Extracto
Las opciones de tratamiento para la próstata en estadio tardío y el cáncer de colon es limitado y hay una necesidad urgente de desarrollar nuevas terapias más eficaces y específicas, que comienza con la identificación y validación de nuevas dianas terapéuticas. Los estudios clínicos recientes han demostrado que los niveles de la matriz inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) son elevados en el plasma del paciente de cáncer y elevado TIMP-1 niveles están asociados con peores resultados clínicos. Sin embargo, se desconoce si TIMP-1 sirve meramente como un biomarcador de la progresión del cáncer o tiene un papel funcional en la promoción de la progresión del cáncer y puede servir como una diana terapéutica del cáncer, que es el objetivo principal de este estudio. Aquí, se muestra que el estroma de próstata humano y cáncer de colon expresan niveles más altos de TIMP-1 en comparación con sus homólogos normales y aumento de la expresión de TIMP-1 promueve
in vivo
crecimiento de ambos tipos de cáncer. Se demuestra por primera vez que el aumento de TIMP-1 estimula la expresión de la acumulación de cáncer asociado fibroblastos (CAF) dentro de los tejidos de la próstata y cáncer de colon y que TIMP-1 aumenta la proliferación y la migración de próstata CAF
in vitro y promueve
ERK1 /activación 2 quinasa en estas células CAF. Nuestros resultados establecen los nuevos efectos promovedoras del TIMP-1 en la progresión del cáncer y en la acumulación de CAF que a su vez proporciona un microambiente favorable-tumoral. En conjunto, estos resultados establecen el potencial de TIMP-1 como una nueva diana para la terapia del cáncer y el mecanismo subyacente a la actividad pro-tumor de TIMP-1
Visto:. Gong Y, Scott E, Lu R, Xu y, Oh WK, Yu Q (2013) TIMP-1 promueve la acumulación de fibroblastos asociados cáncer y la progresión del cáncer. PLoS ONE 8 (10): e77366. doi: 10.1371 /journal.pone.0077366
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Marzo, 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 15 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un ejército de Estados Unidos Investigación médica (Departamento de Defensa) la concesión, W81XWH-10-1-0321. Los donantes tienen ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el pronóstico para el cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (CRPC) sigue siendo pobre, con una supervivencia media de menos de 2 años. Las opciones de tratamiento para el cáncer de próstata en etapa tardía es limitado y hay una necesidad urgente de desarrollar más eficaces y con objetivos nuevas terapias [1-5]. Durante la progresión del cáncer, es esencial que las células cancerosas interactuar correctamente con éxito y modifican su microambiente huésped circundante. Las células cancerosas interactúan con su microambiente a través de los receptores de adhesión de la superficie celular y los receptores para la matriz extracelular (ECM) y modifican su entorno en gran medida a través de actividades de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs). MMP desempeñan un papel clave en la degradación de la MEC y la bioactividad de las MMP están regulados por los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP) [6]. Hay cuatro miembros de la familia TIMP, matriz inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1), -2, -3, y -4. TIMP puede inhibir la actividad de todas las MMP, pero con mayor o menor eficiencia para diferentes MMP. MMPs juegan un papel importante en la diseminación tumoral y la progresión y que están establecidos objetivos terapéuticos para una variedad de tipos de cáncer [6-8]. Estudios anteriores indicaron que TIMP incluyendo actividades contra el cáncer de visualización de TIMP-1 [9-13]; Sin embargo, estudios recientes han demostrado un efecto pro-tumoral paradójico de TIMP-1 [6,14-16]. TIMPs puede afectar a la progresión del cáncer de una manera MMP-dependiente y MMP-independiente, aunque el mecanismo subyacente de este último no se entiende bien [17,18].
Muchos inhibidores de MMP de amplio espectro (MMPIs) desarrollados por empresas farmacéuticas fueron probados en ensayos clínicos prospectivos y los resultados han sido uniformemente decepcionante. Sin comprender el mecanismo definitivo para dicho fallo ha sido establecida. Sin embargo, es probable el resultado de una falta de comprensión de las actividades biológicas y funciones de los diferentes MMP distintas, que ya han sido apreciados mejor para sus actividades antitumorales [6,19-22] pro- y /o. Estos resultados decepcionantes también hacen hincapié en la importancia de una mejor comprensión de la biología de los objetivos terapéuticos de cáncer antes de la realización de ensayos clínicos. Recientemente, varios estudios clínicos han demostrado que los niveles de TIMP-1 en pacientes con cáncer de tejidos de plasma y el cáncer son altamente elevada y los niveles elevados de TIMP-1 se asocian con peores resultados clínicos en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de próstata y de colon [23-34]. Sin embargo, no está claro si TIMP-1 sirve meramente como un biomarcador de la progresión o funciones para promover la progresión del cáncer, así cáncer; y por lo tanto podría servir como una diana terapéutica del cáncer importante. Esta cuestión se aborda en este estudio.
Aquí mostramos que estroma de próstata humano y cáncer de colon expresan niveles más altos de TIMP-1 en comparación con sus homólogos normales y que el aumento de expresión de TIMP-1 promueve
in vivo
crecimiento tanto de cáncer tipos. Además, se demuestra que TIMP-1 aumenta la proliferación y migración de próstata CAF
in vitro
mientras que desmontables de TIMP-1 inhibe la proliferación y migración de próstata CAF. Además, TIMP-1 promueve la activación de ERK1 /2 quinasa en estos CAF. También muestran que el aumento de expresión de TIMP-1 estimula la acumulación de cáncer asociado fibroblastos (CAF) dentro de los tejidos de cáncer de próstata /colon. En conjunto, nuestros resultados establecen los nuevos efectos PROMOTIVE de TIMP-1 en la progresión del cáncer y la acumulación de CAF, el potencial de TIMP-1 como un objetivo terapéutico del cáncer de novela, y el mecanismo que subyace a los efectos de TIMP-1.
Materiales y Métodos
Paciente muestras de cáncer, células y reactivos
muestras de próstata y cáncer de colon humano se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN) de la Universidad de Pennsylvania y la Universidad Estatal de Ohio. fibroblastos asociados con cáncer de próstata primario (PCAFs) se obtuvieron de la Asterand EE.UU. (Detroit) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. fibroblastos de próstata humano eran de la Sciencell (HAACP, Carlsbad) y se cultivaron en fibroblastos Medio (FM, Sciencell). PC3, PC3 /M, DU145, 22Rv1, LNCaP, VCAP, RWPE-1 y células WPE1-NB26-65 de próstata humano y HCT116 de cáncer y 29 HT-células de cáncer de colon humano eran del Instituto Nacional del Cáncer (Repositorio tumor DTP, DCTD) y ATCC (Manassas) y se mantuvieron siguiendo las recomendaciones de los proveedores. cáncer de próstata humano LAPC-4 células se obtuvieron del Depósito de patentes de la ATCC.
epítopo (Invitrogen) Anti-V5, -TIMP-1, alfa actina de músculo liso (R & amp; D Systems, Santa Cruz), -ERK1 /2, -phospho-ERK1 /2, -AKT, y -phospho-AKT (Santa Cruz, Señalización celular), y los anticuerpos CD63 (EMD Millipore), y la proliferación de células de reactivo WST-1 (Takara) se utilizaron en los experimentos. Purificada TIMP-1 humana se obtuvo de R & amp; D Systems.
de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), las construcciones de expresión, y el virus de transducción
De longitud completa de TIMP-1 ADNc se generaron por PCR y se clonaron junto con su v5 COOH-terminal etiquetas -epitope al vector de expresión retroviral pQCXIP (BD Biosciences) como se describe [35,36]. Todas las construcciones de expresión se verificaron mediante secuenciación de ADN. Los retrovirus se generaron utilizando estas construcciones de expresión y pVSVG en GP2-293 células siguiendo las instrucciones del fabricante (BD Biosciences).
células de cáncer de próstata Humanos (PC3, 22Rv1, y LAPC-4) células de cáncer de colon humano (HCT116 y HT-29) fueron transducidas con retrovirus que llevan los vectores de expresión retroviral vacía (como controles) y, o TIMP 1. Se seleccionaron las células infectadas por su resistencia a puromicina y se agruparon las poblaciones de las células de la próstata y cáncer de colon resistentes a los medicamentos con o sin expresión de exógena v5-epítopo etiquetados TIMP-1 se utilizaron en los experimentos. Anti-v5 mAb (Invitrogen) se utilizó para detectar la expresión exógena de TIMP-1 (TIMP-1V5).
Real-Time PCR cuantitativa (qPCR)
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Life Technologies, Carlsbad,) y se utiliza para sintetizar cDNA con platino de un solo paso kit qPCR Superíndice III ( Life Technologies). QPCR análisis de la expresión de ARNm de TIMP-1 humana se realizaron con ensayo de expresión génica TaqMan (Hs00171558_m1) en la máquina de PCR en tiempo real con TaqMan ViiA7 universal de 2 × Master Mix (Life Technologies). Los niveles de expresión de genes se normalizaron con el control de la actina endógena (sonda cebador limitado, Life Technologies).
Análisis ELISA
TIMP-1 en cáncer de próstata sobrenadantes de cultivo celular y sueros de los pacientes se midió por humanos TIMP-1 ELISA Duoset (R & amp; D Systems) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, para la medición de TIMP-1 en sobrenadantes de cultivo celular, 2 × 10
6 células fueron sembradas en placas de 60 mm. Después de todas las células han unido, se sustituyeron las células en medio completo fresco durante 24 horas. sobrenadantes de cultivo de células se recogieron después de centrifugación para eliminar los desechos celulares. Varios sobrenadantes de células se diluyeron en consecuencia para encajar en la gama de las curvas de calibración. Los sueros de paciente se diluyeron 400 pliegues antes del ensayo para encajar en el rango de la curva estándar.
análisis de transferencia Western y ERK y AKT fosforilación
Las proteínas celulares se extrajeron con tampón de muestra de 4 × SDS Laemmli sin el colorante. Las concentraciones de proteína de todas las muestras se determinaron utilizando Bio-Rad D
c ensayo de proteínas reactivos. Igual cantidad de proteínas se analizaron por transferencia de Western como se describe [37]. las células de cáncer de próstata y las células de la próstata CAF se cultivaron hasta sub-confluencia y cambiaron a un medio libre de suero (SFM) durante 48 y 24 horas, respectivamente. Purificada humana TIMP-1 (250 ng /ml, R & amp; D Systems) se aplicó a las células de cáncer de próstata privadas de suero y las células de la próstata CAF para 3 y 12 horas. Las células se lisaron entonces y cantidades iguales de proteínas extraídas se analizaron por transferencia de Western con anti-fosfo-ERK1 /2 o -phospho-AKT y anti-ERK1 /2 o anti-AKT para detectar cantidades fosforilados y totales de ERK1 /2 y proteínas Akt, respectivamente.
proliferación celular y la migración de ensayo
Ensayo de proliferación celular
se realizó mediante la siembra de los CAF de próstata y células de cáncer de próstata en 2 × 10
3 o 4 × 10
3 células /así como detallado en leyendas de las figuras en placas de 96 pocillos, por triplicado, en diferentes medios de cultivo como se detalla en leyendas de las figuras. Después de 24 horas, las células se cambiaron a medio fresco en ausencia o presencia de 250 ng /ml de TIMP-1 o los medios acondicionados. Estas células se alimentaron con medio fresco con o sin TIMP-1 o los medios condicionados todos los días. Los ensayos de proliferación celular se realizaron en un conjunto de las células cada día usando el reactivo de WST1 Premix (Takara) siguiendo las instrucciones del fabricante
.
ensayos de migración Transwell se realizaron como se describe [37]. En pocas palabras, 0,5 × 10
6 o 1 × 10
6 células /ml CAF próstata en los medios FBS DMEM /F12 2% se colocaron en las cámaras superiores del insertos Transwell (Costar) por triplicado. se añadió 2% de medio FBS-DMEM /F12 en presencia de 250 ng /ml de TIMP-1 o el medio acondicionado en las cámaras de fondo de cada pocillo. Después de la incubación a 37 grados durante 30 horas, los CAF que migraron a través de la transwell y alcanzaron inferior de los insertos se fijaron y tiñeron utilizando la tinción Diff-Quick (Siemens). Las células teñidas en 20 seleccionados al azar 200 × campos microscópicos fueron entonces contrarrestados mediante el software de imágenes de QCapture.
Cáncer in vivo experimentos de crecimiento
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH y aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Escuela de Medicina Monte Sinaí. poblaciones combinadas de PC3, 22Rv1, LAPC-4, HCT116, y células HT-29 transducidas con retrovirus que lleva los vectores de expresión vacía o sobreexpresión de TIMP-1 se utilizaron para experimentos de crecimiento de cáncer subcutáneos. En resumen, 2 × 10
se inyectaron 6 (, HCT116, y 29-HT PC3) o 5 × 10
6 (22Rv1 y LAPC-4) células por vía subcutánea en cada inmunocomprometidos Trapo-2 /ratón II2rg (Taconic) . Seis ratones se utilizaron para cada tipo de las células cancerosas infectadas. Después de tumores sólidos se hicieron visibles, los diámetros más largos y más cortos de los tumores sólidos se midieron usando un calibrador digital en los intervalos y la longitud como se indica en las figuras. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la siguiente fórmula: volumen del tumor = 1/2 x (diámetro más corto)
2 × diámetro más largo (mm
3). Al final de los experimentos, todos los tumores se fijaron y seccionaron para análisis histológico y inmunológicos.
Histología e inmunohistoquímica (IHC)
Histología se realizó tal como se describe [35]. Secciones de parafina derivadas de muestras de próstata y cáncer de colon de pacientes (CHTN) y tejidos de la próstata y cáncer de colon de la
se hicieron reaccionar in vivo
experimentos con diferentes anticuerpos como se detalla en leyendas de las figuras.
Estadísticas
Todos los datos se expresaron como media +/- SD. Se utilizó
t
de Student para analizar las diferencias estadísticas entre los grupos control y experimentales. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p
. & Lt; 0,05
Resultados
Los niveles séricos de TIMP-1 se encuentra elevado en los pacientes con cáncer de próstata en comparación con los hombres sin cáncer de
Serum TIMP-1 se ha informado a ser elevados en mama, gástrico, cáncer de colon y varios otros tipos de cáncer. En este estudio, se compararon los niveles séricos de TIMP-1 en 140 pacientes con cáncer de próstata en diferentes estadios de la enfermedad y 16 machos sin evidencia conocida de cáncer de próstata incluyendo pacientes con hiperplasia benigna de próstata mediante ELISA sándwich. Nuestros resultados mostraron que los pacientes con cáncer de próstata tenían un suero promedio de TIMP-1 concentración de 351.4 ng /ml, significativamente mayor que la concentración media de 211,0 ng /ml se observan en los hombres sin cáncer de próstata reclutados de una clínica de urología (
p
& lt; 0,001) (Figura 1A).
A. Serum TIMP-1 fue significativamente elevado en pacientes con cáncer de próstata (
p
& lt; 0,001), medida por ELISA de tipo sándwich (R & amp; D Systems). n = 16 para los individuos normales (CTRL) y N = 140 para los pacientes de cáncer de próstata (CaP). imágenes B. representativos muestran que TIMP-1 es elevada en el estroma del cáncer de próstata (n = 6) en comparación con sus homólogos normales (n = 6): TIMP-1 los niveles de proteína en tejidos de cáncer de próstata humano (BC y D) y de próstata humano normal tejidos (Ba y b) se evaluaron por inmunohistoquímica (IHC) usando TIMP-1 anticuerpo anti-humana (I + amp; D Systems). 1070624A: muestra de adenocarcinoma de próstata a partir de una de 73 años WM (puntuación de Gleason de 4 + 4 = 8; PSA de 5,6). 1070717A: tejido de adenocarcinoma de próstata a partir de una de 53 años WM (puntuación de Gleason de 4 + 3 = 7; PSA de 8,03). Bar, 100 micras. DISCOS COMPACTOS. TIMP-1 de expresión fue elevado en líneas celulares de cáncer de próstata más agresivos. TIMP-1 mRNA (C) y la proteína (D) expresión en varias líneas celulares de cáncer de próstata se mide por tiempo real qPCR (C) y un sándwich ELISA (D), respectivamente. TIMP-1 mRNA se normalizaron a la beta-actina en un dúplex qPCR. proteína TIMP-1 en medio acondicionado a partir de las líneas celulares indicadas se midió por TIMP-1 ELISA Duoset (R & amp; D Systems).
Human estroma cáncer de próstata expresan niveles más altos de TIMP-1
Para determinar el nivel de expresión de TIMP-1 en una variedad de tipos de cáncer humano, se realizaron búsquedas en bases de datos de expresión génica en www.oncomine.org, que mostraron que los niveles de TIMP-1 de transcripción son regulados hasta en la mayoría de los tipos de cáncer como el de colon humanos cáncer en comparación con sus homólogos normales (Figura S1). Además a la figura 1A, los estudios han demostrado que los niveles de TIMP-1 en plasma de pacientes con cáncer de próstata son elevados y los elevados niveles de TIMP-1 predicen para disminución de la supervivencia de los pacientes (CR) de cáncer de próstata resistentes a la castración [25,38]. A fin de evaluar la localización de TIMP-1 en cánceres de próstata humanos y determinar la posible fuente (s) de la plasma elevado TIMP-1, se realizó la inmunohistoquímica (IHC) en un panel de muestras de cáncer de próstata humano y los tejidos normales de la próstata. Los resultados mostraron que la proteína de TIMP-1 es de hasta regulado principalmente en el estroma del cáncer de próstata en comparación con su contraparte normal (Figura 1 B).
Para determinar los niveles de TIMP-1 de expresión en células de cáncer de próstata humano, que reunió a un panel de líneas celulares de cáncer de próstata humano (LNCaP, VCAP, LAPC-4, 22Rv1, DU145, PC3 y PC3 /M), una línea inmortalizada epiteliales normales de la próstata (RWPE-1) y su derivado maligno (WPE1-NB26-65) [39]. Se evaluaron los niveles de TIMP-1 mRNA y de la proteína en estas células, respectivamente, por análisis de qPCR y sándwich ELISA utilizando medio acondicionado derivado de estas líneas celulares. Ambos resultados experimentales mostraron que las líneas celulares de cáncer de próstata expresan varios niveles de TIMP-1 y que las líneas celulares más malignas tales como DU145, PC3 y PC3 /M expresaron niveles más altos de TIMP-1, tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Figura 1C-D) . Consistentemente, WPE1-NB26-65, una línea celular maligno derivado de las células epiteliales de próstata línea inmortalizada RWPE-1, expresó aproximadamente 10 veces más TIMP-1 de su línea celular parental (Figura 1C-D), lo que indica que el aumento de la expresión de TIMP-1 está asociada con la progresión del cáncer de próstata. En conjunto, estos resultados trabajan contra el dogma establecido y sugieren un pro-tumoral en lugar de la actividad anticancerígena de TIMP-1.
TIMP-1 promueve el crecimiento del cáncer de próstata
Para determinar el papel potencial de TIMP-1 en la progresión del cáncer de próstata, se seleccionaron tres células de cáncer de próstata, PC3, 22Rv1, y LAPC-4, ya que son capaces de formar tumores en ratones inmunodeprimidos, para sobreexpresar v5-etiquetado con epítopo exógeno TIMP-1 (Figura 2A) . PC3, 22Rv1, y las células LAPC-4 transducidas con los vectores de expresión vacíos fueron utilizados como los controles negativos. El aumento de la expresión de V5-epítopo etiquetado TIMP-1 fue validado por análisis de transferencia Western de sobrenadantes de cultivo celular de las poblaciones reunidas de células de cáncer de próstata transducidas (Figura 2A). Estas poblaciones combinadas de células transducidas se implantaron por vía subcutánea en Trapo-2 /II2rg ratones inmunocomprometidos y tasas de crecimiento del tumor se evaluaron y se calculan como se describe en materiales y métodos. Nuestros resultados muestran que el aumento de expresión de TIMP-1 promovió significativamente el crecimiento de PC3, 22Rv1, y las células LAPC-4 de cáncer de próstata
in vivo
(Figura 2B-E) y el efecto promotor de TIMP-1 es más potente en 22Rv1 y LAPC-4 células, presumiblemente debido al nivel endógeno inferior de TIMP-1 en estas células en comparación con células PC3.
A. Establecimiento de las poblaciones combinadas de PC3, 22Rv1 y LAPC-4 células que expresan epítopo V5 marcado TIMP-1 o transducidas con el vector de expresión vacío solo (controles). Secretada v5-etiquetados TIMP-1 se detectó mediante anti-V5 mAb (Invitrogen). B. TIMP-1 promueve la próstata PC3 y 22Rv1 el crecimiento del cáncer
en
in vivo
. Los pesos de los tumores derivados de las células de cáncer PC3 y 22Rv1 de próstata que expresan TIMP-1V5 o infectadas con la expresión vacía constructos (control PC3 y 22Rv1-control) se midieron de 5 ó 10 semanas, respectivamente, después de la implantación subcutánea de las células cancerosas en trapo-2 /ratones II2rg (Taconic). n = 6.
*
p Hotel & lt; 0,05. C-E. Las tasas de crecimiento de los tumores de próstata subcutáneos derivados de PC3 (C), 22Rv1 (D), y las células LAPC-4 (E) que expresan TIMP-1V5 o transducidas con el vector de expresión vacío (controles) como se indica en los paneles. Las tasas de crecimiento se expresan como la media de los volúmenes tumorales (mm
3) +/- SD. Seis ratones se utilizaron para cada tipo de células de la próstata transducidas.
*
p Hotel & lt; 0,05.
TIMP-1 promueve la acumulación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) in vivo
Para hacerse una idea de mecanismo potencial responsables del efecto a favor del crecimiento de TIMP-1 en el cáncer de próstata , se realizó inmunohistoquímica (IHC) el análisis de las secciones de tumores derivados de éstos
in vivo
experimentos y observamos que las secciones de tumores derivados de las células de cáncer de próstata con el aumento de la expresión de TIMP-1 pantalla mayor cantidad de CAF (Figura 3-paneles superior y medio). Los CAF se detectaron usando anticuerpo anti-alfa-actina de músculo liso (SMA), que se usa rutinariamente para resaltar CAF [40-42]. Ha sido bien establecido que los CAF juegan un papel importante en la promoción de la progresión del cáncer y media la resistencia terapéutica [43,44] y que los CAF se asocian con un mayor riesgo de invasión tumoral y la metástasis [45-47].
El tumor las secciones se derivan de las células PC3 /de control de 22Rv1 y PC3 /22Rv1-TIMP-1 células. Las secciones se tiñeron con H & amp; E (AD) para revelar la histología del tumor, con anti-alfa actina de músculo liso (anti-SMA, R & amp; D Systems) para detectar los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF, EH), y con anti- anticuerpo Ki67 (BD) para resaltar las células de cáncer de próstata en proliferación (IL). Bar, 100 micras de A-H y 50 micras de I-L. .
TIMP-1 promueve la proliferación de células de cáncer de próstata in vivo
Se establece que en los CAF secretan muchos factores de crecimiento que a su vez regulan la proliferación tumoral y la supervivencia [43,46,47 ]. Para evaluar cómo el aumento de la expresión de TIMP-1 afecta a la proliferación de células de cáncer de próstata
in vivo
, se realizó un análisis inmunohistoquímico de Ki67, un marcador de proliferación, en las secciones del tumor. Nuestros resultados muestran que el aumento de expresión de TIMP-1 aumentó significativamente el número de Ki67 positivo y por lo tanto la proliferación de células de cáncer de próstata (Figura 3 paneles de fondo).
TIMP-1 se sabe que juega un papel en la promoción de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [48]. Para probar si el aumento de expresión de TIMP-1 induce la expresión de los marcadores de EMT, se analizaron las secciones tumorales derivadas de los
in vivo
experimentos para la expresión de Snail, Slug, MMP-2 y MMP-9. Nuestros resultados mostraron que la expresión de Snail, MMP-2 y MMP-9, pero no Slug está regulado en secciones de cáncer de próstata derivados de PC3 y células LAPC-4 que sobreexpresan TIMP-1 en comparación con las secciones derivadas de la PC3 control y LAPC-4 células (Figura 4).
Los niveles de expresión de varios marcadores de EMT, como Snail (A, E, I, M), Slug (B, F, J, N), MMP-2 (C, G, K, O), y MMP-9 (D, H, L, P) se evaluaron en las secciones de tumores derivados de las células PC3 /LAPC-4 control (AD e IL, respectivamente) y 1 LAPC-4-TIMP-células PC3 /(EH y MP , respectivamente). Los resultados muestran que TIMP-1 aumenta la expresión de Snail, MMP-2 y MMP-9, pero no SLUG en los tejidos de cáncer de próstata. Bar, 50 micras de A, B, E, F, I, J, M, N y 100 micras en C, D, G, H, K, L, O, P.
TIMP -1 es elevado en el estroma de cáncer de colon humano agresivo y metastásico y aumento de la expresión de TIMP-1 promueve el crecimiento del cáncer de colon y acumulación de CAF en el cáncer de colon
a fin de validar la actividad general pro-tumor de TIMP- 1 y su efecto general sobre los CAF, evaluamos los niveles de TIMP-1 en muestras de cáncer de colon y de colon normal. Hemos encontrado que TIMP-1 nivel es elevado en el estroma de cáncer de colon en comparación con el de colon normal y que estroma de indiferenciada /cáncer de colon de grado superior y los cánceres de colon metastásico muestran mayores niveles de TIMP-1 en comparación con estroma de diferenciado de grado /inferior cáncer de colon (Figura 5A). Luego se evaluó el efecto de TIMP-1 en el crecimiento del cáncer de colon
in vivo
. Nuestros resultados muestran que el aumento de expresión de TIMP-1 promueve
in vivo
crecimiento de HCT116 humano y células HT-29 de cáncer de colon (Figura 5 B-D). En conjunto, estos resultados indicaron que TIMP-1 no sólo sirve como un marcador de pronóstico para la progresión del cáncer múltiple, pero también promueve la progresión del cáncer.
A. Imágenes representativas muestran que TIMP-1 nivel es elevado en el estroma de cáncer de colon (n = 6, parte superior central y paneles de fondo) en comparación con el de colon normal (n = 6, panel superior izquierdo). Estroma del cáncer indiferenciado /grado más alto de colon (n = 6, el panel central superior, Z4250) y el cáncer de colon metastásico (n = 6, abajo central y los paneles inferiores derechas, Z4250 y 4.081.525) muestra los niveles más altos de la estroma asociados TIMP-1 comparar a la del cáncer de colon diferenciada /menor grado (abajo a la izquierda, Z4265), cáncer de colon primario (panel superior medio), o los homólogos normales (colon normal, arriba a la izquierda; hepáticas normales, el panel superior derecho). Bar, 100 micras. blot B. Los análisis por Western usando el anticuerpo anti-V5 (Invitrogen) se realizaron para evaluar la expresión exógena de V5-epítopo etiquetado TIMP-1 (TIMP-1V5) en HCT116 (panel izquierdo) y células de cáncer de colon humano HT-29 (panel derecho) . DISCOS COMPACTOS. TIMP-1 promueve HCT116 y HT-29 el crecimiento del cáncer de colon
en
in vivo
. Los pesos de los tumores derivados de células HCT116 y HT-29 de cáncer de colon que expresan TIMP-1V5 o infectados con la expresión vacías construcciones (controles) se midieron 6 semanas después de la implantación subcutánea de las células cancerosas. n = 6.
*
p
. & Lt; 0,05
Para confirmar el efecto de TIMP-1 en la CAF, se realizó un análisis IHC similar sobre las secciones de tumores derivados de la
in vivo
estudios de cáncer de colon HCT116 con o sin aumento de la expresión de TIMP-1. Hemos encontrado que en comparación con los tumores derivados de células de control de HCT116 (Figura S2A-C), el aumento de expresión de TIMP-1 (HCT116-TIMP-1) promueve la acumulación de CAF de colon dentro de los tumores (Figura S2D-F). En conjunto, estos resultados proporcionan primero soporte para un nuevo papel de TIMP-1 en la regulación de la infiltración y /o expansión CAF.
TIMP-1 promueve la proliferación celular y la migración de próstata CAF y activa ERK1 /2 quinasas
Para revelar el mecanismo celular por el cual TIMP-1 promueve la CAF acumulación y la progresión del cáncer de
in vivo
, se evaluó primero los efectos del medio acondicionado (CM) derivada de células 22Rv1 de control y 22Rv1-TIMP-1 sobre la proliferación de CAF de próstata y la migración. Se encontró que el CM deriva de 22Rv1-TIMP-1 en las células efectivamente promovido más de proliferación del cáncer de próstata y transwell la migración en comparación con la CM derivado de células 22Rv1-control (Figura S3). A fin de determinar si se purificó TIMP-1 puede ejercer efectos similares en los CAF de próstata, hemos realizado experimentos adicionales usando purificada TIMP-1. Hemos encontrado que TIMP-1 promovió significativamente la proliferación de CAF de próstata, pero no la de las células de cáncer de próstata (Figura 6 AC) y que TIMP-1 motilidad mejora de forma significativa de estos CAF (Figura 6D), lo que sugiere que la acumulación mediada por TIMP-1 de CAF próstata es probable que el resultado de la infiltración tanto mejorada y expansión de los CAF de la próstata dentro de los tumores.
A-C. CAF de próstata o células de cáncer de próstata se sembraron a 2 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos, por triplicado. de células de cáncer de próstata y los ensayos de proliferación de CAF de próstata se realizaron cada día usando un conjunto de placas de 96 pocillos usando el kit Premix WST1 (Takara) siguiendo las instrucciones del fabricante.
*
p Hotel & lt; 0,05. D. próstata CAF fueron evaluados por su motilidad través transwell barrera en el transcurso de 30 horas en la presencia o ausencia de 250 ng /ml de TIMP-1. 0,5 x 10
6 células /ml CAF próstata se colocaron en las cámaras superiores del insertos Transwell (Costar) por triplicado. se muestran imágenes representativas de las células de la próstata CAF migrado a través de los insertos transwell. Las CAF próstata migrado a través transwell insertos en 20 al azar seleccionaron 200 x campos microscópicos se contaron.
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p Hotel & lt; 0,05. A-D, los resultados muestran medios representativos +/- DE de triplicados de uno de los dos experimentos independientes.
Para confirmar aún más los efectos de TIMP-1 en los CAF de próstata, derribaron TIMP-1 de expresión en los CAF de la próstata (Figura 7A) utilizando dos diferentes shRNA (Open Biosystems). Hemos encontrado que TIMP-1 desmontables inhibe la proliferación y la migración de próstata CAF significativamente (Figura 7B-C), lo que sugiere que TIMP-1 juega un papel importante en la regulación de los comportamientos de CAF, que a su vez la modulación de la progresión del cáncer. Esta idea fue apoyada además por nuestro hallazgo de que la próstata CAF pero no las células de cáncer de próstata expresan un nivel más alto del receptor de TIMP-1, tetraspanin CD63. CD63 es una proteína de membrana glicosilada muestra el peso molecular heterogénea (Figura 8A). TIMP-1 se encontró para activar la señalización mediante la unión al complejo beta1 CD63 /integrina en las células epiteliales de mama [49,50] pro-supervivencia. Hemos encontrado que TIMP-1 mejora la ERK1 /2 de la actividad CAF privadas de suero de próstata, pero no las células de cáncer de próstata (Figura 8B-C), lo que sugiere que la
in vivo
efectos de TIMP-1 en las células de cáncer de próstata podría ser ejercida a través de la próstata que afecta a los CAF indirecta (Figura 9).
A. Los niveles relativos de TIMP-1 en los CAF de próstata infectadas con shRNAs no dirigidos o shRNAs contra TIMP-1 se evaluaron mediante ELISA y los resultados mostraron que dos TIMP-1 shRNAs derribado TIMP-1 de expresión de ~ 70% y ~ 50%, respectivamente. B. CAF próstata se sembraron a 4 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos en ensayos de proliferación por triplicado y la CAF de próstata se llevaron a cabo todos los días utilizando un conjunto de placas de 96 pocillos utilizando el kit de premezcla WST1 (Takara).
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p Hotel & lt; 0,05. C. próstata CAF fueron evaluados por su motilidad través transwell barrera en el transcurso de 30 horas en la presencia o ausencia de 250 ng /ml de TIMP-1. 1 x 10
6 células /ml CAF próstata se colocaron en las cámaras superiores del insertos Transwell (Costar) por triplicado. Las CAF próstata migrado a través transwell en 20 al azar seleccionaron 200 x campos microscópicos se contaron.
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p Hotel & lt; 0,05.
A. Expresión de la proteína CD63 en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata humano, fibroblastos de próstata humanos (HAACP), y CAF de próstata humanos (PCAFs) se determinó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-CD63, que reconoce la proteína CD63 heterogénea glicosilada. Actina se utilizó como control para la carga de proteínas (panel inferior). ANTES DE CRISTO. Las células privadas de suero de próstata CAF (B) y 22Rv1 células de cáncer de próstata (C) fueron suministrados con medio libre de suero (SFM) o SFM que contenía 250 ng /ml de TIMP-1 durante 3 y 12 horas. Las células fueron lisadas y las proteínas se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-AKT (paneles inferiores) anti-fosfo-ERK1 /2 o anticuerpos (paneles superiores) anti-fosfo-AKT, o anti-ERK1 /2 o.
: El aumento de expresión de TIMP-1 por las células tumorales y conduce a CAF CAF aumento de la proliferación y la migración a través de la unión de TIMP-1 al receptor de TIMP-1, CD63 expresado sobre los CAF, que conduce a la acumulación de CAF dentro de los tejidos de cáncer.