Extracto
Cirugía inducida por la inflamación es un potente promotor de recidiva tumoral y la metástasis en el cáncer colorrectal. La familia recientemente descubierta de enzimas Nox representan una fuente importante de especies reactivas del oxígeno endógenas (ROS) y ahora están fuertemente implicada en la metástasis de células tumorales. Curiosamente, las enzimas pueden ser Nox 'propósito' activadas por citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento que están presentes en abundancia en la ventana perioperatorio. A medida que las células del cáncer de colon expresan enzimas NOX y Toll-like receptor 4 (TLR-4), se planteó la hipótesis de que el LPS puede potenciar la capacidad de las células de cáncer de colon a metastatizar a través de la enzima Nox señalización redox mediada. En apoyo de esta hipótesis, este trabajo demuestra que el LPS induce un aumento significativo, transitoria del endógena ROS en SW480, SW620 y células CT-26 de cáncer de colon. Este aumento de la actividad de ROS inducida por LPS está completamente abrogado por un inhibidor de Nox, diphenyleneiodonium (DPI), Nox1 siRNA y un inhibidor de NF-kappa B, dihidrocloruro. Un aumento significativo en la expresión de la proteína Nox1 y Nox2 se produce tras el tratamiento LPS. La inhibición de NF-kB también atenúa el aumento de la expresión de la proteína Nox1 y Nox2. La localización subcelular de la generación de ROS inducida por LPS se encuentra principalmente en el retículo endoplásmico. LPS activa la vía PI3K /Akt vía Nox genera ROS y esta señal es inhibida por el DIP. Este LPS activa mecanismo de Nox facilita un aumento significativo en la adhesión celular de cáncer de colon SW480 al colágeno I, que es inhibida por DPI, Nox1 siRNA y un inhibidor de PI3K. En conjunto, estos datos sugieren que la señalización redox eje LPS-Nox1 juega un papel crucial en la facilitación de la adhesión celular del cáncer de colon, lo que aumenta el potencial metastásico de células de cáncer de colon. Nox1 puede representar un objetivo valioso en el que para prevenir la metástasis del cáncer de colon
Visto:. O'Leary DP, Bhatt L, Woolley JF, Gough DR, Wang JH, Cotter TG, et al. (2012) de señalización TLR-4 Acelera Colon Cancer Cell Adhesion a través de NF-B mediada por transcripcional sobre regulación de Nox-1. PLoS ONE 7 (10): e44176. doi: 10.1371 /journal.pone.0044176
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 29 de mayo de 2012; Aceptado: July 30, 2012; Publicado: 11 Octubre 2012
Copyright: © O'Leary et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la segunda causa más común de cáncer. la mortalidad relacionada en el mundo occidental [1]. La resección quirúrgica sigue siendo el pilar del tratamiento curativo para el cáncer de colon. Sin embargo, aproximadamente 25 a 35% de los pacientes con ganglios positivos desarrollará una recidiva local o metástasis a distancia dentro de los cinco años después de la intervención [2]. Este fenómeno es debido a la liberación de mediadores inflamatorios en respuesta al trauma quirúrgico, que potencian la capacidad metastásica de las células tumorales y las células tumores residuales en circulación. Los efectos de este fenómeno se manifiesta en una reducción significativa de la libre de enfermedad y la supervivencia global de los pacientes con cáncer colorrectal.
Adherencia de las células
tumor es un paso esencial de la cascada metastásica. La evidencia reciente ha demostrado cómo las especies de oxígeno reactivo inducida por cirugía exógenos (ROS) mejorar la capacidad de las células tumorales circulantes a adherirse al revestimiento endotelial mediante la creación de huecos intercelulares, lo que permite que las células tumorales se adhieren preferentemente a la matriz extra-celular expuesta. Estos efectos citotóxicos destructivos de ROS se producen a altos niveles. Sin embargo, a niveles bajos, endógena ROS puede promover la supervivencia celular mediante la regulación de las vías de supervivencia redox sensibles, tales como PI3K /Akt, que ha sido fuertemente implicado en la facilitación de la metástasis de las células tumorales.
Enzimas
Nox son una fuente importante de endógena la generación de ROS en respuesta a mediadores inflamatorios tales como citoquinas, factores de crecimiento y condiciones de hipoxia, todas las cuales se elevan en respuesta al trauma quirúrgico [3] - [4]. enzimas Nox consisten de una familia de enzimas, 7 Nox1-5 y [5] Duox1,2. Curiosamente, la expresión de enzimas de Nox en células de cáncer ha sido recientemente descrito y ROS derivados de Nox son ahora conocidos para facilitar el proceso metastásico en células de cáncer incluyendo de colon, melanoma, páncreas y células de cáncer gástrico [6] - [8]. La evidencia reciente sugiere que los efectos de señalización de ROS derivados de NOx es dependiente del contexto, ya que no sólo confieren efectos pro-inflamatorios, pero también juegan un papel en el mecanismo de defensa anti-inflamatorio celular [9].
El lipopolisacárido ( LPS) o endotoxina es un potente desencadenante de la respuesta inflamatoria de acogida en la ventana perioperatoria. LPS es un antígeno bacteriano gram negativo que se transloca a través de la pared intestinal después de la cirugía mayor o durante un episodio séptico, lo que resulta en una endotoxemia [10]. El reconocimiento de LPS por Toll-like receptor-4 (TLR4) induce la inmunidad innata a través de una cascada de señalización intracelular en una forma dependiente o independiente MyD88. Tanto in vitro e in vivo ahora implican LPS inducido por la señalización de TLR-4 como un disparador de todas las facetas de la cascada metastásica incluyendo la adhesión [11] - [12]. Además, TLR-4 expresión en células de cáncer de colon se asocia con un mayor riesgo de formación de metástasis de hígado en pacientes con cáncer de colon y confiere un peor pronóstico [13] - [15].
Como evidencia reciente sugiere, exitoso metástasis de células tumorales es promovida por los efectos destructivos de exógena ROS. Tenemos la hipótesis de que los niveles no tóxicos endógenos de ROS también pueden desempeñar un papel importante en la organización de la metástasis de las células tumorales. Aquí, demostramos cómo un eje de señalización de LPS-Nox1 da lugar a un aumento significativo de la capacidad adhesiva de las células de cáncer de colon. activación LPS de la actividad Nox se produce en una forma dependiente de NF-kappa B que da como resultado un aumento transitorio de ROS intracelulares. Este aumento transitorio de ROS intracelulares provoca la fosforilación de Akt redox sensible. En conjunto, estos datos sugieren que el eje de señalización redox LPS-Nox1 juega un papel crucial en la facilitación de la adhesión celular del cáncer de colon, lo que aumenta el potencial metastásico de células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
las líneas celulares de cáncer de colon humano, SW480, SW-620 y CT-26 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se mantuvieron en un estado sub-confluentes usando RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medio de cultivo suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 1% de penicilina /estreptomicina, y 4 mmol /L de L-glutamina todos de Sigma Aldrich, Dublín, Irlanda . Las células se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. Las células se cultivaron durante la noche antes del tratamiento para permitir la unión de LPS
Los anticuerpos y reactivos
LPS derivan
E. coli cepa
055:. B5 se adquirió de Sigma-Aldrich. En este estudio se utilizaron los siguientes anticuerpos - Nox1, p22phox, p47phox (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), Nox2 (Upstate, Milton Keynes, Reino Unido), p-Akt (Señalización Celular), I? B-α , p-I? B-alfa (señalización celular), GAPDH (Advanced Immunochemicals, Long Beach, CA, EE.UU.). inhibidor de IKK (dihidrocloruro) se adquirió de Sigma y el inhibidor de PI3K (LY294002) se adquirió de Merck Chemicals (San Diego, CA, EE.UU.). knockdown dirigida de Nox1 se llevó a cabo usando siRNA. Dos construcciones se utilizaron diferentes (Ambion,#s25726, s25727).
La citometría de flujo
5 × 10
4 células por pocillo se sembraron durante la noche en una placa de 24 pocillos. Las células se trataron con LPS a una concentración de 1 ug /ml para 0,10,20,30,40,50,60 minutos y 24 horas. la producción de ROS después del tratamiento con LPS se controló utilizando 2 ', 7' diacetato dichlorodihydrofluorescin (DCF) (Molecular Probes, Leidin, Países Bajos). Las células se tripsinizaron, se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm y luego recogido. a continuación DCF se añadió a una concentración final de 50 mM y las muestras se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C antes del análisis en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). Dichlorofluorescin (DCF) de fluorescencia, se genera cuando DCF interactúa con ROS. ROS se mide así en el canal de fluorescencia 1 (FL-1) (530 nm) con excitación a 488 nm. Se utilizó el programa informático CellQuest (Becton Dickinson) para el análisis de datos.
Western Blot
Western Blot se realizó para medir el contenido de proteína de las células tratadas con 1 ug /ml de LPS de 0,10,20, 30,40,50,60 minutos y 24 horas. Las células fueron entonces trysinised y se centrifugaron para la colección. a continuación, se obtuvieron extractos de células enteras. Los sedimentos celulares se lavaron con PBS helado y después se resuspendieron en tampón de lisis celular 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mMNaCl, 1 mMNa3VO4, 1 mMNaF, 1 mMEGTA, Nonidet, inhibidores de proteasa 1% de p-40 0,25% de desoxicolato de sodio que contienen ( Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido) y 0,2 mM de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo fluoruro] y se incubaron en hielo durante 20 min. Todos los desechos se eliminó por centrifugación a 4 ° C y la concentración de proteína se cuantificó usando el ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) usando albúmina sérica bovina como estándar. cantidades equivalentes de proteínas se resolvieron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida sulfato de dodecil de sodio, seguido de la transferencia a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & amp; Schuell, Whatman, Dassel, Alemania). Las membranas se bloquearon con 5% (w /v) de leche seca no grasa en solución salina tamponada con Tris /0,1% de Tween-20 durante 1 h a temperatura ambiente. Se incubaron a 4 ° C durante la noche con la dilución apropiada de anticuerpo primario (1:1000 menos que se indique lo contrario). Después de 4 x lavados de 5 minutos con solución salina tamponada con Tris /0,1% de Tween-20, manchas de transferencia se incubaron con los correspondientes peroxidasa conjugados anticuerpo secundario (dilución 1:1000) para 1 hr. Posteriormente fueron lavadas de nuevo y se revelaron con reactivo de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Sondeo para GAPDH (1:5000) se utilizó para determinar la igualdad de carga de proteína.
Inmunofluorescencia y microscopía
Con el fin de localizar ROS generado en el tratamiento con LPS en las células SW480, las células se cultivaron durante 48 horas antes del experimento en el fondo de cristal platos (35 mm placas de Petri con micropocillos 14 mm; MatTek Corporation, Ashland, MA, EE.UU.). Las células utilizadas para la formación de imágenes en vivo fueron incubadas en 50 mM y 1 mM DCF tinte rastreador de ER (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) durante 1 hora a 37 ° C. LPS Una micro-molar se añadió a las células que contienen los colorantes de 30 minutos antes de la formación de imágenes. Donde se indique, las células se trataron con 10 mM DPI con DCF y colorantes de seguimiento ER durante 1 hora a 37 ° C y 1 M LPS se añadieron a las células 30 minutos antes de formación de imágenes. Después de esta incubación con los tintes, las células se lavaron y la imagen en cualquier medio de cultivo que contiene LPS o LPS y DPI o medio de crecimiento por sí solo. Las concentraciones para DPI y LPS se mantuvieron en el medio de crecimiento de lavado y al mismo tiempo imágenes de células. células SW480 también se tiñeron con 8 M menadiona durante 1 hora junto con 10 mM MitoPY y 1 M MitoTracker de color rojo oscuro (Invitrogen). Menadiona se utilizó como control positivo. Además, las células teñidas con MitoPY fueron tratados con LPS 1 mg /ml antes de la imagen. Las células SW480 se obtuvieron imágenes con un microscopio de barrido láser multifotónica Flouview1000 MPE (Tecnología Mason, Dublín, Irlanda) con un Ti rojo infrarrojo: Zafiro láser que es el modo de bloqueo. Las imágenes fueron adquiridas y se visualizaron usando un XLPLN 25 × WMP objetivo de inmersión en agua (1,05 apertura numérica: Olympus Optical GmbH, Hamburgo, Alemania) y las imágenes se almacenan con un software de flouview1000 Olympus (Mason Tecnología, Dublín, Irlanda). Durante adquisiciones, ajustes de detección se mantuvieron constantes para DCF para permitir la comparación directa de los niveles de ROS, en los que se compararon las células tratadas con LPS para tratar o LPS y el Departamento de células tratadas. Las imágenes han sido representados como una sola rebanada de una proyección Z-pila.
PCR cuantitativa
PCR cuantitativa se realizó en oligo-dT generó ADNc usando el sistema de detección de 2 MJ Research Opticon en combinación con el SYBR Green PCR Master Mix Quantitect (Qiagen, Crawley, Reino Unido). Los cebadores para Nox1, Nox2 y β-actina fueron comprados como Quantitect cartilla ensayos (Qiagen). Los siguientes parámetros de PCR se utilizaron para cada conjunto de cebadores: desnaturalización a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos, temperatura de hibridación de 56 ° C durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 segundos . RNA de muestras se analizaron por triplicado, y Nox1 o expresión Nox2 relativa se determinó a ß-actina a través de la 2
-ΔΔCt método.
Ensayo de adhesión
placas de 96 pocillos se revistieron con 150 l /pocillo de 0,01% de colágeno I durante la noche a 4 ° C y luego se bloquearon con 1% de BSA durante 1 hora a 37 ° C antes de la siembra de células. 5 × 10
4 células fueron resuspendidas en 100 l de medio de cultivo y se sembraron en cada pocillo. Las células se incubaron a 37 ° C durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS y luego 1% de cristal violeta se usó para teñir las células durante 20 minutos. Placa se lavó 3 veces y luego se dejó durante la noche para secar a Tempeture habitación. a continuación, la tinción de cristal violeta se disolvió en ácido acético al 10% y la concentración se determinó midiendo la absorbancia a 570 nm usando un lector de microplacas espectrofotométrico.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 18.1 para windows (SPSS, Dublín, Irlanda). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student para las comparaciones entre los grupos, y el análisis de la varianza (ANOVA). Densitometría en transferencias Western se realizó utilizando el programa ImageJ (de http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Los gráficos se construyeron utilizando Microsoft Excel 2010. Todos los valores del gráfico representan los valores medios +/- desviación estándar. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
LPS inducido por la señalización de TLR-4 aumenta los niveles de ROS intracelulares en células de cáncer de colon
SW480, SW620 y CT. -26 células expresan TLR-4 y por lo tanto fueron elegidos para examinar el efecto de la producción de ROS inducida por LPS [16]. Como se determinó por análisis FACScan, un aumento transitorio de los niveles de ROS intracelulares se ve en la respuesta al tratamiento LPS después de 40 minutos en todas las líneas celulares (Figura 1 (a)). Los niveles endógenos de ROS están casi a los niveles de control a los 60 minutos. Estos datos se cuantificó usando el programa informático CellQuest para medir las medias geométricas de las curvas (Figura 1 (b)). células SW480 generan consistentemente mayores niveles de ROS intracelular en comparación con SW620 y las células CT-26. Sobre esta base, las células SW480 son el foco principal de los experimentos posteriores.
(a) LPS inducido por un transitorio, aumento significativo de la actividad de ROS en SW480, SW620, Ct-26 células de cáncer de colon. SW480, SW620 y las células CT-26 se trataron con LPS (1 mg /ml) a veinte, cuarenta y sesenta minutos. fluorescencia DCF se midió utilizando citómetro de flujo FACScan y software CellQuest. Estos resultados se compilan en los histogramas anteriores. El eje Y representa el recuento de células y de las medidas del eje x, el nivel de fluorescencia. Un desplazamiento hacia la derecha a lo largo del eje x representa un mayor nivel de fluorescencia DCF y por lo tanto la producción de ROS. Todos los histogramas muestran un control (línea sólida y negro) con una línea de color que representa un aumento de fluorescencia DCF. El efecto de LPS sobre la actividad de ROS en SW480, SW620 y células CT-26 de cáncer de colon se cuantificó utilizando CellQuest para medir las medias geométricas de las curvas y en comparación con los controles no tratados ensayados en el mismo día, y se compara en un gráfico de barras. (B) LPS induce una dosis dependiente de ROS se echó a los 40 minutos. Una citometría de flujo histograma demuestra un cambio dependiente de la dosis en la actividad de ROS. (Solid línea de negro = sin tratar, verde = 0,1 g /ml, rojo = 1 g /ml, azul = 10 mg /ml El efecto dependiente de la dosis se cuantificó y se comparó en un gráfico de barras * P & lt;... 0.05 Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
a continuación trató de examinar si este aumento inducido por LPS en endógena ROS era sensible a las variaciones en la dosis de LPS. se demuestra que a medida que aumenta la dosis de LPS, los ROS aumentos de respuesta (Figura (1b)). Estos resultados indican que las células SW480 generan endógena ROS en respuesta a TLR-4 de señalización de una manera dependiente de la dosis en células de cáncer de colon.
inducida por LPS generación de ROS en células SW480 es abrogada por un inhibidor de la enzima Nox
Dado que TLR-4 de señalización induce un aumento significativo en los niveles de ROS endógenos, el próximo tratado de establecer la fuente intracelular de ROS inducida por LPS. actividad ROS inducida por LPS se conoce la participación TLR-4 interacción mediada con Nox4 en células de riñón embrionario [17]. Sin embargo, la fuente de intra-celular de LPS inducido por ROS en células de cáncer de colon es en gran parte desconocida. Otras fuentes posibles de la generación de ROS endógeno aparte de enzimas Nox incluyen las mitocondrias y las enzimas COX. Con esto en mente, hemos utilizado inhibidores dirigidos a prevenir la generación de ROS en las células SW480 de todas estas fuentes, incluyendo un inhibidor mitocondrial (rotenona), un inhibidor de la COX (diclofenaco) y un inhibidor de la proteína Nox (DPI). El tratamiento previo con rotenona se asoció con un ligero aumento en los niveles de ROS, de acuerdo con informes recientes de que la rotenona puede activar la actividad Nox [18]. Diclofenac provoca ninguna disminución significativa en los niveles de ROS intracelulares inducido por LPS (Figura 2 (a) y (b)). Curiosamente, el tratamiento previo con DPI resulta en abrogación completa de la actividad de ROS inducida por LPS en 40 minutos (Figura 2 (c)). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que las enzimas de NOx son la fuente de intra-celular más probable de ROS siguiente TLR4 señalización en células de cáncer de colon.
(a) A una atenuación significativa de la fluorescencia se observó en las muestras tratadas con el DPI ( 2 M). fluorescencia DCF se midió utilizando citómetro de flujo FACScan y software CellQuest. línea de negro sólido (control). línea roja (LPS tratada). línea verde (LPS + DPI tratada). (B, c) rotenona y diclofenaco no inhibir LPS (1 mg /ml) la actividad de ROS inducida en 40 minutos. * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
LPS tratamiento de las células SW480 aumenta los niveles de expresión y Nox1 Nox2
Como DPI dio lugar a la derogación completa de la actividad de ROS inducida por LPS, hemos deseaba investigar más a fondo el papel de las enzimas de NOx en la generación de ROS inducida por LPS en células SW480. Western Blot se utiliza para identificar la expresión de enzimas Nox. Nox1 así como Nox2 se encontró que se expresa (Figura 3 (a), (b)). Curiosamente, el nivel de expresión y Nox1 Nox2 aumenta en respuesta al tratamiento LPS. de expresión de proteínas Nox1 aumenta significativamente por encima del nivel de expresión sin tratar a los 40 minutos (Figura 3 (a)). Un aumento similar se observa en el patrón de expresión de Nox2 (Figura 3 (b)). La elevación de la expresión de la proteína Nox1 y Nox2 coincide con el aumento significativo de LPS generación de ROS inducida en 40 minutos vistos en citometría de flujo.
(a) Uso de Transferencia Western que muestran que la expresión en células SW480 Nox1 aumenta en respuesta a LPS (1 ug /ml). (B) Western Blotting también muestra que LPS aumento de la expresión de Nox2 en 40 minutos. se muestra (c) p22phox que se expresa y expresión aumenta antes de lo Nox1 y Nox2. se muestra (d) p47phox que se expresa pero la expresión es estable en los puntos de tiempo. (E) El análisis cuantitativo por PCR de mRNA y Nox1 Nox2 en las células SW480 tratadas con LPS (1 mg /ml) durante una hora. Los datos se representan como veces de cambio con relación al control de células no tratadas horas como se determina por el método 2-ΔΔCt. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar y son representativos de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
Activación de la enzima
Nox es dependiente en el montaje de sub-unidades individuales. Por lo tanto, también se examinó el efecto del tratamiento con LPS en la expresión de la proteína de p22phox y p47phox (Figura 3 (c, d)). No hubo cambios en la expresión de p47phox, sin embargo, había un aumento en la expresión de p22phox en veinte minutos y se mantuvo sostenido a través de a 60 minutos.
Además, investigó el aumento de la expresión de la proteína Nox1 y Nox2 en respuesta al tratamiento LPS usando RT-PCR para cuantificar los niveles de ARNm y Nox1 Nox2 en respuesta a LPS (Figura 3 (e)). Un aumento de 6 veces dramático en los niveles de ARNm de Nox1 y un aumento de 5 veces en los niveles de ARNm de Nox2 comparación con los controles no tratados se produce a los 20 minutos después del tratamiento LPS. Este aumento en los niveles de mRNA es transitoria y hay una reducción significativa por 40 minutos y 60 minutos después del tratamiento LPS. Estos resultados sugieren que LPS activa un factor de transcripción, lo más probable NF-kappa B, lo que aumenta Nox1 y mRNA Nox2 en respuesta a LPS. Esto entonces facilita un aumento en la expresión Nox1 y Nox2 a 40 minutos que se manifiesta con un aumento significativo en los niveles de ROS endógenos en células SW480. Con el fin de verificar esta teoría, que es necesaria para provocar el papel de NF-kB en LPS actividad endógena ROS inducida.
ROS inducida por LPS es dependiente de NF-kB
Como hay un vínculo establecido evidente entre LPS y la activación de NF-kB través de la vía MyD88, se investigó si NF-kB juega un papel en la actividad de ROS inducida por LPS. I-kappa-B quinasa (IKK) es una enzima que es necesaria para activar NF-kB. Un inhibidor de IKK se utilizó para inhibir la actividad de NF-kappa B (Figura 4 (a)). Pre-tratamiento con el inhibidor de IKK-resultó en abrogación completa de la actividad de ROS inducida por LPS en 40 minutos. IKB-α es una subunidad inhibidora de NF-kB. La fosforilación de IKB-α es necesaria para la activación de NF-kB. Sobre esta base, nos fijamos en la expresión pIKB-α en respuesta al tratamiento con LPS. Curiosamente, el nivel de pIKB-α es significativamente elevado en 20 minutos después del tratamiento con LPS (Figura 4 (b)). Es probable que la activación de NF-kappa B en 20 minutos después del tratamiento LPS permite la transcripción de ARNm necesaria para el aumento de la expresión Nox1 y Nox2 visto en 40 minutos.
(a) La cuantificación de la fluorescencia DCF utilizando el software CellQuest demuestra una reducción significativa de la actividad de ROS 40 minutos inducida por LPS en presencia de inhibidor de IKK (40 mg /ml) después del tratamiento con LPS (1 mg /ml). (B) p-I? B aumentó en la expresión a los 20 minutos después del tratamiento LPS. * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes. (C) LPS (1 mg /ml) expresión inducida Nox1 aumentó en 40 minutos después del tratamiento LPS, sin embargo pre-tratamiento con el inhibidor de IKK durante 1 hora reduce el nivel de expresión a niveles no tratados. expresión inducida Nox2 (d) LPS a 40 minutos también es reducida por el inhibidor de IKK. * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
Con el fin de demostrar que se requiere la activación de NF-kB por un aumento en la expresión Nox1 y Nox2 después del tratamiento con LPS, se volvió a utilizar un inhibidor de NF-kB. expresión de la proteína Nox1 inducida por LPS en 40 minutos se redujo por el inhibidor de IKK (Figura 4 (c)). Inducida por LPS expresión de la proteína Nox2 también se redujo significativamente a los 40 minutos en presencia del inhibidor de IKK (Figura 4 (d)). Así, parece que la generación de ROS inducida por LPS es dependiente de la activación de NF-kappa B que da como resultado un aumento de la expresión de Nox1 y Nox2 en SW480.
inducida por LPS DCF fluorescencia co-localiza en el retículo endoplásmico en células SW480
recientes terapias anti-oxidantes son más eficaces debido a la mayor biodisponibilidad y la posibilidad de orientar los orgánulos específicos que generan ROS, tales como la mitocondria. Como no hubo una disminución en los niveles de ROS con el uso de la rotenona, lo comentamos el compartimento subcelular que era responsable de la generación de ROS en respuesta a LPS. Nos células SW480 con DCF y un colorante ER rastreador primera co-manchadas y después se examinan mediante microscopía de fluorescencia multifotónica. DCF muestra un patrón de tinción peri-nuclear distinta en las células SW480 en respuesta al tratamiento LPS (Figura 5a). Este patrón es muy similar a lo que observamos con un tinte rastreador de ER y co-localiza con DCF. Esto sugiere que el aumento de ROS tras el tratamiento LPS se genera en el ER. Cuando las células SW480 fueron tratados con el DIP, esto atenúa la fluorescencia de DCF en el RE, lo que proporciona una prueba más de que la actividad de ROS inducida por LPS se asocia con la expresión de la enzima Nox. Estos experimentos indican que las ROS generados en respuesta a LPS se localizan en la sala de emergencia y, junto con la evidencia reciente que muestra que los TLR-4 /MD2 señales complejas a través de la sala de emergencias, demuestran que el ER desempeña un papel central en TLR-4 de señalización.
Las células fueron cultivadas durante 48 horas en fondo de cristal platos. (A) Las células se trataron con DCF y un colorante ER rastreador durante 1 hora a 37 ° C con LPS (1 mg /ml) 30 minutos antes de formación de imágenes con un microscopio de barrido láser multifotónica. (B) Las células se tiñeron con MitoTracker de color rojo oscuro (1 M) y (10 M) MitoPY, y se trataron con menadiona (8 M) o LPS (1 mg /ml) durante 1 hora a 37 ° C. La barra de escala representa 20 micras.
A continuación pretendemos profundizar en la mitocondria como fuente intracelular de ROS inducida por LPS. Un estudio anterior de Dickenson et al demostraron que peroxi-amarillo (MitoPY), una sonda fluorescente, puede utilizarse eficazmente a la imagen H
2O
2 dentro de las mitocondrias de células vivas [19]. En este sentido, MitoPY co-teñidas con MitoTracker de color rojo oscuro y luego se trataron las células SW480 con menadiona a las 8 M durante 1 hora a 37 ° C (Figura 5b) [20]. Se confirmó que MitoPY está dirigida a la mitocondria y detecta mitocondrial ROS cuando las células se trataron con menadiona. a continuación, se trataron las células con LPS SW480 y observamos niveles mínimos de ROS generados en las mitocondrias en comparación con el control positivo donde las células fueron tratadas con menadiona.
TLR-4 induce ROS regular las vías de transducción de señales en las células metastásicas SW480
la regulación de las vías de señalización celular es uno de una serie de efectos intra-celulares derivadas de TLR-4 de señalización. las vías de supervivencia individual, incluida la /vía PI3K Akt, que es conocido para facilitar la metástasis del tumor, pueden ser activados por TLR-4 de señalización. Las proteínas inhibidoras de esta vía, tales como PTEN, son conocidos por ser redox sensible. Una vez establecido que SW480 células generan ROS endógeno desde el RE en una forma dependiente de NF-kB en respuesta a la señalización TLR-4, de este modo, investigamos si LPS endógena inducida por ROS podría desempeñar un papel en la regulación de estas vías redox sensibles. Vemos un aumento en pAkt en 40 minutos tras el tratamiento LPS que se corresponde con el aumento de la actividad de ROS inducida por LPS también se observa a los 40 minutos (Figura 6 (a)). expresión pAkt en 40 minutos se inhibe por DPI (Figura 6 (b)). Estos resultados demuestran cómo TLR-4 actividad ROS inducida puede regular vías de señalización metastásicos tales como PI3K /Akt.
(a) LPS (1 mg /ml) de tratamiento produce un aumento transitorio en la fosforilación Akt, máxima a 30- 40 minutos. (B) expresión pAkt se incrementa en respuesta al tratamiento LPS en 40 minutos y completamente inhibida por DPI (2 M). * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
LPS inducido por la adhesión se facilita de una manera dependiente
Nox
Los estudios recientes han informado de que el LPS puede aumentar la adherencia células cancerosas, un paso esencial para metástasis éxito [21]. LPS facilita esto a través de la regulación de proteínas tales como β1-integrina [22]. La vía de señalización principal responsable es la vía PI3K /Akt que hemos demostrado regulada por la activación de LPS de ROS derivados de Nox. Por lo tanto hemos querido establecer si Nox señalización adherencia de las células del cáncer de colon LPS facilitado en respuesta a LPS. Un aumento significativo de la adherencia de las células SW480 al colágeno I se ve en 1 hora (Figura 7 (a, b)). Este aumento de la adhesión es inhibido por DPI y un inhibidor de PI3K, LY294002. Esto sugiere que el mecanismo responsable es dependiente de la señalización de Nox. Después de haber demostrado que el LPS induce ROS a través de un mecanismo de Nox, hemos querido investigar más a fondo qué miembro de la familia Nox fue el responsable de este incremento en la actividad de ROS y la adhesión de células tumorales. La eficacia del agente de siRNA se ensayó usando citometría de flujo. El segundo siRNA proporcionan la mejor reducción y, de hecho causado una abrogación casi completa de ROS inducida por LPS (Figura 7 (c)). Por tanto, parece Nox1 contribuye la mayoría de los ROS y tal vez tiene un papel más funcional que Nox2 en respuesta al tratamiento LPS. Western Blotting se utilizó para confirmar la eficacia de la cada transfección siRNA (Figura 7 (c)).
(a, b) tratamiento con LPS resultó en un aumento significativo en la adhesión celular SW480 al colágeno I después de 1 hora. Esto se inhibió usando un inhibidor reconocido Nox, DPI (2 M), y un inhibidor de PI3K, LY294002 (5 M). (C) Nox1 siRNA abroga inducida por LPS ROS y Nox1 caída es confirmado por Western Blot. (D) El aumento de la adhesión de células SW480 del cáncer de colon fue completamente inhibida por Nox1 siRNA. * P & lt; 0,05. Estos datos son representativos de 3 experimentos independientes.
siRNA células tratadas Nox1 luego se utilizaron para investigar el papel de Nox1 en la adhesión de células de cáncer de colon. Curiosamente, una reducción significativa de la adherencia de las células del tumor se observó en las células Nox1 siRNA después del tratamiento LPS, lo que indica que Nox1 deriva ROS son esenciales para la potenciación de la adherencia de las células del cáncer de colon en respuesta a LPS (Figura 7 (d)).
Discusión
La relación entre la inflamación sistémica y la promoción de la metástasis tumoral ha sido bien establecida [23]. En este estudio, se demuestra cómo deriva-Nox ROS proporcionar un "eslabón perdido" en la comprensión de cómo la inflamación activa las vías de transducción de señales responsables de la recurrencia del tumor y la metástasis. Este estudio demuestra que LPS regula PI3K señalización /Akt a través de ROS derivados de Nox en células de cáncer de colon. mecanismo redox En consecuencia, este activados con LPS es responsable de promover la adhesión tumoral, potenciando el riesgo de metástasis exitosa.
inflamación quirúrgica potencia la metástasis de las células tumorales a través de la señalización de PI3K /Akt. Estudios anteriores han demostrado un aumento significativo en la metástasis después de la cirugía pulmonar y este efecto es inhibida por un inhibidor de PI3K [24]. Del mismo modo, Hsu et al demostraron recientemente que la adhesión de células tumorales es dependiente de la señalización de PI3K en respuesta a LPS [11]. De hecho, LPS se ha demostrado que activar directamente la señalización de PI3K /Akt, sin embargo, como nuestros resultados muestran, derivados de Nox ROS juega un papel importante en la regulación redox de esta vía [25] - [26]. Curiosamente, los estudios anteriores han demostrado que ROS derivados de Nox se activan corriente abajo de PI3K /Akt señalización [27].