Extracto
Antecedentes
ADN metiltransferasa (DNMT) es uno de los principales factores que median en la metilación de los genes relacionados con el cáncer, tales como receptores de TGF-β (TβRs). Esto a su vez puede resultar en una pérdida de sensibilidad a los niveles fisiológicos de TGF-β en el cáncer de próstata agresivo (CaP). Los mecanismos específicos de la función de DNMT en cáncer de próstata permanecen sin determinar. En este estudio, se describe el mecanismo de DNMT mediada por TGF-β en cáncer de próstata y su asociación con los resultados clínicos después de la prostatectomía radical.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizaron líneas celulares humanas con CaP diversos grados de capacidad invasiva para describir cómo el TGF-β media la expresión de DNMT en cáncer de próstata, y sus efectos sobre el estado de metilación de receptores de TGF-β y la capacidad invasiva de Cap in vitro e in vivo. Además, se determinó la asociación entre la expresión DNMT y el resultado clínico después de la prostatectomía radical. Hemos encontrado que las células de CaP más agresivos tenían niveles de TGF-ß significativamente más altos, una mayor expresión de DNMT, pero reducen TβRs en comparación con las células benignas de la próstata y células de cáncer de próstata menos agresivo. El bloqueo de la señalización de TGF-β o la activación de ERK (p-ERK) se asoció con una disminución dramática en la expresión de DNMT, lo que resulta en un aumento coincidente en la expresión de TβRs. El bloqueo de cualquiera de TGF-β señalización o DNMT redujo drásticamente la capacidad invasora de la tapa. La inhibición de TGF-β en un modelo TRAMP-C2 CaP en ratones C57BL /6 utilizando 1D11 se asoció con regulación a la baja de DNMTs y p-ERK y el deterioro en el crecimiento tumoral. Por último, independiente del grado de Gleason, el aumento de expresión DNMT1 se asoció con recurrencia bioquímica después del tratamiento quirúrgico para el cáncer de próstata.
Conclusiones y Importancia
Nuestros hallazgos demuestran que el tope por especie resultante de TGF-β pueden inducir la expresión de DNMTs en Cap lo cual está asociado con la metilación de sus receptores y el potencial agresivo de la tapa. Además, DNMTs es un predictor independiente de recurrencia de la enfermedad después de la prostatectomía, y puede tener implicaciones clínicas para el copete de pronóstico y la terapia
Visto:. Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, J Kozlowski , et al. (2011) TGF-β regula la expresión de ADN metiltransferasa en el cáncer de próstata, se correlaciona con capacidades agresivas, y predice la recurrencia de la enfermedad. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10.1371 /journal.pone.0025168
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 20 Junio, 2011; Aceptado: August 26, 2011; Publicado: 30 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el número de concesión 2 P50CA090386-06A2 del Instituto Nacional del cáncer, NIH, así como subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (U01 CA152738), la Sociedad Americana del cáncer, Illinois (# 08-22), Departamento de Defensa (W81XWH -09-1-0311), Portes Centro /Instituto de Medicina de Chicago (QZ), la Sociedad Americana del cáncer Institucional de Becas de Investigación (ACS-IRG 93-037-12), una subvención de la Genzyme Corporation, una beca de la Universidad Northshore Healthsystem y un regalo del Sr. Fred L. Turner. A través del empleo de SL, JH y BT, el papel de Genzyme Corporation incluye: proporcionar reactivos, que ofrece sugerencias de diseño experimental y ayudar en la preparación del manuscrito. Las otras fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SL, JH y BT son empleados de Genzyme. No hay patentes o productos en desarrollo para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
TGF-β es un factor de crecimiento pleiotrópico que se ha implicado en múltiples y, a menudo funciones diametralmente opuestas, incluyendo la proliferación celular, la detención del crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis [1], [2]. Una pregunta obvia planteada por estas diversas funciones es como el TGF-β media en estas funciones aparentemente contradictorias en el cáncer y las células benignas. En las células cancerosas, TGF-beta actúa como un promotor del crecimiento y el SIDA en la metástasis, mientras que en las células normales que aparece para inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis [3]. Características de cáncer de próstata agresivo (CaP) incluyen una pérdida gradual de la sensibilidad a TGF-β y la sobre expresión de TGF-β, que aparece para iniciar un ciclo vicioso de la progresión tumoral. Aunque es bien conocido que una reducción o pérdida de expresión de receptores de TGF-β (TβRs) permite a las células de cáncer para escapar del efecto inhibidor del crecimiento de TGF-β y para obtener una ventaja de crecimiento, el mecanismo celular (s) subyacente estos eventos en células de CaP humanos sigue siendo indefinido. Anteriormente, hemos demostrado que la pérdida de expresión TβRs por el promotor de la metilación se asocia con la insensibilidad a la inhibición del crecimiento mediada por TGF-β [4].
metilación del ADN se lleva a cabo por metiltransferasas de ADN (DNMTs). Hay por lo menos tres DNMTs funcionales que han sido identificados en los sistemas eucariotas. DNMT1 se ha implicado principalmente en el mantenimiento de los patrones de metilación que se produce durante la replicación celular, y preferentemente methylates hemi-metiladas de ADN [5]. Ha sido la metiltransferasa de mantenimiento más ampliamente estudiado y es abundante en las células tumorales y tejidos. En comparación, DNMT2 no parecen tener una actividad de metilación significativa y DNMT3L es probable que se limitan a la metilación del ADN durante el desarrollo de la línea germinal [5]. Por último, DNMT3A y DNMT3B son conocidos por ser de novo methylators de sitios CpG [6], que tienen una mayor actividad de metiltransferasa de ADN no metilado que DNMT1 y que pueden contribuir a De la metilación de novo durante la embriogénesis [7], [8]. Aunque se dice que DNMT estar asociado con algunos cánceres agresivos como los carcinomas hepatocelulares, cánceres de estómago, no pequeñas de cáncer de pulmón de células, el linfoma y el cáncer de próstata [9], [10], [11], [12], [13], su papel sigue siendo controvertido y la regulación general, la coordinación y la actividad de DNMTs está claro con diferentes tipos de cáncer. Por otra parte, no se han descrito el mecanismo de DNMTs en las células cancerosas y su asociación con capacidades malignos invasivos y los resultados clínicos después del tratamiento.
Recientemente hemos informado de que la regulación epigenética de la expresión inducida por TGF-β de Foxp3 puede ser mediada a través de la inactivación de las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), que puede regular a la baja DNMTs en células benignas [14]. Como se ha indicado anteriormente, las células y el tejido de CaP son insensibles a la inhibición del crecimiento TGF-β mediada y tienen patrones de metilación del promotor que disminuyen la expresión de TβRs (TβRI y TβRII) [4], [15], [16]. En conjunto, estos resultados indican que la falta de sensibilidad a TGF-β en algunas células de CaP es al menos en parte debido a la metilación del promotor de TβRs. Estos resultados nos han llevado a explorar las dos hipótesis siguientes en el presente estudio: 1) Es posible que haya interferencias entre los derivados del tumor TGF-β y DNMTs que está relacionada con la metilación en cáncer; 2) DNMTs pueden estar estrechamente asociados con la progresión del cáncer de próstata y los resultados después de la prostatectomía radical. A nuestro entender, este tema aún no se ha reportado.
El objetivo de nuestro estudio fue varias veces. En primer lugar, tratamos de investigar los cambios correspondientes en DNMT y TβRs expresión y activación de ERK después de tratar las células de CaP con diferentes grados de capacidad invasiva y células epiteliales de próstata benignos con TGF-β. A continuación, se examinó el efecto de un anticuerpo TGF-β de neutralización en la expresión de DNMTs y el crecimiento del tumor in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto. Por último, se determinó si la activación de DNMTs se asoció con recurrencia bioquímica después de la prostatectomía radical.
Materiales y Métodos
(Una explicación detallada se presenta en el Método S1): perfil
Líneas Celulares
La línea de células de CaP células de ratón TRAMP-C2 se obtuvo del Dr. N. Greenberg [12]. La línea benigna de próstata humana del epitelio celular, RWPE-1, fue adquirido de la colección americana de cultivos tipo (ATCC). células de HPB-1 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Simon Hayward. Cuatro variantes de la PAC humano líneas de células PC-3 (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M y PC-3M-LN4) con diferentes grados de capacidad invasiva fueron amablemente proporcionados por el Dr. Fidler y el Dr. Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. La razón por la que elegimos PC-3 variantes se debía a que estas variantes se originan de la misma línea celular, pero varían en sus capacidades agresivas. Los resultados de la regulación de señalización eran más comparable en contraste con el uso de los diferentes tipos de líneas de células de CaP. Para algunos experimentos, las células se vuelven insensibles a TGF-β (como control negativo) mediante la introducción de un TβRIIDN como se describe anteriormente [21], [22]. En algunos experimentos, las células fueron tratadas con o sin TGF-β1 o MEK U0126 inhibidor (Promega). Por último, algunos experimentos implicaban el uso de anti-TGF-β (1, -2, -3) neutralizar MAB (clon 1D11; un regalo de Genzyme Corporation) como se describe anteriormente [23], [24]. (Método S1).
TGF-β1 ELISA
RWPE-1, todas las variantes PC3 HPB-1 y y el correspondiente TβRIIDN infectados líneas celulares se cultivaron en los medios de comunicación fresco libre de suero durante 24 horas . TGF-β1 ELISA se llevó a cabo usando el kit humano TGF-β1 de Inmunoensayo (I + amp; D Systems). (Método S1): perfil
[
3H] timidina Ensayo de incorporación
Todas las células se hicieron crecer en cultivo durante 48 horas. Las células fueron expuestas a un medio que contiene [
3H] -timidina (0,5 Ci /ml; Amersham Biosciences) durante 5 horas adicionales. La incorporación de timidina se expresó como la fracción de recuentos encuentra en las células de los controles no tratados (Método S1).
análisis de transferencia de Western
Se realizaron análisis de transferencia de Western para comparar TβRs, DNMTs y expresión ERK después de diferentes tratamientos en el tiempo (Método S1).
PCR metilación específica (MSP) y secuenciación
MSP para el estado de metilación de TβRs se realizó de acuerdo con nuestro informe anterior [4]. Se identificaron los sitios metilados en las posiciones de citosina con /sin tratamiento de 5-Aza o TGF-β. Se realizaron
inmunofluorescencia y Co-tinción
Los estudios de inmunofluorescencia en todos los derivados de la línea celular PC-3 como se describe anteriormente [22], [25]. Para co-localización de DNMTs y ERK fosforilada (p-ERK), las células se analizaron mediante el uso de núcleo (DAPI) -DNMTs (TR) -p-ERK (FITC) de triple tinción (Método S1).
Quantitative RT-PCR
células epiteliales humanas de la próstata benigna RWPE-1 y BPH-1, y CaP PC-3 seriales) se cultivaron en medio fresco durante 24 horas, a continuación, se expusieron durante 24 horas a ya sea: 1) recombinante externa TGF-β1 (10 ng /ml), 2) anti-TGF-β neutralizar Ab monoclonal (1D11; 5 g /ml), o 3) MEK U0126 inhibidor (5 M). El ARN total se extrajo usando un kit RNeasy (Qiagen). Los cebadores para la humana para DNMTs [26] y TβRs [4] se enumeran en el Método S1.
invasión de la célula de ensayo
ensayo de invasión celular (ensayo de invasión Matrigel) se hizo en un 24 pocillos Transwell cámara (8 micras de tamaño de poro; CytoSelect; Cell Biolabs). Las células se sembraron a una densidad de 0,5 × 10
6-1,0 × 10
6 /ml en medio libre de suero. TGF-β1 y /o Erk UO126 inhibidor, 5-Aza se añadieron directamente a la suspensión celular, y 24 h más tarde, se aspiró la suspensión y las células invadidas se contaron con un microscopio óptico a alta objetivo ampliación (× 100; Olympus) y medido en nm A560 en un lector de placas después del tratamiento con la solución de extracción.
los estudios en animales
el estudio se inició el uso de la vía subcutánea (sc) la inyección de células TRAMP-C2 con cáncer de próstata de ratón transfectadas con HSV1-tk-GFP-luciferasa (SFG-NTGL) vector de expresión del gen indicador [27], [28] en la región del flanco derecho /6 ratones C57BL 30 como se describe anteriormente [25]. Los animales fueron asignados aleatoriamente a uno de tres grupos después de las inyecciones intraperitoneales con el anticuerpo neutralizante anti-TGF-β 1D11 o control anticuerpo específico 13C4 como se describe antes [23], [24]. Todos los ratones fueron sacrificados después de 15 inyecciones de anticuerpos y el grupo 3 se sacrificaron en el mismo intervalo de tiempo. (Método S1). Este estudio recibió la aprobación de la junta de revisión institucional de la Universidad de Northwestern (Evanston, IL). Universidad de Northwestern ACUC número de protocolo 2007-0565 Aprobación. "(Carta S1).
Construcción de microarrays de tejidos (TMA) y el resultado clínico Assement
La información del caso clínico existente y se ladeó tejido establecida dentro de nuestro se utilizó la base de datos de próstata SPORE programa de la Universidad de Northwestern. Todos los sujetos inscritos escrito el consentimiento informado por Northwestern Memorial Hospital y el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Northwestern (El número IRB es 1480-002, Carta S2). Un total de 243 piezas de prostatectomía radical se disponía de información clínica asociada. Una serie de próstata TMA se construyeron con piezas de prostatectomía radical, incluidas en parafina fijadas con formalina como se describe anteriormente [4], (Método S1 y S2 Método).
La inmunohistoquímica
Todos los anticuerpos generados contra DNMTs, ERK fosforilada (p-ERK), ERK total de (t-ERK), fosforilados Smad2, TβRI y TβRII se probaron y optimizadas en las secciones de todo el tejido y las matrices de prueba como se describe anteriormente [4] [17], [29, ], [30], (Método S1 y S2 Método).
Análisis estadístico. Francia El SPSS 10.0.7 paquete de software (SPSS Inc) se utilizó para todos los análisis. curva de supervivencia de Kaplan-Meier se analizó mediante la prueba de log-rank usando el software GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software) (Método S1).
Resultados
1. DNMTs expresión se asocia con la regulación hacia abajo de TβRs y fenotipos de cáncer de próstata más invasivos
ensayo Se realizó un ELISA inicialmente para determinar si había diferencias en los niveles de expresión endógenos de TGF-β en diferentes líneas celulares de CaP en comparación con líneas de células benignas de la próstata. Se encontró que todas las líneas celulares PC-3 expresaron niveles significativamente más altos de TGF-β (× 2 a 6 veces) en comparación con la BPH-1 y RWPE-1 (p & lt; 0,05). Además, hemos encontrado que las células más invasivos (PC-3M y PC-3M-LN4) secretadas casi 2 veces más altos niveles iniciales de TGF-β1 en comparación con las líneas celulares menos invasivos (PC-3 y PC-3M-Pro4) ( Fig. 1A).
A. ensayo de ELISA que demuestra que las líneas de células PC-3 expresar significativamente (p & lt; 0,05) mayores (× 2-6 veces) niveles de TGF-β en comparación con líneas celulares de próstata benigna, HPB-1 y RWPE-1. Además, PC-3M y PC-3M-LN4, secretadas casi 2 veces más alto niveles de referencia de TGF-β1 en comparación con las células PC-3M-Pro4 PC-3 y, respectivamente, que son menos invasivos. B. Un ensayo de incorporación de timidina indica que el crecimiento de las células RWPE-1 y BPH-1 se inhibe significativamente por la exposición a TGF-β1. En comparación, el crecimiento de las células PC-3M-Pro4 PC-3 y es sólo ligeramente inhibido, y las células PC-3M-LN4 y PC-3M no muestran ninguna respuesta significativa a la exposición de TGF-β1. C. En todas las líneas celulares de cáncer (aquí mostramos PC-3 como un ejemplo), la inhibición de TGF-β mediante el TβRIIDN construcción de resultados en la expresión TβRII significativamente mayor naïve, y D. mayor secreción de TGF-β. Hallazgos similares se encuentran en los hallazgos en las líneas celulares más invasivos. En comparación, no hubo diferencia en la expresión de TβRII en la BPH-1 o RWPE-1 cuando se infectaron con TßRIIDN (Tabla S1).
Se confirmó que las diferentes líneas celulares de próstata se comportan de manera diferente en respuesta a la exposición de TGF-β1 exógeno. Por ejemplo, encontramos que las células RWPE-1 y BPH-1 eran más sensibles a TGF-β1 exógeno como su crecimiento se inhibió por 64,1% y 61,9%, respectivamente, después de 24 horas de tratamiento con TGF-β1. En comparación, las células PC-3M-Pro4 PC-3 y sólo se inhibieron por 13.7% y 12.3%, respectivamente. Por último, la tasa de crecimiento de PC-3M-LN4 y PC-3M no se vio afectada por la exposición de TGF-β1 (Fig. 1B). Curiosamente, en líneas de células de CaP, la inhibición de la señalización de TGF-β, utilizando el tipo dominante negativo II receptor TGF-β (TßRIIDN) construir, se asoció con la expresión TβRII endógena significativamente mayor (usando anticuerpos dirigidos contra el dominio intracelular, porque TβRIIDN incluye solamente dominio extracelular y dominios transmembrana, pero no intracelular) (Fig. 1C) y una mayor secreción de TGF-β (Fig. 1D). En comparación, no hubo diferencia en la expresión de TGF-β en la BPH-1 o RWPE-1 cuando se infectaron con la retroviral TβRIIDN construir (Tabla S1).
A diferencia de la expresión de TGF β, tanto TβRI y expresión TβRII se redujo significativamente en las líneas celulares más invasivos, PC-3M-LN04 y PC-3M, en comparación con las células PC-3M-Pro4 (Fig. 2A) PC-3 y. El bloqueo de la señalización con el vector TβRIIDN TGF-β provocó un aumento de aproximadamente dos y diez veces en la expresión de tanto TβRI y TβRII en todas las líneas celulares de CaP (Fig. 2B). En conjunto esto sugiere que el aumento de los niveles de referencia de TGF-β están asociados con la inhibición de la expresión TβRs. El bloqueo de la señalización de TGF-β intracelular resultó en la regulación de la secreción de TGF-β en las células cancerosas.
A. Western blot análisis demuestran que en contraste con la expresión de TGF-β, tanto TβRI y expresión TβRII (como se describe en la Figura 1B) se reduce significativamente en las líneas celulares más invasivos en comparación con líneas celulares menos invasivos. B. El bloqueo de la señalización con el TβRIIDN TGF-β provoca aumento significativo de los TβRIs de expresión en todas las líneas celulares. C. En contraste con la expresión de TβRs, la sobre expresión de DNMTs se asocia con las líneas celulares más invasivos en comparación con las líneas celulares menos invasivos. D. El bloqueo de la señalización con TβRIIDN TGF-β causó una disminución ≥3 veces en la expresión de DNMTs. El valor correspondiente (relación relativa de TβRs /GAPDH, o DNMTs /GAPDH) se muestra en los gráficos de la derecha. (Fig. 2A y 2B eran de la misma imagen de Western Blot, y la Fig. 2C y 2D eran de la otra imagen única mancha occidental).
Desde la metilación del promotor de TβRs se asocia con una disminución de la expresión [ ,,,0],4], se compararon los niveles de expresión de DNMTs en las diferentes líneas celulares de CaP. En general, las células PC-3M-LN4 y PC-3M más invasivos mostraron un aumento de expresión de DNMTs, en comparación con el menos invasivo PC-3 y PC-3M-Pro4 (Fig. 2C). El bloqueo de la señalización con el vector TβRIIDN TGF-β causó una disminución ≥3 veces en la expresión de DNMTs en todas las líneas celulares de CaP (Fig. 2D), y no hubo un aumento correspondiente en la expresión de tanto TβRI y TβRII (Fig. 2B). El valor correspondiente (relación relativa de TβRs /GAPDH, o DNMTs /GAPDH) se muestra en paneles de la derecha. Este hallazgo también fue apoyada por estudios de confirmación adicionales. análisis de inmunotransferencia demostró que después del tratamiento con 5-Aza-2 'desoxicitidina (5-Aza), la expresión de TβRI y TβRII en PC-3 aumentó drásticamente. En contraste, la expresión de ambos TβRI y TβRII disminuyó significativamente con el tratamiento de TGF-β y este cambio podría ser recuperado cuando se añade 5-Aza (Figura S1A). Del mismo modo, en tiempo real PCR confirmó que la expresión de ambos TβRI y TβRII se incrementó 2 a 2,5 pliegues después del tratamiento de 5-Aza en las células PC-3. El tratamiento con TGF-β suprime las expresiones de TβRI y TβRII 46% y 29% respectivamente (Figura S1B). También se identificó el estado de metilación de TβRI y TβRII promotores, utilizando el mismo enfoque de secuenciación MSP y metodologías [4]. Usando esta técnica, encontramos los mismos sitios metilados como nuestro estudio anterior [4] en el que la citosina posiciones -251, -231, -244, -348, -356 y -365 en el promotor de TβRI y +27, +32 y -140 para el promotor de TβRII se metilado (Figura S1C). las células PC-3 también tienen una porción de TβRI y TβRII promotores que son no metilado. Curiosamente, el tratamiento con TGF-β aumenta el estado de metilación, pero el tratamiento con 5-Aza convierte todos los sitios metilados a no metilado. El ensayo de incorporación de timidina se indica que la proliferación de las células PC-3 fueron sólo modestamente inhibido modestamente por exógenos TGF-β. En comparación, 5-Aza tratamiento resultó en una inhibición significativa de la proliferación celular, independientemente de si se añadió exógeno TGF-β en la cultura o no. No hubo diferencia significativa entre el tratamiento con tanto 5-Aza y TGF-β o con 5-Aza solo (P & gt; 0,05) (Figura S1D)
2.. DNMTs expresión es mediada a través de una vía de ERK fosforilada-dependiente
Nuestros estudios anteriores demuestran que ERK puede influir en la expresión DNMT en células benignas [14]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si el nivel de ERK activada (ERK fosforilada; p-ERK) está relacionado con el TGF-β-inducida por la expresión de DNMTs. Para probar esta hipótesis, se determinó en primer lugar el nivel de p-ERK en las células benignas de la próstata y la comparó con los niveles en diferentes líneas celulares de CaP. células de HPB-1 y RPWE-1 expresaron significativamente más altos niveles basales de p-ERK que las células PC-3 (Fig. 3A). Curiosamente, el curso temporal de la expresión de p-ERK después de la exposición a TGF-β fue diferente entre las líneas de células benignas y malignas. Específicamente, hubo una correlación positiva dependiente del tiempo entre el tratamiento con TGF-β1 y la expresión de p-ERK en todas las líneas celulares PC-3. De hecho, este rápido aumento de la expresión de p-ERK (4 veces) comenzó dentro de los 5 minutos después del tratamiento de TGF-β1. Los niveles de p-ERK continuaron aumentando durante todos los puntos de tiempo subsiguiente hasta 30 minutos después de la adición de TGF-β1. En contraste, la expresión de p-ERK se inhibió rápidamente (& lt; 5 minutos) después de la adición de TGF-β1 a los medios de las células benignas, de una manera que era independiente de la expresión total de proteína ERK (Fig 3A.). Los estudios de inmunofluorescencia se utilizaron posteriormente para ayudar a determinar si p-ERK y DNMTs se co-localizan en las mismas regiones celulares. Con este fin, los análisis microscópicos confocal de formaldehído fijo inmunotiñeron células PC-3, en la ausencia o presencia de TGF-β1, demostraron co-loczalization entre las señales de p-ERK y DNMTs. Sólo las células con inmunofluorescencia p-ERK exhibieron expresión DNMT. En contraste, cuando se prestaron insensible células PC-3 a TGF-β1 por transfección con el TβRIIDN, los niveles de ambos DNMTs p-ERK y se redujeron drásticamente, determinada por tinción immunofluorsence (Fig. 3B). Para cuantificar mejor esta relación entre el TGF-β1, p-ERK y DNMTs, A continuación utiliza PCR en tiempo real. Estos resultados demostraron que la exposición a TGF-β1 durante 24 horas aumentó significativamente la expresión de los tres DNMTs (~16.7% -14%) en todas las células PC-3 líneas estudiadas. El tratamiento con un anticuerpo específico para el TGF-β1 (1D11; 5 mg /ml) o el inhibidor de ERK específica, UO126, condujo al importante baja regulación de la expresión de ARNm DNMTs (~33.9% -52,3%, -57,6% y ~41.5% respectivamente, Fig. 3C). Estos resultados sugieren que el TGF-β mediada por la expresión de DNMTs se asocia con un aumento de p-ERK en las células cancerosas. Específicamente, derivado tumor TGF-β parece ser responsable de esta activación de ERK, como bloqueo del original TGF-β secretada dio lugar a un gran cambio en la expresión de DNMTs (Fig. 3C). Estos resultados también sugieren que el derivado tumor TGF-β activación de ERK mediada por al menos uno de los principales mediadores de TGF-β indujo la expresión de DNMTs que conducen a TβRs baja regulación de la metilación del promotor en CaP [4], [14]. Después del tratamiento con TGF-β, hubo un aumento significativo en la capacidad invasiva de las células de CaP. La invasión de las células de CaP fue inhibida por cualquiera de inhibidor de TGF-β 1D11, o p-ERK inhibidor U0126 o DNMT inhibor 5-Aza. La inhibición de la invasión por el U0126 no pudo ser revertido por el tratamiento de TGF-β1. Es importante destacar que, DNMTs inhibidor de la 5-Aza se inhibió drásticamente la invasión de células de CaP, incluso más que el bloqueo de TGF-β o p-ERK (Fig. 3D). Esta observación sugiere que el p-ERK fue factor de aguas abajo de TGF-β, y de forma sinérgica media TGF-β DNMTs que está estrechamente asociada con la capacidad invasiva de las células límite regulado.
A. Las células benignas BPH-1 y RPWE-1 expresan significativamente más altos niveles iniciales de p-ERK que las células PC-3. Existe una correlación positiva dependiente del tiempo entre el tratamiento con TGF-β1 y la expresión de p-ERK en las células PC-3. Los niveles de p-ERK siguen aumentando durante todos los puntos de tiempo subsiguiente hasta 30 minutos después de la adición de TGF-β1. En contraste, la expresión de p-ERK es rápidamente (& lt; 5 minutos) inhibió después de la exposición de TGF-β1 en las células benignas en una forma que es independiente de la expresión total de proteínas ERK. B. La inmunofluorescencia revela que sólo las células PC3 (esto es, por ejemplo) que expresan p-ERK expresión exhibición DNMT. Por el contrario, cuando las células PC-3 se representan insensible a TGF-ß1 por TβRIIDN, los niveles de p-ERK y DNMT se reducen significativamente (aumento: 10 × 20). C. Se realizó PCR en tiempo real para cuantificar mejor la relación entre TGF-β1, p-ERK y DNMTs. La exposición a TGF-β1 aumentó significativamente la expresión de los tres DNMTs en células PC-3. El tratamiento con 1D11, o un inhibidor de MEK, UO126 se asocia con la baja regulación de toda expresión de ARNm DNMT. D. (Aquí se mostró más agresivo PC-3M como una muestra). Hubo un aumento significativo en la motilidad celular a través de una membrana de policarbonato con recubrimiento de Matrigel en el marco del tratamiento de TGF-β1 (10 ng /ml). La invasión de todas las células de CaP puede ser inhibida por el bloqueo de la señal de TGF-β por 1D11 o el uso de un inhibidor de UO126 p-ERK, o DNMT inhibidor de la 5-Aza separado. La inhibición de la invasión por UO126 no puede ser revertida por el tratamiento de TGF-β. Alta panel de la derecha: los números correspondientes de las células invasoras. panel de la derecha inferior: valores de absorbancia. Este resultado indica p-ERK mediada DNMT TGF-β inducida potencia la capacidad invasiva de las líneas celulares de cáncer de próstata. (Ampliación, 10 × 10).
3. En la validación in vivo de los efectos de TGF-β en la activación de ERK, la expresión DNMT, y el crecimiento del cáncer de próstata
Para validar si el TGF-β es responsable de la activación de ERK y la sobre regulación de DNMTs que puede estar implicado en la progresión tumoral in vivo, hemos llevado a cabo experimentos usando un modelo de CaP xenoinjerto de ratón que implicó la inyección de células tumorales (células TRAMP-C2 CaP transfectadas de forma estable con un HSV1-tk-GFP-luciferasa reportero, 5 × 10
6 /cada ratón). El crecimiento tumoral se siguió utilizando imágenes de luciferasa. Se utilizaron tres grupos de ratones para entender mejor los efectos del TGF-β en la activación de ERK y la expresión DNMT: Grupo 1: ratones (n = 10) recibió inyecciones regulares de anticuerpo TGF-β neutralizar, 1D11. Grupo 2: ratones (n = 10) recibieron el anticuerpo de control de isotipo, 13C4, en los mismos intervalos regulares como Grupo 1. Grupo 3: no recibió ningún tratamiento después de la inyección de xenoinjerto como control. Se encontró que el crecimiento del tumor se inhibió de manera significativa con el anticuerpo anti-TGF-β 1D11, el tratamiento (Grupo 1) en comparación con los otros dos grupos (4A. Fig, 4B). De hecho, al final del período de tratamiento de 45 días, uno de los diez ratones (10%) en este grupo estaba libre de tumor. En los 9 ratones restantes, el peso medio de los tumores y el volumen fue de 5,3 g y 6,85 cm
3, respectivamente. En comparación, los tumores se encontraron en todos los ratones en los Grupos 2 y 3. El peso medio y el volumen de los tumores en los 10 animales tratados con el anticuerpo de control (Grupo 2) o ningún tratamiento (Grupo 3) era significativamente mayor (Fig. 4C) . No hubo metástasis en todos los grupos según la evaluación de imágenes de bioluminiscencia. Análisis inmunohistoquímico de los tumores primarios revelaron que la expresión de p-ERK y DNMTs en los animales del Grupo 1 fueron significativamente más bajos que los de los otros dos grupos (Fig. 4D).
A. sistema 100 de formación de imágenes IVIS se utiliza para controlar el crecimiento del tumor en tiempo real. Hemos encontrado que el crecimiento tumoral se inhibe drásticamente con el tratamiento de 1D11 en comparación con el grupo (tratamiento 13C4) 2 y 3 (control sin tratamiento). tratamiento B. 1D11 inhibe el crecimiento del tumor de una manera dependiente del tiempo. C, Al final del período de tratamiento de 45 días, los ratones se sacrificaron y se aislaron los tumores. El peso medio de los tumores y el volumen fue de 5,3 g y 6,85 cm
3, respectivamente, en el grupo de tratamiento 1D11. En comparación, el promedio de peso y el volumen de los tumores en los 10 animales tratados con el control 13C4 fue significativamente mayor en 15,8 g y 12,85 cm
3, respectivamente. Los valores correspondientes en los ratones que recibieron ningún tratamiento fueron 31,4 gy 23,39 cm
3, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,01 entre los tres grupos). D. análisis inmunohistoquímico de los tumores primarios reveló que la expresión de p-ERK, DNMTs en animales con tratamiento 1D11 es significativamente menor que los de los otros dos grupos.
4. DNMTs se correlaciona con características clínicas
Para evaluar la asociación entre el TGF-β y la inducción de DNMTs en muestras de CaP, se compararon los niveles de expresión de TGF-β1, ERK, p-ERK, TβRI, TβRII, p- Smad2 y DNMTs en muestras de microarrays de tejidos archivadas obtenidos en el momento de la prostatectomía radical y ellos correlacionados con características clínicas y patológicas correspondientes de los pacientes (Tabla S2 Cada marcador se le asigna un valor de 0 (. & lt; 20% inmunotinción de células), 1 ( 20-49% inmunotinción de células), 2 (50 a 74% inmunotinción de células) y 3 (la inmunotinción de células 75 a 100%) en función del porcentaje de células de cáncer que muestra la inmunotinción positiva. la tinción control positivo y negativo se mostraron en la "figura S2 ". se encontró que un alto nivel de expresión de TGF-β1, p-ERK y DNMTs junto con un bajo nivel de expresión de TβRI, TβRII, y p-Smad2 se asocia con características patológicas adversas, tales como un grado más alto de Gleason ( la Fig. 5A, Fig. 5B, el cuadro S3). Estos resultados se corresponden con nuestro hallazgo de PC-3M-LN4 y las células PC-3M que DNMTs inducidos TGF-beta se asocian con fenotipos clínicamente más agresivos.
. El análisis inmunohistoquímico de secciones de TMA de serie de un paciente con puntuación de 8 de Gleason, revelado más alta expresión de TGF-β, p-ERK, DNMTs, pero menor expresión de TβRI y TβRII y p-Smad2 en comparación con las secciones de serie tomadas de un paciente con un grado más bajo de Gleason de 6. Estos resultados son representativos del patrón de tinción predominante visto en todas las muestras de pacientes /matrices tisulares (magnificación: 10 × 20). La frecuencia correspondiente (o porcentaje) de la tinción y la intensidad de la tinción se puede conocer en BB Los altos niveles de TGF-β1 expresión (Puntuación = 3) se identificaron en 42,3%, 8,9% y 7,0%, la expresión de p-ERK en 36,4%, 6,7% y 13,5%, la expresión DNMT1 en 27,9%, 1,8% y 1,3%, la expresión DNMT3A en 40,6%, 11,9% y 6,7%, y la expresión DNMT3B en 58,7%, 18,3% y 22,8% de alto (≥8), intermedio