Extracto
Estudios recientes encontraron que TIPE2 estuvo involucrado en el desarrollo del cáncer. Sin embargo, poco se sabe sobre TIPE2 en el cáncer de pulmón. Nuestro estudio tiene por objeto aclarar el papel de TIPE2 en la carcinogénesis pulmonar. Se examinó la expresión de TIPE2 en el cáncer pulmonar de células escamosas (LSC), cáncer de pulmón de células pequeñas y tejidos de adenocarcinoma de pulmón (ADC) y encontró que la expresión TIPE2 se perdió en el cáncer de pulmón de células pequeñas, en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes. La sobreexpresión de TIPE2 inhibió significativamente el crecimiento de células de cáncer de pulmón H446
in vitro
y la formación de tumores, incluso suprimida
in vivo
. La citometría de flujo análisis encontró TIPE2 sobreexpresión promueve la apoptosis de H446. En TIPE2 La sobreexpresión de las células, la caspasa-3, caspasa-9, y Bax fueron significativamente hasta reguladas mientras estaba regulada hacia abajo-Bcl-2. Además, los resultados coincidentes se muestran por inmunohistoquímica en los tumores de ratones desnudos. TIPE2 inhibió la fosforilación de Akt, mientras que la promoción de la fosforilación de la p38, pero no tuvo efecto sobre la vía I? B? Y ERK. Tomados en conjunto, TIPE2 promovido pulmón apoptosis de células de cáncer a través de que afecta a las moléculas relacionadas con la apoptosis caspasa-3, caspasa-9, Bcl-2 y Bax, posiblemente a través de la regulación de P38 y Akt, lo que indica que TIPE2 podría ser un nuevo marcador para el diagnóstico del cáncer de pulmón y La terapia
Visto:. Liu QQ, Zhang FF, Wang M, Qiu JH, Luo CH, Zhu GY, et al. (2015) TIPE2 inhibe el crecimiento del cáncer de pulmón La atribución de promoción de la apoptosis mediante el control de alguna expresión apoptóticos moléculas. PLoS ONE 10 (5): e0126176. doi: 10.1371 /journal.pone.0126176
Editor Académico: Jin Cheng P., H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: 19 de diciembre de 2014; Aceptado: March 30, 2015; Publicado: 6 Mayo 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. la financiación fue proporcionada por los Fondos nacionales de Ciencias Naturales de China (81101764) http://www.nsfc.gov.cn/, la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian de China ( 2011J05099) http://www.fjkjt.gov.cn/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y sigue siendo la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer [1]. Hay aproximadamente 1.000.000 nuevos casos de cáncer de pulmón y más de 800.000 muertes estimadas cada año en el mundo [2]. A pesar de los recientes avances en las técnicas diagnósticas y terapéuticas, la tasa de supervivencia global a los 5 años de los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo inferior al 15% [3]. Por lo tanto, es una necesidad urgente para revelar el mecanismo molecular de cáncer de pulmón y encontrar nuevos biomarcadores candidatos con potencial valor clínico, lo que facilitará el desarrollo de dianas terapéuticas más eficaces y estrategias de tratamiento.
El factor de necrosis tumoral (TNF ) proteína alfa inducida por 8-como 2 (TNFAIP8L2), también conocido como TIPE2, es un miembro de la familia TNFAIP8 y un regulador negativo recién descrito tanto de la inmunidad innata y adaptativa [4]. Impide hiper-respuesta y mantiene la homeostasis inmune a través de la supresión de TLR y la función TCR, y su deficiencia en ratones conduce a la inflamación de varios órganos [4]. Por otra parte, en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas como lupus eritematoso sistémico y la hepatitis, la expresión TIPE2 está también el regulado e inversamente correlacionada con la progresión de la enfermedad [5,6]. Sin embargo, diferente de TIPE2 murino, que se expresa preferentemente en las células hematopoyéticas, TIPE2 humano se expresó también en una amplia variedad de tipos de células no hematopoyéticas [4,7,8].
acciones TIPE2 humano aproximadamente 53% la identidad y la secuencia de ácido amino 78% de similitud con TNFAIP8, y aproximadamente 94% homóloga con murino TIPE2 [4]. Los estudios iniciales mostraron que otros miembros de la familia TIPE como TNFAIP8 y TIPE1 juegan un papel en la carcinogénesis en la mayoría de los cánceres humanos [9-11]. La estructura cristalina de alta resolución de TIPE2 revela que contiene una gran cavidad central hidrofóbica, que parece ser un dominio DED-como se diferencia de la caspasa-8 o cFLIP [12]. Murino TIPE2 inhibe MAPKs y NFkB vías de señalización que promueven la apoptosis inducida por Fas [4]. Además, la sobreexpresión de TIPE2 en ratones da como resultado muerte celular y significativamente inhibe la tumorigénesis inducida por Ras [13]. Sin embargo, TIPE2 no es detectable o pobremente expresado en la mayoría de líneas celulares de carcinoma humanos [7]. Estos resultados sugieren que, además de la inflamación, TIPE2 puede también estar implicado en el desarrollo del cáncer.
se han centrado en TIPE2 y los cánceres humanos en los últimos años los estudios cada vez mayor. TIPE2 suprime el desarrollo TLR4 mediada de cáncer de colon mediante la inhibición de la actividad de caspasa-8 [14], mientras que su expresión se correlaciona positivamente con la clasificación TNM en pacientes con carcinoma de células renales (CCR) [15]. Recientemente, TIPE2 se prueba que es un inhibidor endógeno de Rac1 en el hígado por la que se suprime la invasión y metástasis de carcinoma hepatocelular (HCC) [16]. Sin embargo, el papel de TIPE2 en cáncer de pulmón no está claro. En este estudio, proporcionamos evidencias en primer lugar indicamos que TIPE2 suprime el crecimiento y promueve la apoptosis de cáncer de pulmón a través de la regulación del equilibrio Bcl-2 /Bax y luego conduce a la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 posiblemente a través de que afecta a P38 y Akt .
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por los Comités de Ética de investigación Institucional de la primer hospital Afiliado de la Universidad de Xiamen, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. Todas las muestras se manipulan y hacen anónimos de acuerdo con las normas éticas y legales. Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Xiamen.
Las muestras de tejido
Los especímenes de cáncer de pulmón incluidos en parafina se utilizaron para el análisis inmunohistoquímico. Los especímenes de cáncer de pulmón incluidos en parafina muestras consistieron en 25 escamosas de pulmón, cáncer de adenocarcinoma de pulmón 20, 15 pequeñas muestras de cáncer de pulmón y 30 muestras de pulmón no tumorales adyacentes. Todos los pacientes reclutados en este estudio recibieron radioterapia ni quimioterapia ni antes de la cirugía.
Cultivo celular, la construcción del plásmido y transfección
Las líneas de células NCI-H446 humanos fueron adquiridos de la Academia China de Medicina Ciencias (Shanghai, china). La célula H446 se cultivaron en RPMI unidades 1640 (Gibco) suplementado con 10% FBS (Hyclone), 100 unidades /ml de penicilina y 100 /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C. gen TIPE2 humano de longitud completa se generó a partir del clon de ADNc por PCR y después se clonó en el vector pRK5 mediante técnicas moleculares estándar y verificado por secuenciación. La transfección de células tumorales con el vector se realizó usando el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para generar líneas de células transfectadas estables, se seleccionaron las células transfectadas en medio RPMI 1640 que contiene 500 mg /ml de G418 durante dos semanas para aislar las colonias formadas para una mayor expansión. Al final de la transfección, expresión TIPE2 se verificó por transferencia de Western.
La inmunohistoquímica (IHC)
especímenes
embebidos en parafina-(4 micras) se utilizaron para el análisis como la técnica de inmunohistoquímica estándar. Brevemente, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-TIPE2 (Abnova) durante la noche a 4 ° C. tinción secundaria se realizó con anticuerpo secundario conjugado con HRP utilizando un kit de Max Vision. La inmunorreactividad se visualizó usando un kit de sustrato de peroxidasa DAB (Maixin Co, Fuzhou, China) y contratinción con hematoxilina. En los controles negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos por PBS. Todo tinción IHC fue evaluada de forma independiente por dos patólogos experimentados en un esfuerzo por proporcionar un consenso sobre los patrones de tinción de acuerdo con un método de puntuación, como se ha descrito anteriormente [17,18]. Al menos 10 campos de gran aumento, seleccionados al azar, y & gt; 1000 se contaron las células de cada muestra. Cada caso se puntuó de acuerdo a la intensidad y el área de la tinción. La intensidad de la tinción se clasificó en las siguientes escalas: 0, sin tinción; 1+, tinción leve; 2 +, tinción moderada; 3+, tinción intensa. El área de la tinción se evaluó de la siguiente manera: 0, sin tinción de las células en los campos microscópicos; 1+, & lt; 30% de tejido teñido positivo; 2+, 30-60% teñido positivo; 3+, & gt; 60% tiñeron positivo. Una puntuación de tinción combinada (intensidad + extensión) de entre 0 y 3 se considera baja expresión, mientras que una puntuación de entre 4 y 6 fue considerada como alta expresión.
Western Blot
Las células se cosecharon y se lisaron en tampón de lisis con cóctel inhibidor de proteinasa (Roche) y PMSF (Sigma). A continuación, 30 g de lisados de cada muestra se separó por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% y se sondaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-TIPE2 (dilución, 1: 800; Abnova), anti-caspasa-3 p17 (dilución, 1: 400; de Santa Cruz), anti-caspasa-9 (dilución, 1: 400; Santa Cruz), anti-Bcl-2 (dilución, 1: 200; Santa Cruz), anti-Bax (dilución, 1: 1000; Santa Cruz), anti -ERK (dilución, 1: 1000; CST), anti-fosfo-ERK (dilución, 1: 1000; R & amp; D), anti-P38 (dilución, 1: 1000; CST), anti-fosfo-P38 (dilución, 1: 1.000; CST), anti-Akt (dilución, 1: 1000; CST), anti-fosfo-Akt (dilución, 1: 1000; CST), anti-I? B? (dilución, 1: 1000; CST), anti- fosfo-I? B? (dilución, 1: 1000; CST), y anti-β-actina anticuerpo (dilución, 1: 4000; Abcam), a continuación, seguidos de rábano picante anticuerpos conjugados con peroxidasa secundario (anti-conejo o IgG de ratón, 1: 5000; Santa Cruz) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, los blots fueron desarrolladas utilizando reactivo de detección ECL (GE Healthcare) y se cuantificaron por densitometría usando el sistema de análisis de imagen ImageQuant (Tormenta escáner óptico). Todos los experimentos se realizaron de forma independiente tres veces por lo menos.
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 500 células por pocillo, y se sustituye el medio cada 3 días . Dos semanas más tarde, las células se lavaron por PBS, y se fijaron con metanol durante 15 minutos, después se tiñeron con violeta cristal. Las colonias que consistían en más de 50 células se contaron y se calculan como un porcentaje de la del grupo de control. El experimento se realizó de forma independiente tres veces por lo menos.
MTT ensayo
La viabilidad celular se detectó mediante el ensayo de MTT. Un total de 3000 células por pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos con tres pocillos por triplicado. Después de la incubación durante 24 horas, 10 l de MTT (500 mg /ml; Sigma-Aldrich) se añadió al medio y se cultivaron durante otras 4 horas. A continuación, el medio se desechó y se añadieron 150 l de sulfóxido de dimetilo (Sigma-Aldrich) para disolver el producto de formación. Por fin, la absorbancia de cada pocillo se midió a una longitud de onda de 490 nm. Cada ensayo se repitió tres veces por lo menos.
análisis de citometría de flujo
El efecto de TIPE2 en apoptosis de las células se determinó mediante tinción con anexina V FITC seguido de análisis de citometría de flujo. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en 1 x tampón de unión (BD Biosciences) a una concentración de 1 x 10
6 células /ml. 100 l de la solución se transfirió a un tubo de cultivo de 5 ml, a continuación, 5 l FITC anexina V (BD Biosciences) y 10 PI l (BD Biosciences) se añadieron en el tubo. Después de eso, las células se mezclaron suavemente y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, se añadió 1 ml de PBS a cada tubo y las muestras se analizaron por citometría de flujo dentro de 1 hora. Todos los experimentos se repitieron por triplicado.
En vivo
tumorigénesis ensayo
Seis semanas de edad BALB /c ratones desnudos fueron adquiridos de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. 5 × 10
6 H446 células transfectadas con TIPE2 se inyectaron sobre-expresión de vector (grupo TIPE2) en 100 l de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho, mientras que el vector de control (grupo de control) en flanco izquierdo de los ratones desnudos, 10 ratones desnudos fueron usado en este experimento. El tamaño del tumor se midió cada dos días y se calculó el volumen del tumor de acuerdo con la siguiente fórmula: longitud x anchura x anchura x 0,5. Aproximadamente seis semanas después, todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y luego se eliminaron los tumores, se pesaron, y se fijaron en formalina para el análisis posterior.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se llevaron a a cabo con el programa SPSS 13.0. Se utilizó la χ
2 test para el análisis de la expresión TIPE2 entre los subtipos de cáncer de pulmón y los tejidos no tumorales adyacentes. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación entre los diferentes grupos. Las diferencias en el crecimiento del tumor y el peso entre dos grupos de ratones desnudos se evaluaron mediante análisis de medidas repetidas de la varianza.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
TIPE2 expresión se redujo reguladas o se pierden en el cáncer escamoso de pulmón y pequeños tejidos de cáncer de pulmón de células
Estudios recientes revelaron que ya TIPE2 expresión se correlacionaron significativamente con algunos tipos de cáncer como el RCC y carcinoma hepatocelular [15]. Sin embargo, el patrón de expresión TIPE2 en cáncer de pulmón está claro hasta ahora. Para evaluar la relación de TIPE2 cáncer de pulmón de expresión y de los tejidos, se detectó el estado de la expresión de TIPE2 en los tipos histológicos comunes de los tejidos de cáncer de pulmón mediante técnicas de inmunohistoquímica, incluyendo 25 tejidos pulmonares de adenocarcinoma, 20 de pulmón tejidos de carcinoma escamoso, 15 pequeños tejidos de cáncer de pulmón de células y 30 tejidos pulmonares no tumorales adyacentes. Como se muestra en la (Fig 1A y 1B), en los tejidos del pulmón no tumorales, se observó TIPE2 fuerte tinción en las células alveolares epiteliales de pulmón y células bronquiales. Y en epiteliales bronquiales con metaplasia escamosa, TIPE2 todavía tenía una fuerte tinción (Figura 1C). En tejidos de cáncer de pulmón, TIPE2 mostró una fuerte tinción en el adenocarcinoma pulmonar primario y metástasis ganglionares tejido (Fig 1D, 1E y 1F), pero mostró tinción muy débil en el cáncer escamoso de pulmón e incluso casi ninguna tinción en la mayoría de cáncer de pulmón de células pequeñas (Fig 1G, 1H y 1I). Curiosamente, (Fig 1H) mostró expresión TIPE2 muy débil en los nidos de pulmón escamoso células cancerosas (flechas rojas) y una fuerte tinción de TIPE2 en las epiteliales bronquiales adyacentes simultáneamente. En estroma cáncer de pulmón, no se encontró ninguna tinción de TIPE2 en las células fibroblastos, pero fuerte tinción se pudo encontrar en las células inflamatorias tales como los macrófagos y plasmocitos. En las células cancerosas positivas, TIPE2 tinción se encuentra predominantemente en el citoplasma, pero rara vez en nuclear. El análisis estadístico (Tabla 1) indicó la expresión TIPE2 fue significativamente las reguladas en el cáncer escamoso de pulmón y pequeños tejidos de cáncer de pulmón de células en comparación con los tejidos pulmonares no tumorales, mientras que no hay diferencia entre adenocarcinoma de pulmón y los tejidos del pulmón no tumorales. Los resultados demostraron que TIPE2 se había reducido regulado en algunos subtipos histológicos de cáncer de pulmón, que nos animó a estudiar más a fondo el papel específico y el mecanismo subyacente de TIPE2 en el desarrollo del cáncer de pulmón.
imágenes representativas de la expresión TIPE2 en alveolar epitelio (A), del epitelio bronquial (B), del epitelio bronquial con metaplasia escamosa (C), ADC de pulmón (D, e), ganglios linfáticos positivos de la ADC de pulmón (F), cáncer escamoso de pulmón (G, H) y de pulmón de células pequeñas cáncer (I).
TIPE2 inhibió el crecimiento y promueve la apoptosis de las células del cáncer de pulmón
in vitro
Para investigar el potencial de la función biológica TIPE2 en el cáncer de pulmón, que examinó los efectos de TIPE2 sobre el crecimiento celular de células de cáncer de pulmón H446 mediante el ensayo de MTT y el ensayo de formación de colonias, y la apoptosis por citometría de flujo. Para un máximo de regular la expresión TIPE2 en H446, TIPE2 sobre-expresión de vector se construyó y se transfectaron de forma estable en células H446. Western Blot valida la expresión en células H446 TIPE2 no transfectadas (H446 /Null), control de vectores transfectadas (H446 /Control) y TIPE2 sobre-expresión del vector transfectadas (H446 /TIPE2). Como se muestra en la (Fig 2A), H446 /H446 nulo y /control casi no mostraron expresión TIPE2, mientras H446 /TIPE2 reveló alto nivel de expresión TIPE2. ensayo de MTT (Fig 2B) y el ensayo de formación de colonias (Fig 2C) análisis mostraron una reducción de la viabilidad celular y un menor número de colonias observadas en H446 /TIPE2 respectivamente, en comparación con las células H446 /control y H446 /null, lo que indica TIPE2 podría inhibir el crecimiento de células de cáncer de pulmón . el crecimiento celular del cáncer se ve afectada por dos factores principales, incluyendo la proliferación y la apoptosis. Se informó de que murino TIPE2 podría promover la apoptosis inducida por Fas [4]. Tiene TIPE2 posible papel en la apoptosis de cáncer de pulmón? Por lo tanto, hemos aplicado de citometría de flujo para revelar efecto de TIPE2 sobre la apoptosis de H446. Como se muestra en la (Fig 2D), la tasa de apoptosis temprana de H446 /TIPE2, H446 /H446 Control y /Null era 21,08%, 9,21% y 9,15% respectivamente, lo que mostró que sobreexpresan TIPE2 podría aumentar significativamente la tasa de apoptosis. Estos resultados sugieren TIPE2 puede suprimir eficazmente el crecimiento y promover la apoptosis de las células H446
in vitro
.
(A), TIPE2 sobre-expresión en H446 transfectadas con TIPE2 plásmido. (B), la viabilidad celular disminuyó después de TIPE2 sobre-expresión. (C), H446 /TIPE2 tenían menos formación de colonias en comparación con el vector. (D), TIPE2 regulación aumentó la tasa de apoptosis significativamente. * Indica
P Hotel & lt; 0.05.
TIPE2 regulada balance de Bcl-2 /Bax, escindidos de la caspasa-3 y caspasa-9 niveles mejorados
Los resultados anteriormente mencionados mostraron TIPE2 podría promover la apoptosis de las células H446. Entonces, estábamos más interesados en el mecanismo subyacente de la misma. Ha sido bien conocido que Bcl-2 equilibrio /Bax desempeña un papel importante en la apoptosis de las células [19], por lo que se investigó el efecto de la expresión TIPE2 en equilibrio Bcl-2 /Bax. Como se muestra en la figura 3, sobre-expresión de TIPE2 podría aumentar la expresión de Bax, mientras que disminuir la expresión Bcl-2, lo que implica que la función de TIPE2 en apoptosis de las células puede estar asociada con el equilibrio Bcl-2 /Bax. Además, se ha demostrado que la caspasa desempeña un papel fundamental en la ejecución de la vía final de la apoptosis [20]. Se investigó además si TIPE2 sería afectado a la activación de las caspasas moleculares apoptóticos tales como la caspasa-3 y caspasa-9. Por lo tanto, hemos detectado la expresión de caspasa-3 y caspasa-escindido 9 en H446 /Null, H446 /H446 Control y /TIPE2. Como se muestra en la figura 3, TIPE2 mejora los niveles de caspasa-3 y caspasa-9 expresión escindidos, lo que sugiere TIPE2 podría promover la activación de la caspasa-3 y capase-9.
(A), análisis de transferencia de Western de Bcl-2, Bax, caspasa-3 y caspasa-9 expresión en H446, vector, TIPE2. (B), histograma de los niveles relativos de expresión de las moléculas relacionadas con la apoptosis anteriormente mencionados.
TIPE2 aumento de la activación de la vía de p38 MAPK, mientras que la inhibición de la activación de Akt
También explorado el efecto de TIPE2 en varias vías de señalización mediante el análisis de moléculas de señalización clave involucrados. Se encontró que P38 y Akt, pero no vía ERK y la ruta de NF-kB, eran los objetivos de la acción TIPE2. Se detectó alto nivel de expresión de p38 MAPK fosforilada en células H446 que sobreexpresan TIPE2, mientras que la expresión nivel relativamente bajo de células nulas y de control (figura 4), lo que indica que TIPE2 puede activar vía de p38 MAPK. Sin embargo, el nivel de Akt fosforilada se redujo significativamente en las células H446 que sobreexpresan TIPE2 comparación con null y células de control (Fig 4). Además, también se examinó la expresión de otras moléculas de señalización tales como fosfo-ERK, fosfo-MEK, y fosfo-I? B? En H446 /Null, H446 /Control y H446 /TIPE2, entre los que se observó poca o ninguna diferencia (figura 4 ). En conjunto, estos datos indicaron que TIPE2 podría regular P38 y Akt, en el que TIPE2 era un regulador positivo de la vía de P38 mientras regulador negativo de la ruta de Akt
.
(A), análisis de transferencia de Western de algunas moléculas de señal común expresión en H446, vector, TIPE2. (B), histograma de los niveles relativos de expresión de las moléculas de señalización antes mencionados
TIPE2 la formación de tumores, obviamente, inhibido.
in vivo
Lo citado anteriormente los resultados mostraron TIPE2 pudo reprimir eficazmente el crecimiento y promover la apoptosis de las células H446
in vitro
. A continuación, se investigó su efecto sobre la tumorigénesis
in vivo
. Se inyectaron por vía subcutánea células H446 transfectadas con vector de control o TIPE2-expresión de vector en ratones desnudos para iniciar la formación del tumor. De la curva de crecimiento del tumor (figura 5B), el volumen del tumor de los grupos TIPE2-expresión se redujo significativamente comparar a los grupos de vectores. Unas seis semanas más tarde, todos los grupos de ratones desnudos fueron sacrificados y los tumores fueron aislados y ponderados (Figura 5A). El tamaño tumoral medio general de los grupos TIPE2-expresión fue significativamente menor que el de los grupos de vectores, lo que era coherente con los pesos de los tumores (Fig 5C). Todos estos resultados demuestran que la sobreexpresión de TIPE2 podría inhibir el crecimiento del tumor subcutáneo
in vivo
obviamente. Como mencionado anteriormente, la sobre expresión de TIPE2 tenido un impacto significativo sobre la expresión de algunas moléculas de apoptosis en células H446
in vitro
, tales como Bcl-2, Bax, caspasa-3 y caspasa-9. Por lo tanto, es necesario para dilucidar el efecto de TIPE2 en estas moléculas de expresión en los tumores de ratones desnudos
in vivo
. Se aislaron los tumores de los ratones desnudos, fijas, empotradas y convertidos en secciones, que a continuación se tiñeron mediante análisis immunohistochemistrical. Los resultados mostraron sobreexpresión de TIPE2 mientras que un aumento de la expresión de Bax, caspasa-3 y caspasa-9 y una expresión reducida de Bcl-2 en tumores TIPE2-sobreexpresión (Fig 6), que fueron similares a los resultados
in vitro
. También se detectó la expresión de Ki-67, un marcador de proliferación, en los tumores anteriores. No se detectó alteración de Ki-67 expresión independientemente de TIPE2 la sobre expresión (Fig 6), por la que se especuló que TIPE2 inhibe el crecimiento tumoral atribuir principalmente a su función de promover la apoptosis de las células H446, pero no a través de que afecta a la proliferación.
(A), una imagen representativa de los tumores aislados. (B), la curva de crecimiento del tumor subcutáneo de ratones desnudos inyectados con H446 /H446 vector y /TIPE2. (C), la media de los pesos tumorales de vector y el grupo TIPE2. * Indica
P Hotel & lt; 0.05.
magification, 200 ×.
Discusión
TIPE2 pertenece a la familia Tipe (TNFAIP8), que es un grupo identificado recientemente de proteínas que incluye cuatro miembros, TNFAIP8, TIPE1, TIPE2 y TIPE3 [4]. TNFAIP8 está asociado con la supervivencia celular aumentada y la inhibición de la apoptosis [21]. El derribo de la expresión de TNFAIP8 en las células tumorales puede reducir su tumorigenicidad [22]. Todas estas evidencias apoyan que TIPE es un oncogén y puede estar relacionado con la supervivencia celular y las vías de señalización relacionadas con el crecimiento malignos [11]. Alto nivel de TIPE1 mRNA se detecta en la mayoría de líneas celulares de carcinoma humano, lo que sugiere que puede desempeñar un papel en la carcinogénesis [11]. A diferencia de TNFAIP8 y TIPE1, principalmente TIPE2 fue encontrado jugó un papel fundamental en la inmunidad. Como se informó, TIPE2 era un nuevo gen que mantiene la homeostasis inmune y regula negativamente la inmunidad innata y adaptativa [4]. Sin embargo, la información sobre TIPE2 en el cáncer humano es limitado.
Unos pocos estudios sobre la relación de TIPE2 con cáncer ya se verifican TIPE2 tenía alguna función en el desarrollo del cáncer. En una investigación reciente, TIPE2 se pensó como un supresor tumoral en el carcinoma hepatocelular [16]. Sin embargo, se desconoce la relación entre TIPE2 y cáncer de pulmón hasta el momento. En nuestro estudio, hemos demostrado el nivel de expresión TIPE2 en cáncer de pulmón. Hemos encontrado que la expresión TIPE2 se había reducido regulado en el carcinoma escamoso de pulmón e incluso casi se pierde en el cáncer de pulmón de células pequeñas. Sin embargo, en el adenocarcinoma de pulmón, se encontró TIPE2 fuerte expresión, pero se analizó ninguna diferencia entre los tejidos del pulmón no tumorales y adenocarcinoma de pulmón. Estos resultados mostraron patrones de expresión TIPE2 podrían ser diferentes entre los diferentes subtipos histológicos de cáncer de pulmón, lo que sugiere TIPE2 podría desempeñar algunas funciones biológicas diferentes en diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón. Para averiguar la expresión TIPE2 en todos los tipos de cáncer de pulmón, increaseing el número de muestras de cáncer de pulmón en el futuro estudio puede ser necesario.
Por otra parte, este estudio interpretarse de manera preliminar la función biológica de TIPE2 en el cáncer de pulmón. Sobreexpresan TIPE2 promueve la apoptosis de las células H446
in vitro Hoteles en e inhibió el crecimiento del tumor
in vivo
. A nivel molecular, TIPE2 regulada Bcl-2 /Bax equilibrio y se activa la caspasa-3 y caspasa-9.
¿Le interesa buscar en las moléculas de señalización específicas posiblemente reguladas por TIPE2, que luego exhibió la expresión de algunos comunes moléculas de señalización después de TIPE2 sobre-expresión. alto nivel de expresión de p38 MAPK fosforilada se detectó después de TIPE2 regulación. Estudios recientes han sugerido un papel clave para MAPK P38 en la mediación de las vías que conducen a la apoptosis y de crecimiento señales inhibidoras [23,24]. Además, MAPK P38 desencadena la activación de la caspasa-3, 9 y también es necesario para la fosforilación de las proteínas relacionadas con la apoptosis, incluyendo Bax, Bim y Bcl-2 en células de cáncer tratados con OA [25]. En combinación con estos resultados, se especula que TIPE2 promueve la apoptosis de células de cáncer de pulmón a través de la activación de p38 MAPK, que desencadena la sobre-expresión de la caspasa-3 y caspasa-9. Además, también se encontró que TIPE2 disminuyó el nivel de Akt fosforilada. Como se informó, la vía de Akt es una vía de transducción de señales central que regula muchos aspectos críticos de la fisiología cáncer, incluyendo la proliferación celular, la morfología celular, la migración y la apoptosis [26]. Mientras tanto, algunas moléculas relacionadas con la apoptosis, tales como Bcl-2, Bax, caspasa-3 y caspasa-9 son afectados claramente por TIPE2. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una gran cantidad de evidencia de que TIPE2 promueve la apoptosis cáncer de pulmón. Curiosamente, hemos encontrado Ki-67 expresión no tenía ninguna alteración después de TIPE2 sobre-expresión, lo que indica que TIPE2 inhibe el crecimiento del cáncer de pulmón atribuir a la promoción de la apoptosis celular.
En su conjunto, las funciones TIPE2 como un supresor de tumores de pulmón para promover apoptosis de células de cáncer. Por lo tanto, la expresión forzada de TIPE2 humana puede ser una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer de pulmón.