una vez al día durante 5 días a la semana durante un período de 8 semanas
En vivo de imágenes de animales transgénicos por μCT y μPET
en cuatro momentos diferentes - es decir, a la edad de 4, 5.5, 7 y 8,5 meses -
in vivo se emplearon
μCT y μPET de imágenes; los animales se sacrificaron después para histopatología.
Todos los procedimientos de formación de imágenes se realizaron bajo anestesia por inhalación con isoflurano (Isoba veterinario., Essex Pharma, Alemania) a una concentración de 4% para la inducción de la anestesia y 1-2% para el mantenimiento . Los ratones se colocaron en posición boca abajo en una cama de temperatura controlada a 39 ° C (T /Pump, Gaymar, Orchard Park, Nueva York, EE.UU.) que permite los cambios entre las modalidades de imagen sin reposicionamiento e isoflurano se suministran a través de un cono de la nariz (Cumbre de anestesia Soluciones, de Bend , OR, EE.UU.). La respiración animal era espontánea, y la respiración se monitorizó continuamente mediante un transductor de presión pequeña (Biovet, imágenes M2M, Newark, NJ, EE.UU.). La respiración se mantuvo a una tasa de entre 60 y 100 por minuto. Después de la adquisición de datos de imagen el tiempo de recuperación de los animales de la anestesia fue generalmente menos de cinco minutos. En general, los procedimientos fueron bien toleradas.
En concreto, μCT secuencial y
18 F-FDG μPET se llevaron a cabo con un total de 60 animales, como se muestra en la Tabla 1. Los ratones fueron imágenes a la edad de 4 ( 1 de sacrificio), 5.5 (segundo sacrificio), 7 (3ª sacrificio) y 8,5 meses (4ª sacrificio). Los animales de control transgénicos fueron examinados a la edad de 8,5 meses solamente (cuarto de sacrificio), aunque algunos de formación de imágenes de contraste mejorado de exploración se llevó a cabo a la edad de 2, 5 y 7 meses. Todos los animales se sacrificaron 2 días después de la formación de imágenes PET. En este momento el trazador radioactivo disminuyó por debajo del nivel de detección. Los hallazgos de imagen fueron corroboradas por histopatología estándar como se detalla a continuación.
Contraste mejorado de imágenes μCT
Todos los animales se mantuvieron en ayunas antes de la imagen durante aproximadamente 6 horas. Tres horas antes de la tomografía computarizada ratones anestesiados recibieron una inyección intravenosa de un agente de contraste yodado específica del hígado (dhog, Fenestra LC, ARTE Inc., Saint-Laurent, Canadá) a un volumen de aproximadamente 200-300 l (10 l /g de peso corporal) en la vena de la cola. La adquisición de datos de imagen se llevó a cabo según lo recomendado por el fabricante y los protocolos publicados anteriormente [18], [19].
La exploración μCT se hizo con un pequeño escáner de tomografía de alta resolución animales computarizada (eXplore Locus, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido). Los parámetros de exploración se establecieron de la siguiente manera: voltaje del tubo 80 kVp, tubo de corriente 450 mu, número de adquisición 360, el número de puntos de vista 720, tiempo de exposición de 100 ms, una media por trama, axial campo de visión 33 mm. Exploraciones fueron grabadas sin control del movimiento respiratorio. la duración del análisis total era de unos 12 minutos.
Los datos de imagen se reconstruyó utilizando un algoritmo de haz cónico en un cluster Linux de 8 nodos. El tamaño del voxel que resulta del conjunto de datos isotrópica fue de 45 micras. valores de atenuación arbitrarias se convirtieron a la escala de Hounsfield utilizando un cuerpo de calibración con inserciones de agua, aire y hueso.
μPET imágenes
ratones anestesiados se les administró una inyección intraperitoneal (ip) de 10 MBq (
18 F) -2-fluoro-2-desoxiglucosa en un volumen total de 50-100 l solución salina isotónica estéril suministrado por el Departamento de Medicina Nuclear, Facultad de Medicina de Hannover, Alemania. Los animales fueron sometidos a TAC secuencial y la imagen PET que requirió múltiples inyecciones en la vena de la cola a las posibles lesiones de causa vascular y embolización en el sitio de la inyección. Como i.v. TC requerido administración de Fenestra (véase más arriba)
18 F-FDG fue dada por vía intraperitoneal inyección. Esto puede retrasar la adquisición estándar de la FDG, sin embargo, no influyó en la interpretación general de los datos con la captación de glucosa es proporcional al crecimiento del tumor como se evidencia en el presente estudio. Por lo tanto, después de CT imagen adquisiciones
18 F-FDG se administró a los ratones mediante inyección i.p. inyección. Los animales se mantuvieron anestesiados y después de unos 35 minutos fueron transferidos en la misma cama /posición del escáner CT para el escáner PET. Las imágenes estáticas se adquirieron exactamente después de 45 minutos de la inyección del trazador utilizando una cámara PET pequeño animal de alta resolución (eXplore Vista, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido). El tiempo total de adquisición fue de 30 minutos para una sola posición de la cama. Las imágenes fueron corregidos para eventos aleatorios y dispersión antes de la reconstrucción con un 3D-FORE /algoritmo iterativo 2D-OSEM. No se utilizó la corrección de atenuación.
Imagen análisis
μCT conjuntos de datos se visualizaron y se analizaron usando los paquetes de software Microview 2.2 (GE Healthcare, Chalfont St. Diles, Reino Unido), 2.0 (MeVisLab MEVIS Medical Solutions AG, Bremen, Alemania) y OsiriX (v.3.7.1 32 bits, Pixmeo Sarl). Volumen total de hígado se calculó utilizando el módulo LiveWireMacro (MeVisLab 2,0) que utiliza un método de segmentación semiautomática basada en contorno. lesiones hepáticas focales se contaron y se cuantificaron mediante 2D-medición del diámetro más grande. El diámetro (d) de las lesiones se utilizó para estimado que el volumen del tumor mediante la siguiente fórmula: volumen del tumor (V) = 1/6 π × × d
3. Se añadieron los volúmenes de todas las lesiones hepáticas para determinar el volumen total del tumor. El porcentaje de tumores del hígado se calculó como la relación entre el volumen tumoral total (ml) y el volumen total del hígado (ml).
Rígido registro de PET y CT conjuntos de datos se basa en puntos de referencia anatómicos y se utiliza para generar conjuntos de datos fusionados. Regiones de interés (ROI) se definieron de forma manual para las lesiones hepáticas focales de un diámetro superior a 5 mm, como se detectó en μCT y la imagen
18 F-FDG μPET. El fondo de la señal (no tumoral) se determinó mediante la colocación de una ROI en el parénquima hepático libre de tumor y el recuento máximo por volumen se determinó para cada ROI para estimar los coeficientes de tumor con respecto a no tumor.
histopatología
Dos días después de las últimas imágenes ratones fueron sacrificados y los pulmones y el hígado fueron retirados para histopatología. Los pulmones y el hígado enteras se sumergieron en formaldehído tamponado del 4% y embebidos en parafina por procedimientos estándar de laboratorio. Posteriormente, se prepararon 4-5 micras secciones de los bloques espaciados en un intervalo de 500 m desde el núcleo central del tejido embebido y se tiñeron con H & amp; E. Estas diapositivas fueron examinados utilizando un microscopio Olympus BX51 a un aumento original × 40. 4 hallazgos morfológicos diferentes se registraron: 1) parénquima hepático normal tal como se define por el tamaño celular y la preservación de la arquitectura, 2) difusa lesión tóxica del parénquima hepático como se define en globo, la degeneración, pero la preservación de la arquitectura, 3) nódulos displásicos con agregados nodulares de las células del hígado agrandados con displasia de bajo grado celular, 4) el carcinoma hepatocelular según la definición de atipia celular y la arquitectura trabecular con varias capas o pseudoglands. se registraron tipo, número y tamaño para todas las lesiones y se comparan con los resultados de la obtención de imágenes radiológicas. Por otra parte, la carga tumoral se anotó semi-cuantitativamente mediante incrementos del 5%.
El análisis estadístico
El
in vivo
Imaged volumen del hígado y de la
ex vivo
medido el peso del hígado se registraron y el volumen del hígado y el volumen del tumor se calcula y se define como el porcentaje tumor. Todos los valores se expresan como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba de correlación de Pearson (r es el coeficiente de correlación) y hallazgos de las imágenes fueron validados por histopatología como se ha descrito anteriormente
El tumor-a-no tumoral ratios se definen para las pequeñas (& lt; 5. mm), medio (5-10 mm) y lesiones de gran tamaño (& gt; 10 mm) y las diferencias estadísticamente significativas se determinaron utilizando el ANOVA de una vía y la Bonferroni post-test
en diferentes puntos de tiempo y para. se compararon todos los grupos de estudio de las medias y desviaciones estándar del porcentaje de tumores, la multiplicación tumoral y la relación tumor-a-no tumoral. El análisis de varianza de una vía y la prueba de Bonferroni se utilizaron para evaluar la significación estadística (p-valor de corte determinado como 0,05).
Todos los análisis estadísticos se realizaron y se visualizaron utilizando SPSS Statistics 17.0 y GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software , Inc.).
resultados
morfología del hígado con contraste de imagen y metabólica de la glucosa
al inicio del estudio ninguno de los animales transgénicos tenían tumores hepáticos o lesiones precursoras mientras que al final del estudio se detectaron un total de 244 lesiones hepáticas que variaban en tamaño entre 0,9 mm y 25,0 mm. En particular, la inyección intravenosa del agente de contraste yodado específico de hígado dhog define lesiones tumorales como hypodense en comparación con el parénquima hepático circundante normal (Figura 1). Las lesiones de un tamaño de & gt; 1 mm se pudo identificar con certeza por μCT pero no con FDG μPET para las lesiones de & lt; 5 mm. En los animales con una alta carga tumoral lesiones individuales no siempre podían ser resueltos por tumores individuales que se habían fusionado en conjunto (tumores de colisión).
cortes axiales de TC (A) y una FDG-PET (B) así como cortes coronales de una tomografía computarizada (C) y vista macroscópico (D) de un hígado de un ratón explantados NDEA tratada a la edad de 7 meses. Cuando se compara con los tumores normales parénquima hepático son hypodens en CT como la captación del agente de contraste específico del hígado se reduce. La PET revelan lesiones tumorales mediante un aumento de la captación del marcador debido a metabolismo de la glucosa mejorada. Debido a la etapa avanzada de la enfermedad de los tumores de diferente tamaño se había fusionado juntos. K = riñón, L = pulmón, S = columna vertebral, Sp = bazo, T = tumor.
Evaluación del crecimiento y la multiplicidad de las lesiones tumorales
El tratamiento de ratones transgénicos con la genotóxico hepatocarcinógeno NDEA rápidamente inducido el desarrollo de HCC. A la edad de 4 meses (1 de sacrificio) 1 de cada 6 animales tenían HCC, y la incidencia del tumor ya era 100% a la edad de 5,5 meses (segundo sacrificio). Por formación de imágenes CT se determinó el volumen del hígado y el tumor y la relación resultante se define como porcentaje tumor (Figura 2A). En general, no hubo diferencia en la incidencia de tumores o el volumen del tumor cuando macho y ratones transgénicos c-myc hembra tratadas con NDEA se compararon (Tabla 2).
(A) El volumen del órgano y tumor fue evaluada por CT y por histopatología. Representado es el porcentaje del volumen tumoral en diferentes etapas medidos ya sea por histopatología (gris claro) o por un mayor contraste de imagen de TC (gris oscuro). Se muestra el diámetro medio de las lesiones (B) y el número total de lesiones (C). * P & lt; 0,05. ** P & lt;. 0,01
Los datos fueron validados por histopatología como se detalla a continuación. Hubo una buena concordancia entre la histopatología y
in vivo
resultados de las imágenes. Con respecto al crecimiento del tumor se observó la mayor diferencia entre la 1ª y 2ª sacrificio, donde CT-scan definen los volúmenes tumorales porcentuales del 2,8% y 58,0%, respectivamente. A la edad de 8,5 meses (cuarta sacrificio) el volumen del tumor porcentaje fue 69,3%. El diámetro y el número de lesiones se determinaron mediante formación de imágenes CT y por histopatología. Con NDEA las lesiones tumorales aumentaron el tiempo de forma dependiente de 2,2 ± 0,3 mm (primera sacrificio) a 6,5 ± 0,9 mm (Figura 2B). Del mismo modo, el número de tumores por NDEA animales tratados aumentaron de la primera a la segunda sacrificio pero disminuyeron después posiblemente como resultado de la fusión de los tumores (Figura 2C).
El crecimiento del tumor dependiente del tiempo también se representa en la Figura 3, donde CT y las exploraciones PET de animales tratados NDEA fueron adquiridos a la edad de 5,5 y 7 meses, respectivamente. Aquí el metabolismo de la glucosa en las lesiones hepáticas se determinó in vivo
18 F-FDG μPET imágenes.
(A) Imagen de TC muestra una lesión solo tumor (A1) en un ratón de 5,5 meses de edad, sin aumento
captación de 18F-FDG (A2). La imagen de CT y PET fundido se representa en A3. Se observa (B) A la edad de 7 meses de crecimiento expansivo tumor (B1), así como un aumento de la captación del trazador en el carcinoma hepatocelular (B2). La imagen de CT y PET fundido se representa en B3. G = vesícula biliar, K = riñón, hígado L =, S = columna vertebral, St = estómago, T = tumor.
Para permitir la localización anatómica exacta de la captación focal
18 F-FDG, el registro y la fusión de μCT y μPET conjuntos de datos fueron adquiridos antes del análisis cuantitativo de la formación de imágenes de la glucosa (véase la figura 3). Para ello, los animales fueron colocados en posición boca abajo en una cama de temperatura controlada sin tener que desplazar la multimodalidad de los animales cuando se cambiaron las modalidades de imagen. Así, los animales se mantuvieron bajo anestesia por inhalación y en la misma posición de la cama entre CT y PET para permitir el registro de las exploraciones.
La
18 F-FDG-absorción fue principalmente homogénea entre las lesiones hepáticas. Algunas lesiones más grandes muestran una absorción homogénea de
18 F-FDG que era particularmente prominente en las partes periféricas del tumor. captación del trazador no homogénea se asoció con quísticas y necróticas cambios del tumor adyacentes al tejido tumoral vital como se evidencia por histopatología.
En general, la relación media del tumor-a-no-tumor era dependiente del tamaño del tumor (Figura 4). Para lesiones mayores de 10 mm de la relación tumor-a no tumoral fue de 3,3 ± 0,6 y se determinó que un aumento estadísticamente significativo (p & lt; 0,05) en comparación con las lesiones con un diámetro de 5 a 10 mm (1,6 ± 0,2). Para las lesiones más pequeñas la relación tumor-a no tumor fue 0,98 ± 0,03, por lo tanto sugiere que no hay aumento en
18 F-FDG-absorción en comparación con el parénquima hepático normal.
Tumor-a-no relación de tumor, determinado por formación de imágenes de glucosa PET, se aumentó de manera significativa en las lesiones de & gt; 10 mm. * P & lt; 0,05. ** P & lt;. 0.01
Figura 5 resume PET /TC y la fusión modalidad de imágenes obtenidas de los ratones transgénicos tratados con solución salina (Figura 5A), BHT (Figura 5B) o NDEA (Figura 5C ). Nota, en 1 de los 6 animales tratados con BHT un tumor de & gt;. Se observó 10 mm
Se representan la morfología del hígado tal como se determina por CT (A1, B1, C1), el metabolismo de la glucosa (A2 , B2, C2) y fusionadas de PET y la tomografía computarizada (A3, B3, C3) de los animales transgénicos tratados con solución salina fisiológica (a), con BHT (B) o con NDEA (C) a la edad de 8,5 meses. Nota, se observó después del tratamiento con el crecimiento del tumor expansiva NDEA con gran aumento de peso del hígado y la compresión y el desplazamiento de los órganos adyacentes. Aquí, las lesiones mostraron un aumento de la captación de 18F-FDG. En cambio, en los animales de control correspondientes tratados con solución salina fisiológica no se observaron lesiones hepáticas. Después del tratamiento con lesiones pequeñas hypodens BHT se dio cuenta, pero el PET no mostró un aumento de la captación de 18F-FDG. K = riñón, hígado L =, S = columna vertebral, Sp = bazo, St = estómago, T = tumor.
Por otra parte, el tratamiento de animales transgénicos con el paracetamol hepatotoxina no indujo el crecimiento del tumor a lo determinado por histopatología (ver más abajo).
Validación de los resultados de las imágenes por histopatología
la histopatología evidenció hígado normal con la preservación completa de la arquitectura lobular, los conductos biliares y el parénquima vascular en ratones no transgénicos. En tratados con vehículo c-Myc animales transgénicos se observó displasia difusa (Figura 6A). Un pequeño número de animales transgénicos que recibieron solución salina fisiológica (1/24 animales) o aceite de maíz (4/24 animales), así como los tratados BHT animales (3/24 animales) muestra nódulos hepáticos displásicos uni o multifocales sustitución 10-80 % del parénquima hepático que variaban en tamaño entre 1 y 10 mm. Estos focos consistieron en hepatocitos agrandados con un citoplasma nuclear conservado, uniformes para bicelular capas y una arquitectura global nodular. Los animales transgénicos tratados con paracetamol fueron similares en la histopatología como se observa con los controles tratados con vehículo (imagen no se muestra). Un animal de cada uno de los aceite de maíz y solución salina fisiológica tratar animales transgénicos muestra pequeños focos de carcinoma hepatocelular. Aquí el tamaño de las células fue menor en comparación con los focos displásicos con un aumento en el tamaño nuclear y una distorsión significativa de la arquitectura revelando trabécula de varias capas y áreas de pseudoglands quística.
(A) difusa displasia de células hepáticas de solución salina fisiológica (= vehículo) tratada ratones transgénicos en (A1) de 50 y (A2) de ampliación de 200 veces. (B) la displasia de células grandes de diversos grados en los animales tratados BHT al (B1) 50 y (B2) de aumento de 200 veces. (C) El carcinoma hepatocelular de un ratón transgénico tratados con el carcinógeno genotóxico NDEA al (C1) y 50 (C2) de aumento de 200 veces.
El número, tamaño y agresividad biológica de las lesiones hepáticas fueron del todo relacionado con el tratamiento NDEA (Figura 6C). se observó carcinoma hepatocelular con la arquitectura trabecular de capas múltiples al igual que las zonas pseudoglandulares y espacios quísticos a veces dentro de los tumores. De los 18 animales examinados por histopatología reveló 13 carcinomas hepatocelular algunos de los cuales (n = 10 animales) que aparecen nódulos displásicos adyacentes al carcinoma hepatocelular también. Además, 3 animales se identificaron con nódulos displásicos sólo mientras está en 8 casos el CHC también fue acompañada por la proliferación de las vías biliares marcada. Todo HCC tenía áreas de la arquitectura trabecular de varias capas, la mayoría también revelaron áreas pseudoglandulares a veces con grandes espacios quística y peliosis similar. Debido a la relación espacial y temporal cerca de nódulos displásicos y HCC en los hígados de los animales transgénicos parecía razonable para definir los nódulos displásicos como precursores y las lesiones tempranas de cáncer de hígado. Aquí, el tamaño de las lesiones se puede usar como un medio para diferenciar las lesiones hepáticas mediante el cual los nódulos displásicos eran más pequeños que 5 mm y HCC eran más grandes que 10 mm.
Algunos animales tratados con NDEA muestran metástasis del hígado primario el cáncer de pulmón en (Figura 7B) pero el tratamiento con NDEA también inducen el cáncer de pulmón primario como se evidencia por
in vivo
de imágenes y la histopatología (Figura 7C). Por lo tanto, algunos animales fueron cargados por el crecimiento del tumor primario y secundario en dos órganos diferentes.
(A) parénquima pulmonar normal de un animal de control tratado con vehículo, como se muestra por CT (A1) y por histopatología (A2). CT de NDEA animales tratados a la edad de 8,5 meses. Se representan los nódulos pulmonares de diferentes tamaños (flechas rojas). Histopatología evidenció esos nódulos pulmonares como metástasis de un carcinoma hepatocelular pobremente diferenciado (B2) y como adenocarcinoma bien del pulmón (C2).
Precisión
in vivo de imágenes
Hubo una correlación altamente significativa entre el volumen del hígado, calculado por la segmentación semiautomática de CT-scans, y el peso del hígado, determinado
ex vivo
(coeficiente de correlación r = 0,99, p & lt; 0,001). Además, el volumen hepático calculado correlacionado con el volumen del tumor estimado (r = 0,94, p & lt; 0,001). (Ver Figura S2)
En la Figura S3 hígado en relación al peso corporal de los ratones transgénicos tratados con cualquiera de NDEA o BHT es dado.