Extracto
Factor de crecimiento transformante-beta1 ( TGF-β1) es una citoquina multifuncional que participa en varios procesos fisiopatológicos, incluyendo la progresión del cáncer y trastornos fibróticos. Aquí, se muestra que el tratamiento con TGF-β1 (5 ng /ml) regulación a la baja inducida de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), lo que lleva a la reducción de la síntesis de la prostaglandina E2 (PGE2), en las células A549 de cáncer de pulmón humano. El tratamiento de células con inhibidores específicos de COX-2 o el receptor de PGE2 resultó en la inhibición del crecimiento, lo que indica que la vía de la COX-2 /PGE2 contribuye a la proliferación de una manera autocrina. tratamiento TGF-β1 induce la inhibición del crecimiento, que fue atenuada por exógena PGE2. TGF-β1 es también un potente inductor de la transición epitelio mesénquima (EMT), un cambio fenotipo en el que las células epiteliales se diferencian en células fibroblastoides. La suplementación con PGE2 o PGE2 receptor EP4 agonista PGE1-alcohol, en comparación con EP1 /3 sulprostona agonista, inhibe la expresión inducida por el TGF-β1 de la fibronectina y el colágeno I (componentes de la matriz extracelular). Exógenos PGE2 o agonistas de los receptores de PGE2 también suprimen la remodelación de la actina inducida por el TGF-β1. Estos resultados sugieren que la PGE2 tiene un efecto anti-fibrótico. Se concluye que la regulación a la baja inducida por TGF-β1 de la señalización de la COX-2 /PGE2 está involucrado en la facilitación de la respuesta fibrótica EMT en las células A549
Visto:. Takai E, M Tsukimoto, Kojima S (2013) TGF-β1 regula a la baja la expresión de COX-2 que causa pérdida de producción de PGE2 en células de cáncer de pulmón humano A549, que está implicado en la respuesta fibrótica a TGF-β1. PLoS ONE 8 (10): e76346. doi: 10.1371 /journal.pone.0076346
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: 23 de mayo de 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 2 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Takai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Factor de crecimiento transformante-beta1 (TGF-β1) se descubrió originalmente como una proteína secretada que induce la transformación y el crecimiento de fibroblastos normales [1], y está ahora bien establecida para estar implicado en diversos trastornos fibróticos, como la fibrosis pulmonar y hepática [2-4]. De hecho, el TGF-β1 es una citoquina multifuncional que regula diversos procesos fisiológicos, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, y la tumorigénesis. Es secretada en microambientes tumorales de muchas células cancerosas y actúa como un promotor de tumores mediante la inducción de la angiogénesis, inmune de escape y la metástasis [5-7]. la fibrosis pulmonar, como la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), es bien conocido por estar asociado con un mayor riesgo de cáncer de pulmón. Por otra parte, también se ha propuesto que la fibrosis en tumor de pulmón es un fenómeno secundario en lugar de un precursor de cáncer, y se demostró que el grado de fibrosis se correlaciona con la progresión del cáncer y el pronóstico [8,9]. Sin embargo, los mecanismos de desarrollo de la fibrosis en tumor de pulmón no se conocen bien.
En las células epiteliales, el TGF-β1 induce un cambio fenotipo llamado transición epitelio mesénquima (EMT), que es el proceso por el que las células epiteliales se diferencian en células mesenquimales similares a fibroblastos. EMT es un proceso fisiológico normal esencial para la embriogénesis adecuada y la morfogénesis de tejidos. Por otro lado, EMT también está implicado en la progresión de la reparación y el cáncer de heridas en tejidos adultos [10,11]. Aunque se ha sugerido una contribución de las células similares a fibroblastos derivados de la EMT a la fibrosis [12,13], los mecanismos de señalización que subyacen a los eventos biológicos inducidos por TGF-β1 en las células cancerosas no se comprenden totalmente.
La ciclooxigenasa (COX ) es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de prostanoides. Mientras que la COX-1 se expresa constitutivamente, la COX-2 es inducible, y es bien conocida por estar involucrados en la inflamación. La expresión de COX-2 es elevada en muchos tejidos tumorales, incluyendo cáncer de pulmón [14,15]. La prostaglandina E2 (PGE2), que es la prostaglandina predominante, ejerce sus efectos biológicos a través de receptores acoplados a proteína G (es decir, EP1-EP4) [16]. Se ha informado de que PGE2 está implicado en el crecimiento del tumor, la inmunosupresión, o la angiogénesis [17 a 20]. También se ha informado de que la COX-2 se sobreexpresa en muchos cánceres de pulmón, y PGE2 está implicado en la proliferación, la resistencia a la apoptosis y la inducción de células T reguladoras [21-24]. En el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), la sobreexpresión o activación de la mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) conduce a la proliferación aberrante o la migración. Por lo tanto, EGFR se establece como un marcador molecular de NSCLC, y es ampliamente utilizado para la predicción de pronóstico o para la elección de tratamiento. COX-2, así como EGFR, es un posible marcador molecular de NSCLC [14].
Hemos informado recientemente que el tratamiento de células A549 NSCLC humanas con TGF-β1 induce la EMT que conduce a la mejora de la migración celular [ ,,,0],25]. En el presente estudio, para revelar el mecanismo de la progresión del cáncer de pulmón inducida por TGF-β1, se investigó el efecto de TGF-β1 sobre la expresión de COX-2 en células A549. Anteriormente, se ha informado de que el TGF-β1 induce COX-2 expresión durante EMT en células epiteliales mamarias [26]. Contrariamente al caso en células epiteliales mamarias, encontramos por primera vez que el TGF-β1 regula a la baja de la COX-2 en células A549 NSCLC humanos. Mostramos aquí que este efecto está relacionado con la inhibición del crecimiento y la facilitación de la respuesta fibrótica EMT, lo que sugiere que la señalización de la COX-2 /PGE2 es importante para el control de procesos celulares en células A549.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
DMEM, TGF-β1 recombinante humana, SB431542, cicloheximida y acetato de metilo se adquirieron de Wako Pure Chemical (Osaka, Japón). FBS se adquirió de BioWest (Nuaillé, Francia). AH6809, L798106, L161982, sulprostona, butaprost y PGE1-alcohol se adquirieron de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE.UU.). La prostaglandina E2, actinomicina D y el anticuerpo anti-N-cadherina se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). inhibidor específico de Smad3 (SIS3) y NS-398 se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). Rodamina faloidina fue adquirido de citoesqueleto, Inc. (Denver, CO, EE.UU.). anticuerpo policlonal de conejo anti-COX-2 se adquirió de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE.UU.). policlonal de conejo anti-alta movilidad de grupo 1 (HMGB1) de anticuerpos fue adquirido de Abcam (Cambridge, UK). policlonal de conejo anti-COX-1 y anticuerpo monoclonal de ratón anti-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU.). De ratón anti-E-cadherina monoclonal (clon 36B5) se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE.UU.). De ratón anti-fibronectina monoclonal fue adquirido de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
Cultivo de células
células de adenocarcinoma humano A549 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C.
Immunoblotting
Las células se lisaron en PBS que contenía 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1% Triton X100, EDTA 5 mM, pirofosfato de 30 mM de sodio, fluoruro de sodio 50 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, 1,04 mM 4- fluoruro de bencenosulfonilo (2-aminoetil), 0,8 M de aprotinina, leupeptina 21 mM, 36 mM, bestatina 15 micras de pepstatina A y 14 mu M e-64, a 4 ° C durante 30 min. Los lisados se centrifugaron a 10.000 x g durante 15 min. Después de la eliminación de los desechos celulares, se determinó el contenido de proteína en cada muestra usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Cantidades iguales de lisado de proteínas se disolvieron en 2 x tampón de muestra (50% de glicerina, 2% SDS, Tris 125 mM, DTT 10 mM) y se hirvieron durante 10 min. Las alícuotas de las muestras que contienen 6 g de proteína se analizaron por medio de 7,5 a 15% SDS-PAGE y las bandas se transfirieron a una membrana de PVDF. Las transferencias se bloquearon durante la noche en TBST con 1% de BSA, 5% de leche desnatada a 4 ° C, después se incubaron con el conejo de la COX-2 de anticuerpos (1: 1000), conejo COX-1 de anticuerpos (1: 1000), el anticuerpo HMGB1 conejo ( 1: 1000), anticuerpo de ratón actina (1: 1000), anticuerpo de ratón E-cadherina (1: 1000), anticuerpo de ratón N-cadherina (1: 1000) o el anticuerpo de fibronectina de ratón (1: 1000) durante la noche a 4 ° C. Después de haber sido lavados con TBST, las transferencias se incubaron con anticuerpo de cabra IgG anti-conejo conjugado con HRP (Cell Signaling Technology, Inc.) o de cabra anti-IgG de ratón de anticuerpo-HRP (Santa Cruz Biotechnology) durante 90 min a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron de nuevo con TBST, y las proteínas específicas se visualizaron utilizando ECL Western Blot reactivos de detección (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las intensidades de las bandas se cuantificaron por análisis densitométrico utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health).
PGE2 EIA
producción de PGE2 de las células se determinó con un inmunoensayo enzimático (EIA) kit (Cayman Chemical) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, PGE2-acetilcolinesterasa conjugado, se añadieron anticuerpo monoclonal de ratón anti-PGE2, y, o bien estándar o de la muestra a cada pocillo de una placa de EIA recubiertas con anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón. Después de la incubación durante 18 horas a 4 ° C, la placa se lavó cinco veces para eliminar todos los reactivos no unidos. A continuación se añadió el reactivo de Ellman a cada pocillo, y la placa revelada se leyó a 405 nm con un contador ARVO SX WALLAC etiqueta múltiple (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, EE.UU.).
Real-time RT-PCR
ARN total fue aislado de las células A549 utilizando un kit de RNA Pure Fast (Takara Bio). La primera línea de cDNA fue sintetizado a partir de ARN total con PrimeScript la transcriptasa reversa (Takara Bio). El cDNA se utilizó como plantilla para el análisis PCR en tiempo real: Se llevaron a cabo reacciones en un Mx3000P Stratagene
® sistema QPCR (Agilent Technologies, La Jolla, CA, EE.UU.). Las secuencias de cebadores específicos para COX-2 humana fueron 5'-GAGAAAACTGCTCAACACCGGA-3 '(sentido) y 5'-CACAACGTTCCAAAATCCCTTG-3' (antisentido), los de COL1A1 humano fueron 5'-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3 '(sentido) y 5 '- AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3' (antisentido). Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mRNA se determinó como un control positivo. Cada muestra se ensayó en una mezcla de reacción de amplificación que contiene 20 l de ADNc, cebadores (5 mM cada uno de los cebadores sentido y antisentido) y 2x KAPA SYBR
® RÁPIDO qPCR Master Mix (Applied KAPA, Woburn, MA, EE.UU.). El programa de amplificación incluía 40 ciclos de 95 ° C durante 3 segundos y 60 ° C durante 30 segundos. productos fluorescentes se detectaron en el último paso de cada ciclo. Los valores obtenidos estaban dentro del rango lineal de la curva estándar y se normalizaron a la expresión GAPDH ARNm.
análisis del ciclo celular
El ciclo celular se analizó mediante tinción con yoduro de propidio (PI). las células A549 se trataron con tripsina y se fijaron con etanol al 70% durante 60 min en hielo. El ARN se elimina por tratamiento con RNasa A (0,34 mg /ml), a continuación, las células se incubaron con 50 mg /ml de PI para 30 min en hielo. Se analizaron las células teñidas utilizando un FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), y se evaluaron diez mil células. El perfil de ADN indica la abundancia relativa de la población de células en G0 /G1, S y G2 /M fases. Los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular se determinaron mediante análisis estadístico utilizando el software Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).
Ensayo de proliferación
Ensayos de proliferación celular eran llevó a cabo utilizando la bromodesoxiuridina (BrdU) (colorimétrico) la proliferación celular ELISA (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células A549 se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con vehículo o de los reactivos en un volumen final de 100 l /pocillo. Posteriormente, se añadieron 10 l de solución de BrdU-etiquetado a cada pocillo, y la incubación se continuó durante 2 h. Después de la eliminación de la solución de BrdU-etiquetado, se secaron las células y se incubaron con solución FixDenat del kit durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la desnaturalización del ADN, las muestras se incubaron con anticuerpo anti-BrdU conjugado con peroxidasa durante 90 min. Los anticuerpos no unidos se lavaron y se añadieron 100 l de sustrato de luminiscencia. La luminiscencia se cuantificó usando un contador Multilabel ARVO SX WALLAC.
La proliferación celular también se analizó contando las células. Las células A549 se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con TGF-β1 y PGE2. Después de la incubación, las células se trataron con tripsina y se contaron usando un
TM contador de células automatizado TC10 (Bio-Rad Laboratories).
imágenes de fluorescencia
En la F-actina tinción, las células fueron fijadas con 4 % de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 durante 5 min en hielo. Las células fijadas fueron incubadas con 100 nM faloidina rodamina durante 30 min a temperatura ambiente. Contratinción con Hoechst 33258 se utilizó (10 mg /ml) para verificar la ubicación y la integridad de los núcleos. Se analizaron las células teñidas con un microscopio de barrido láser confocal (TCS SP2; Leica, Mannheim, Alemania) equipado con un HCX PLApo lente objetivo 63 x 1,32 aceite de NA. Leica software confocal (TCS SP2, versión 2.6.1) se utilizó para la adquisición y procesamiento de imágenes.
La migración de células de ensayo
La migración celular se analizó mediante el uso de placas de 24 pocillos Transwell (diámetro 6,5 mm ; 8 micras membrana de tamaño de poro de policarbonato, Corning, Lowell, MA, EE.UU.). El compartimento superior se sembró con células A549 (2 x 10
4 células) en medio de cultivo basal. Después de 24 h, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene TGF-β1. La cámara superior contenía FBS al 5% en lugar de 10%. Después de la incubación durante otras 24 h, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron con 50 mg /ml de PI durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células no migradas en la superficie superior de la membrana se retiraron y las células que habían migrado a través de la membrana a la superficie inferior se contaron utilizando un microscopio de fluorescencia (BZ-9000; KEYENCE).
Estadísticas
Los resultados se expresan como media ± sE. La significación estadística de las diferencias entre el control y otros grupos se calculó usando la prueba de Dunnett o la prueba t no apareado con la versión 3.0 paquete estadístico Instat (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). El criterio de significación se fijó en P & lt; 0.05.
Resultados
TGF-β1 regula negativamente la expresión COX-2 y la producción de PGE2 en las células A549
En muchos tipos de cáncer, el TGF-β1 se secreta en el microambiente tumoral y actúa como un promotor de tumores. Para investigar la progresión de la inducida por el TGF-β1 de cáncer de pulmón humano, que estimularon las células A549 de cáncer de pulmón humanas con TGF-β1. COX-2 se sobreexpresa constitutivamente en las células A549 en condiciones estándar de cultivo celular. Sorprendentemente, se encontró que la expresión de la proteína COX-2 se redujo drásticamente mediante el tratamiento con 5 ng /ml de TGF-β1 (Figura 1A). La disminución de la proteína COX-2 a las 24 h después de la estimulación era TGF-β1 dependiente de la dosis (Figura 1B). Por otro lado, la expresión de COX-1 en células A549 era baja, y no se ha modificado por tratamiento TGF-β1 (Figura 1A, B). TGF-β1 activa de serina /treonina quinasa de receptores TGF-beta. Tras la unión del ligando, el receptor de tipo TGF-β I (TßRI) y tipo II receptor (TßRII) forman un heterocomplejo receptor tetramérica que conducen a la fosforilación de proteínas Smad, las principales moléculas efectoras aguas abajo para estos receptores, por las actividades de cinasa de la citoplasmática dominio de TßRI. El tratamiento con SB431542 inhibidor TßRI o Smad3 inhibidor SIS3 [27] bloquea la COX-2 regulación a la baja por el TGF-β1 (Figura 1C). Los resultados indican que la regulación por disminución inducida por el TGF-β1 de la COX-2 se asocia con la activación de los receptores de TGF-beta y la ruta de señalización Smad.
(A) Expresión de la proteína COX-2 se detectó mediante inmunotransferencia como se describe en Materiales y Métodos. El tratamiento con TGF-β1 (5 ng /ml) suprimió la expresión de COX-2 pero no COX-1 en las células A549. HMGB1 se midió como control de carga. (B) regulación a la baja dosis-dependiente de la COX-2 por TGF-β1. se detectó Veinticuatro horas después de la estimulación de TGF-β1 (1-10 ng /ml), la expresión de COX-2 y COX-1. (C) SB431542 (10 M) o SIS3 (30 M) bloquearon inducida por TGF-β1 COX-2 regulación a la baja. Las células se trataron previamente durante 60 minutos con el inhibidor, y después se incubaron con o sin TGF-β1 (5 ng /ml) durante 24 h. (D) TGF-β1 suprime la producción de COX-2 en células A549. Las células se trataron con TGF-β1 (1-10 ng /ml) o NS-398 (50 M) durante 24 h, a continuación, la concentración de PGE2 en el medio de cultivo se midió por EIA tal como se describe en Materiales y Métodos. Cada valor representa la media ± SE (n = 4). Las diferencias significativas entre los grupos indicados y grupo de control se indican con ** (P & lt; 0,01).
Las enzimas COX convierten el ácido araquidónico en prostaglandina H2, que se procesa adicionalmente en diversas prostaglandinas, incluyendo PGE2 , la prostaglandina predominante en el pulmón [28,29]. Para evaluar la producción de PGE2 en las células A549, que mide la concentración extracelular de PGE2 en medio de cultivo usando inmunoensayo enzimático. Como se muestra en la Figura 1D, la concentración extracelular de PGE2 se redujo mediante el tratamiento con TGF-β1 durante 24 h. Un inhibidor selectivo de la COX-2, NS-398, eliminó completamente PGE2 del medio de cultivo, lo que indica que la producción de PGE2 en células A549 depende principalmente de la función de la COX-2. Estos resultados muestran que la estimulación de TGF-β1 suprime fuertemente la expresión de COX-2 y los resultados en una reducción de la producción de PGE2 en células A549.
represión de COX-2 expresión de TGF-β1 está mediada por la represión transcripcional
a continuación se investigó el mecanismo de la inducida por TGF-β1 de la COX-2 regulación a la baja en las células A549. COX-2 expresión proteica podría verse afectada por la degradación de proteínas, alteración de la estabilidad del mRNA y la tasa de transcripción alterada. El uso de análisis en tiempo real de RT-PCR, se analizó la expresión de COX-2 mRNA en el tratamiento de TGF-β1 de 0,5 a 3 h. Como se muestra en la Figura 2A, la COX-2 mRNA se redujo rápidamente, alcanzando aproximadamente el 50% del control dentro de 30 min después de la estimulación. Este resultado indica que la disminución de la proteína COX-2 después de la estimulación de TGF-β1 es principalmente el resultado de una disminución de la COX-2 mRNA. Para examinar si el TGF-β1 afecta a la COX-2 mRNA estabilidad, las células fueron pretratadas con el inhibidor de la transcripción actinomicina D antes de TGF-β1 estimulación. Entonces, la COX-2 mRNA nivel fue examinado por tiempo real RT-PCR. Las células de control tratadas con actinomicina D solo mostraron una disminución significativa de COX-2 mRNA. El tratamiento con TGF-β1 no afectó COX-2 la estabilidad del ARNm, tal como la velocidad de degradación era idéntica a la observada en las células control (Figura 2B). Además, se analizó la COX-2 estabilidad de la proteína mediante el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (CHX). Las células se trataron con CHX o CHX más TGF-β1, y después de la COX-2 nivel de proteína se examinó por inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 2C, la proteína COX-2 se redujo en las células de control tratadas con CHX solo y TGF-β1 no afectó a la COX-2 estabilidad de la proteína. Estos resultados indican que el TGF-β1 no afecta a la COX-2 degradación de la proteína y la estabilidad de ARNm, sino que actúa en el nivel transcripcional
.
(A) disminución dependiente del tiempo de la COX-2 expresión de mRNA por tratamiento con TGF -β1 (5 ng /ml). COX-2 nivel de ARNm se midió por tiempo real de RT-PCR como se describe en Materiales y Métodos. (B) Las células fueron pretratadas con actinomicina D (5 mg /ml) durante 1 h y se incubaron con o sin TGF-β1 (5 ng /ml) durante los tiempos indicados. TGF-β1 no afectó a la disminución de la COX-2 mRNA por actinomicina D. COX-2 niveles de expresión se normalizaron los niveles de expresión de GAPDH y se expresaron como un porcentaje de la de las células no tratadas (control). Cada valor representa la media ± SE (n = 3). (C) Las células se incubaron con CHX (50 mg /ml) o CHX más TGF-β1 (5 ng /ml) durante los tiempos indicados y expresión de la proteína COX-2 se detectó por inmunotransferencia. TGF-β1 no afectó a la disminución de la proteína COX-2 por CHX. Las intensidades de las bandas se cuantificaron y los valores de la COX-2 /actina se expresaron como relación con los de control. Cada valor representa la media ± SE (n = 4).
regulación a la baja de la COX-2 está relacionada con la inhibición del crecimiento inducida por TGF-β1 de células A549
Para aclarar el significado de la inducida por TGF-β1 de la COX-2 regulación a la baja, el próximo investigó qué papeles de la COX-2 y PGE2 juegan en las funciones biológicas de las células A549. PGE2 activa los receptores de EP, que se clasifican en 4 subtipos; EP1 acoplado a proteína Gq, EP3 acoplado a proteína Gi, Gs EP2 acoplado a proteína y EP4. Estos receptores EP se han implicado en la proliferación de diversas células de cáncer [22,30-32]. También se sugirió que los receptores de PGE2 y EP están involucrados en la proliferación de células de NSCLC [33]. Se examinó la implicación de la COX-2 /PGE2 en el ciclo celular de las células A549. El tratamiento con inhibidor de la COX-2 NS-398 durante 3 días resultó en una disminución de la fase S y un aumento de G0 /G1 fase (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3B, EP1 /2 AH6809 antagonista, EP3 antagonista L798106 o antagonista de EP4 L161982 también disminuyó significativamente la proporción de células en fase S. Además, examinó la proliferación celular mediante ensayo BrdU; incorporación de BrdU indica la síntesis de ADN durante la proliferación celular. El tratamiento con estos antagonistas de EP suprimida incorporación de BrdU en las células A549 (Figura 3C). También se analizó la expresión de receptores EP en las células A549 mediante RT-PCR, y se confirmó la expresión de los 4 subtipos de receptores (datos no mostrados). Estos resultados indican que la producción constitutiva de PGE2, al menos en cierta medida, contribuye a la proliferación de células A549 a través de receptores EP en condiciones de cultivo estándar.
(A) las células A549 se incubaron con NS-398 (50 M) durante 3 días y el ciclo celular se analizó como se describe en Materiales y Métodos. El tratamiento con NS-398 disminuyó la proporción de células en fase S. Cada valor representa la media ± SE (n = 3). (B) Las células se trataron con AH6809 (30 mM), L798106 (30 M) o L161982 (30 M) durante 3 días, luego se analizó el ciclo celular y se calculó el porcentaje de la fase S. Cada valor representa la media ± SE (n = 5-7) (C) Tratamiento con AH6809 (30 mM), L798106 (30 M) o L161982 (30 M) durante 3 días proliferación de células A549 suprimidas. La proliferación celular se examinó por el ensayo de BrdU como se describe en Materiales y Métodos. los niveles de incorporación de BrdU se expresaron en relación a la de las células no tratadas (control). Cada valor representa la media ± SE (n = 6). Las diferencias significativas entre los grupos indicados y grupo de control se indican con * (P & lt; 0,05) y ** (P & lt; 0,01) guía empresas
regulación a la baja Por lo tanto, inducida por TGF-β1 de la COX-2. podría afectar a la proliferación de las células A549. La estimulación con TGF-β1 también disminuyó la fase S y el aumento de la fase G0 /G1 de las células A549 (Figura 4A). Esta detención del ciclo celular se observó a partir de 3 días después del tratamiento, cuando las células A549 pueden estar expresando menos COX-2. De hecho, la reducción inducida por el TGF-β1 de células en fase S tendía a ser abrogada por exógena PGE2 en una forma dependiente de la dosis (Figura 4B). Para investigar más el efecto de TGF-β1 en la proliferación de las células A549, se midió la proliferación celular por medio de ensayo de BrdU. Se confirmó que la incorporación de BrdU se redujo por la estimulación de TGF-β1 durante 3 días, y esta supresión inducida por TGF-β1 de incorporación de BrdU se atenuó en parte en la presencia de PGE2 (Figura 4C). También encontramos que el TGF-β1 no afectó al patrón de expresión de los subtipos de receptores EP en las células A549 (datos no mostrados). Estos resultados apoyan la idea de que la inducida por el TGF-β1 de la COX-2 regulación a la baja se asocia con la supresión de la proliferación de las células A549. De hecho, el número de células en las muestras tratadas con TGF-β1 durante 3 días se redujo, en comparación con el caso de las células no tratadas, y la adición de PGE2 aumenta el recuento de células de las células tratadas con TGF-β1 (Figura 4D). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la inhibición del crecimiento TGF-β1 inducida de las células A549 está mediada en parte por regulación a la baja de la COX-2. Desde la detención del crecimiento celular en la fase G0 /1 es esencial para la diferenciación celular, la inhibición del crecimiento TGF-β1 inducida de las células A549 podría estar asociado con EMT inducida por el TGF-β1 en las células A549.
células A549 (A) se trataron con TGF-β1 se analizó (5 ng /ml) durante los tiempos indicados y el ciclo celular. El tratamiento con TGF-β1 disminuyó la proporción de células en fase S. (B-D) Veinticuatro horas después de la incubación con o sin TGF-β1 (5 ng /ml), las células se suplementaron con PGE2 (10, 25 M) y se incubaron adicionalmente durante 2 días. La proliferación se examinó por análisis del ciclo celular (B), ensayo BrdU (C) y el recuento de células (D) como se describe en Materiales y Métodos. PGE2 abrogó la inhibición del crecimiento inducida por TGF-β1. Cada valor representa la media ± SE (n = 3-5). Las diferencias significativas entre los grupos indicados y grupo de control se indican con * (P & lt; 0,05) y ** (P & lt; 0,01) guía empresas
regulación a la baja de la COX-2 acelera fibrótico TGF-β1 inducida. respuesta EMT
TGF-β1 es bien conocido por ser un potente inductor de EMT, que es un cambio fenotipo que implica diferenciación de las células epiteliales en células fibroblastoide similares. En el proceso de la EMT, proteínas marcadoras epiteliales, tales como E-cadherina, son proteínas perdidas y mesenquimales, incluyendo N-cadherina y fibronectina, se upregulated. Se confirmó la disminución de la E-cadherina y aumento de la N-cadherina a las 48 h después de la estimulación del TGF-β1. Al mismo tiempo, la expresión de la fibronectina fue elevada (Figura 5A). Para investigar la implicación de la COX-2 regulación a la baja en estas respuestas EMT TGF-beta 1 inducida, las células se costimulated con TGF-β1 y PGE2. Como se muestra en la Figura 5B, PGE2 (25 M) no afectó a la pérdida de E-cadherina o la regulación positiva de N-cadherina inducida por el TGF-β1. Por otro lado, la regulación positiva inducida por el TGF-β1 de la fibronectina fue marcadamente inhibida por exógenos PGE2. PGE2 suprimió la expresión de fibronectina inducida por TGF-β1 en dosis tan bajas como 5-10 mM (Figura 5C). A continuación, también se examinó el efecto de los agonistas del receptor EP sobre la expresión de la fibronectina. El tratamiento con butaprost agonista del receptor EP2 o EP4 agonista del receptor de PGE1-OH inhibió el aumento de la fibronectina inducida por TGF-β1, mientras que EP1 /3 sulprostona agonista del receptor no tuvo ningún efecto (Figura 5D). Estos resultados sugieren que EP2 y EP4 receptores median el efecto supresor de PGE2 en la expresión de fibronectina inducida por TGF-β1.
células A549 (A) se trataron con TGF-β1 (5 ng /ml) durante los tiempos indicados y la expresión de e-cadherina, N-cadherina y fibronectina se detectó por inmunotransferencia. (B) Cuarenta y ocho horas después de la incubación con TGF-β1 (5 ng /ml) y PGE2 (25 M), la expresión de E-cadherina, se evaluó N-cadherina y fibronectina. (C) Se incubaron las células con TGF-β1 (5 ng /ml) y PGE2 (5-25 mM) durante 48 h y se examinó la expresión de fibronectina. PGE2 suprime la inducción de la fibronectina por el TGF-β1. (D) Las células se trataron con TGF-β1 (5 ng /ml) y el vehículo (acetato de metilo), sulprostona, butaprost o PGE1-OH (20 M) durante 48 h y la expresión de la fibronectina fue evaluada. El tratamiento con butaprost o PGE1-OH inhibió el aumento inducido por el TGF-β1 de expresión de fibronectina. HMGB1 se detectó como control de carga. Las intensidades de las bandas se cuantificaron por densitometría y se expresaron como relación con los de cada control.
La fibronectina es un componente de la ECM y la expresión de fibronectina alterada se asocia con trastornos fibróticos. Se investigó además si TGF-β1 induce la expresión de colágeno I, que es un componente principal ECM en los tejidos fibróticos [34-36]. El nivel de transcripción COL1A1 (que codifica el colágeno I) se elevó por la estimulación con TGF-β1 (5 ng /ml) de una manera (Figura 6A) dependiente del tiempo. Esta expresión inducida por TGF-β1 de COL1A1 fue atenuada por la suplementación con PGE2 exógena (Figura 6B). Así como PGE2, PGE1-OH reprimida fuertemente la inducción COL1A1 por TGF-β1, mientras que butaprost y sulprostona exhibió sólo modestos efectos supresores (Figura 6C). En conjunto, estos resultados demuestran que la regulación a la baja de la COX-2 y la producción de PGE2 por TGF-β1 está involucrado en la producción de componentes de ECM en las células A549.
Las células (A) se estimularon con TGF-β1 (5 ng /ml) durante los tiempos indicados; a continuación, el ARN total fue extraído y la expresión del gen COL1A1 fue examinado por tiempo real RT-PCR. (B) Veinticuatro horas después del tratamiento con TGF-β1 (5 ng /ml) y PGE2 (5-25 mM), se examinó la expresión del gen COL1A1. PGE2 abrogó la expresión del gen COL1A1 inducida por TGF-β1. (C) Las células se trataron con TGF-β1 (5 ng /ml) y el vehículo (acetato de metilo), sulprostona, butaprost o PGE1-OH (20 M) durante 24 h, y se midió el nivel de COL1A1 mRNA. PGE1-OH suprimió la inducción COL1A1 por el TGF-β1. genes COL1A1 niveles de expresión se normalizaron para la expresión de GAPDH y se muestran como un porcentaje de la de las células TGF-beta 1-tratada. Cada valor representa la media ± SE (n = 3). Las diferencias significativas entre los grupos indicados y grupo de control se indican con ** (P & lt; 0,01).
supresión inducida por TGF-β1 de la producción de PGE2 está implicada en la remodelación de la actina en las células A549
también se investigó la formación de fibras de estrés de actina, que ha sido considerado como una característica de las células fibroblastoides, así como una parte de EMT. Como se muestra en la Figura 7A, la polimerización de actina TGF-β1 (5 ng /ml) inducida notablemente, mientras que las fibras de estrés de actina apenas se detectó en las células de PGE2 tratados. El tratamiento con butaprost o la formación de fibras de estrés de actina inducida por TGF-β1 PGE1-OH también inhibió. Por otro lado, sulprostona suprime ligeramente la polimerización de actina por el TGF-β1. Dado que las fibras de estrés de actina están relacionados con la motilidad celular, que también examinó la migración celular mediante el ensayo Transwell. Como se muestra en la figura 7B, la estimulación con TGF-β1 aumentó la migración de células dentro de las 24 h, mientras que el número de células migradas se redujo en presencia de PGE2. Estos resultados sugieren que la supresión inducida por el TGF-β1 de la producción de PGE2 está relacionado con la formación de fibras de estrés de actina y la migración de las células A549.
células A549 (A) se incubaron con TGF-β1 (5 ng /ml) y se PGE2 (10 M), vehículo (acetato de metilo), sulprostona, butaprost o PGE1-OH (20 M) durante 12 h. Entonces F-actina se tiñó con faloidina rodamina (rojo) y se analizaron las células teñidas con un microscopio de escaneo láser confocal con un aumento de x63. la formación de fibras de estrés de actina inducida por TGF-β1 fue suprimida por la PGE2, butaprost o PGE1-OH. Para verificar la ubicación de los núcleos, las células se tiñeron con Hoechst33258 (azul). migración (B) de las células se examinó mediante ensayo Transwell como se describe en Materiales y Métodos. las células A549 se trataron con TGF-β1 (5 ng /ml) y PGE2 (10 M) durante 24 h;