Extracto
Aplicaciones
El supresor tumoral p53 es conocido por ser inactivado con frecuencia en varios tipos de cáncer . Además, los polimorfismos de la línea germinal en
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se sabe que afectan la función de la proteína y el riesgo de influencia de desarrollar diferentes tipos de cáncer. En este estudio, se analizó la asociación de
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polimorfismo Pro72Arg con carcinoma de células escamosas de la lengua oral (SCCOT) y el esófago (CECA) en la India.
Métodos
evaluó la distribución de los
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polimorfismo Pro72Arg en ciento quince ochenta y dos pacientes SCCOT y CECA, respectivamente, con respecto a ciento diez controles sanos de la misma población. Además, se analizó la asociación del polimorfismo con varios parámetros clínico-patológicos y moleculares.
Resultados
Pro72 alelo fue significativamente enriquecido en pacientes SCCOT comparación con el grupo control sano pero tampoco alelo se enriqueció en CECA. Curiosamente, Pro72 alelo mutado preferentemente en CECA que fue confirmado por el análisis de las muestras heterocigotas para Pro72Arg.
Conclusiones
Nuestro estudio reveló la asociación de Pro72 alelo con SCCOT sugiere que el efecto de este polimorfismo en SCCOT riesgo. mutación preferencial del alelo Pro72 exclusivamente en CECA indica la necesidad de realizar más estudios para comprender el efecto específico de tejido del polimorfismo de p53
Visto:. Adduri RSR, Katamoni R, R Pandilla, Madana SN, Paripati AK, Kotapalli V, et al. (2014)
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Pro72 alelo se enriquece en Cáncer de lengua oral y frecuentemente mutado en el cáncer de esófago en la India. PLoS ONE 9 (12): e114002. doi: 10.1371 /journal.pone.0114002
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 7 Agosto, 2014; Aceptado: 31 Octubre 2014; Publicado: Diciembre 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Adduri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. MDB recibido Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR), Gob. de la India (Grant No. 5/13/129/2009-NCD-III), Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), Gob. de la India (Grant No. 27 (265) /12 /EMR-II), Departamento de Biotecnología, Gob. de la India (Grant No. BT /PR11873 /MED /30/173/2009) y una subvención del núcleo del Departamento de Biotecnología, Gob. de la India al Centro de Diagnóstico y DNA Fingerprinting (CDFD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de células escamosas de la lengua oral (SCCOT) es una forma común de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) y su incidencia está aumentando constantemente en todo el mundo [1]. El aumento de la incidencia se ha observado principalmente en pacientes más jóvenes [2], [3] en los que parece exhibir menor asociación con factores de riesgo comunes como el alcohol y el tabaco sugiere la posible susceptibilidad genética [3]. SCCOT es conocido por ser agresivo y se asocia con mayores tasas de metástasis ocultas y ganglionar en comparación con otros subtipos HNSCC [4]. A menudo se asocia con una pobre supervivencia que no ha mejorado significativamente durante las últimas cuatro décadas [5], [6]. El cáncer de esófago (CE) es el sexto y octavo cáncer más común en hombres y mujeres, respectivamente, en la India (http://www.icmr.nic.in/ncrp/report_pop_2001-04/cancer_p_based.htm). Escamosas (CECA; se produce por lo general en proximal y el esófago medio) y adeno (EAC; se produce principalmente en el esófago distal) carcinoma son los dos subtipos principales de la CE [7]. A pesar de la CECA era más común hace unas décadas, un rápido aumento de la CAO se ha observado desde la década de 1980 en Occidente [8], en paralelo con una mayor incidencia de enfermedades gastrointestinales reflejo (ERGE). ERGE causa una condición patológica inflamación inducida llamado "esófago de Barrett, que predispone a EAC [9]. Sin embargo, una tendencia similar en el aumento de la ERGE se ha observado en los países de Asia en las últimas décadas, la CECA sigue siendo el predominante subtipo CE [10], lo que sugiere la posibilidad de papel de los factores genéticos. Debido a su ubicación cercana al cuello y similitudes en las vías de tumorigénesis, la CECA se clasifica a veces con CECC.
inactivación somática de
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es un evento frecuente en la mayoría de los cánceres mientras que las aberraciones de la línea germinal se asocian con Li-Fraumeni [11], un síndrome de predisposición al cáncer hereditario. modos comunes de inactivación de p53 son mutaciones puntuales, pérdida alélica [12] y la inactivación mediada por proteínas oncoviral [13]. Además, numerosos polimorfismos se producen en
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de los cuales se sugieren unos pocos a perturbar la función de las proteínas y puede influir en la susceptibilidad al cáncer [14]. Entre estos, el codón 72 Pro /Arg polimorfismo (rs1042522) es el más común y bien estudiado. Los dos alelos p53 codon72 codifican prolina (Pro72) o arginina (Arg72), situado en una región de poliprolina presente entre la transactivación y los dominios de unión de ADN y pueden afectar a la estructura del dominio SH3 putativo de unión a [15]. El alelo Pro72 se sabe que está asociada con la enfermedad de las arterias coronarias [16], el aumento de la susceptibilidad a la endometriosis [17], el ángulo de glaucoma primario abierto [18], el lupus eritematoso sistémico (especialmente en los asiáticos) [19] y la colitis ulcerosa [20], mientras el alelo Arg72 se asocia con la progresión de la nefropatía diabética [21]. Más importante aún, las exposiciones que varían polimorfismo asociación con el riesgo [22], [23], la supervivencia [24], [25], y la respuesta al tratamiento [25] en varios tipos de cáncer en diferentes poblaciones.
En el estudio actual , se evaluó la frecuencia de Pro72Arg polimorfismo en SCCOT y la CECA. Pro72 alelo parece estar asociado de forma significativa con SCCOT mientras que no se detectó ninguna asociación con cualquier alelo en CECA. Sin embargo, en CECA,
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ADN mutaciones del dominio de unión ocurrió a una frecuencia significativamente mayor en el alelo Pro72.
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes y control
ciento quince ochenta y dos muestras SCCOT y CECA no tratados previamente y resecado quirúrgicamente, respectivamente, fueron recogidos durante el período de 2007 a 2013, desde tres hospitales en Hyderabad, India, después del consentimiento informado. Setenta y dos y setenta y cinco pacientes SCCOT y CECA fueron, respectivamente, de nuestros estudios anteriores [26], [27]. detalles clínico-patológicas de los pacientes se presentan en la Tabla S1. La mediana de edad y la razón hombre-mujer fueron de 49 y 50; y 1,94 y 1 para SCCOT y la CECA, respectivamente. Se recogió sangre periférica de ciento diez años de edad y de género de cáncer emparejado individuos sanos libres que pertenecen a la misma región geográfica.
Ética declaración
El estudio fue aprobado por los comités de ética de los hospitales de Apolo (14 /05/2005), Instituto de Oncología y MNJ Centro regional del cáncer (23/09/2006 y 20/10/2008) e indo-estadounidense Cancer Institute y Centro de Investigación (08/08/2007), así como la bioética institucionales comité de Centro de Diagnóstico y DNA Fingerprinting (CDFD) (20/12/2009) de acuerdo con la declaración de Helsinki modificado 2005. se recogieron todas las muestras tras el consentimiento informado por escrito.
Genotipado
ADN fue aislado de histológicamente confirmado el tejido normal adyacente al tumor para cada muestra como se detalla en el Documento S1. Genotipado de codón 72 se realizó con un enfoque de dos vías incluyendo PCR-RFLP (Figura 1) [28] y el alelo específico PCR (Figura 1) [29] como se ha descrito anteriormente. Los resultados se confirmaron de forma independiente en veinte y quince SCCOT y CECA muestras, respectivamente, utilizando secuenciación de Sanger bidireccional en un analizador genético 3100 (ABI Inc., Foster City, CA, EE.UU.) (Figura 1B). Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla S2.
Panel A, el análisis de PCR-RFLP confirmada por PCR alelo específica realizó como se describe en la sección de materiales y métodos. M, escalera de ADN de 50 pb; 1, Pro /Pro; 2, Pro /Arg; 3, Arg /Arg; y C, control sin molde. El panel B, la secuenciación de Sanger. Pro /Pro (izquierda), Pro /Arg (medio) y Arg /Arg (derecha).
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la detección de mutaciones
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detección de mutaciones se realizó como se describe anteriormente [26]. Para identificar si el Pro72 o el alelo Arg72 albergaba la mutación de p53 en muestras de heterocigotos para el polimorfismo Pro72Arg, un largo amplicón (~2700 pb) que abarca los exones 4-8 de
TP53 gratis (que incluye el codón 72, así como la región que codifica el dominio de unión a ADN) se amplificó (Primer pares Arg
+ y Exon 8R, Tabla S2) a partir de ADN genómico y se clonó en el vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los plásmidos recombinantes fueron seleccionados para la mutación, así como para el polimorfismo del codón 72 mediante secuenciación de Sanger bidireccional.
El análisis molecular
Estado de p53 estabilización nuclear,
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mutación (sólo para SCCOT), EGFR más de expresión, la inestabilidad de microsatélites, β-catenina estado de localización nuclear (sólo para la CECA), la infección por VPH y LOH y las variables clínico-patológicas, como la edad, sexo, tabaquismo, consumo de alcohol, el grado y el estadio patológico se registraron en nuestra Los estudios anteriores [26], [27].
El análisis estadístico
La desviación de Hardy-Weinberg para la frecuencia del genotipo de casos y controles, se analizaron mediante χ
2 test. Odds ratio y los intervalos de confianza del 95% para el riesgo de enfermedad se calcularon. Dominante, codominante, recesivo, aditivo sobre modelos de herencia dominante y de registro se probaron para determinar si el SNP se asoció con la enfermedad. Akaike (AIC) y bayesiano (BIC) el criterio de información, además de χ
2 valores de p se utiliza para seleccionar el mejor modelo de herencia. Asociación entre diferentes genotipos y las variables clínico-patológicas se evaluó mediante χ
2 o la prueba exacta de Fisher, según corresponda.
Resultados
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Pro72 alelo se enriquece en SCCOT pero no en CECA pacientes
Se analizó la distribución de p53 codon 72 genotipos en SCCOT y la CECA con respecto a los controles sanos (Figura 1) como se describe en la sección de materiales y métodos. 26 (23,6%), 53 (48,2%) y 31 (28,2%) muestras de control albergado Pro /Pro, Pro /Arg y Arg /Arg genotipos, respectivamente, exhibiendo por ello no enriquecimiento significativo de un alelo sobre el otro (Tabla 1) . Sin embargo, Pro72 alelo parecía estar enriquecido significativamente en SCCOT comparación con los controles (Tabla 1), mientras que no se observó enriquecimiento significativo en CECA (Tabla 1). Las distribuciones de genotipo de muestras SCCOT y CECA, así como controles no fueron evitando de Hardy-Weinberg (Tabla 1). Co-dominante, recesivo y log-aditivo modelos genéticos se constate que es adecuada para la herencia de SCCOT para este SNP (Tabla S3 A). Sin embargo, el valor más bajo de la AIC (310.7) y BIC (317) para el modelo recesivo indica que era el mejor modelo (Tabla S3A). Por el contrario, la CECA no mostró asociación con cualquier modelo genético (Tabla S3 B) como se esperaba. Ninguno de varias variables molecular y clínico-patológicas exhibió asociación significativa con el codón 72 en la frecuencia de los alelos SCCOT y la CECA (Tabla S1).
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mutaciones se observan exclusivamente en tumores con CECA p53 nuclear estabilización
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estado de la mutación se informó anteriormente para todas las muestras SCCOT analizados en el estudio anterior [26]; mutaciones se asocian con la enfermedad pobre supervivencia específica de [26], pero no con varios parámetros clínico-patológicos enumerados en la sección de materiales y métodos. Se examinaron muestras de CECA para las mutaciones somáticas en los exones 5-8 de
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que codifican el dominio de unión a ADN y se sabe que alberga la mayoría de cáncer asociado mutaciones [30]. No se detectaron mutaciones en veintinueve de cuarenta y cinco muestras que exhiben la estabilización nuclear y ninguno de treinta y siete muestras que no lo hicieron, lo que sugiere que la ausencia de la estabilización nuclear puede ser un indicador fiable de la ausencia de
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ADN mutación dominio de unión en CECA . Se identificaron un total de veintisiete (missense diecinueve, tres y cinco disparate indeles) mutaciones (todos los heterocigotos). Dos mutaciones (c.610G & gt; T. (P.E204X) y c.566delC (p P190Lfs * 57)) fueron detectados en dos muestras de cada uno (Tabla S4). Se identificaron tres nuevas mutaciones somáticas
a saber.
, C.621_639del19, c.454_466dupCCGCCCGGCACCC y c.428_432delTGCAG + 440delG (Tabla S4). Descripción detallada de las nuevas mutaciones se da en el documento S2. Las mutaciones en la CECA no se asociaron con ninguna de las variables clínico-patológicas analizadas (Tabla S5). Proporción de transiciones y transversiones (Figura S1A), así como del marco de lectura, sin sentido y mutaciones sin sentido (Figura S1B) fueron similares a los informes anteriores para la CECA según la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC)
base de datos de TP53
[ ,,,0],15]. Curiosamente, la proporción de las supresiones fue mayor que el reportado en el
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base de datos (Figura S1B). G: C & gt; A: T transiciones constituyen la principal
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tipo de mutación (9/29; 34,48%) en muestras CECA en este estudio similar a la base de datos [15]. Sin embargo, la frecuencia de C & gt; T transiciones en dinucleótidos CpG fue menor (10,34%), mientras que la frecuencia de deleciones (5/29; 17,24%) fue mayor que la reportada en la base de datos [15]
Pro72 alelo albergaba la inactivación. mutaciones frecuentes en CECA
mutaciones de unión de ADN P53 no se asociaron con el codón 72 en el genotipo SCCOT (p = 0,917) (Tabla 2). Por el contrario, las muestras CECA con Pro /Pro; genotipo (10/20 50%) tenían más probabilidades de albergar la mutación de las muestras con Arg /Arg genotipo (5/16; 31,3%) (p = 0,289) (Tabla 2). Por lo tanto se procedió a determinar si se Pro72 alelo mutado con mayor frecuencia mediante el análisis de muestras de heterocigotos para el polimorfismo Pro72Arg. Un único producto de PCR que incluye la mutación, así como el polimorfismo se generó y se clonó en un vector plásmido adecuado y se secuenció para determinar si la mutación estaba presente en el Pro72 o el alelo Arg72. Como se muestra en la Figura 2, la mutación se localiza preferentemente en el alelo Pro72 (p = 0,0001) (Tabla 2), apoyando así el resultado obtenido para muestras de homocigotos para el codón 72 y que nos permite comparar Pro72Arg polimorfismo y el estado de mutación de p53 para todos 75 CECA muestras que revelaron que la mutación se asoció significativamente con Pro72 alelo (p = 0,0018) (Tabla 2).
electroforetogramas se muestran mostrando mutación (izquierda) y el polimorfismo del codón 72 (derecha) para cada una de las catorce muestras. Ubicación de las mutaciones sin sentido y supresión se indican con flechas y bares, respectivamente. Prolina (CCC) o arginina (CGC) codones se indican mediante una barra.
Curiosamente, las mutaciones esperadas para causar el truncamiento de p53 (y sin sentido de desplazamiento de marco) se identificaron exclusivamente en el alelo Pro72 (8 /8, 100%) en las muestras de CECA. Sin embargo, una deleción y una mutación compleja (de un total de seis mutaciones) se identificaron en el alelo Arg72, ambos no se esperaba para alterar el marco de lectura y por lo tanto no puede causar el truncamiento de proteínas. Sólo 16,67% de
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mutaciones en SCCOT [26] (en comparación con 27,59% en CECA) se espera que resulte en el truncamiento p53, lo que sugiere aún más las diferencias en la biología de SCCOT y CECA con respecto a la función de p53.
Discusión
Varios estudios llevados a cabo en mezcla de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) muestras no detectaron ninguna asociación significativa con
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polimorfismo del codón 72 [31] - [ ,,,0],33] tal vez debido a la heterogeneidad de los subtipos de tumores. Los estudios sobre tumores de sitio HNSCC específica y /o subtipo molecular sin embargo revelaron asociación con el polimorfismo en diferentes grupos étnicos [34] - [37]. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio de casos y controles específicos contraídos para encontrar la asociación entre el
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polimorfismo Pro72Arg y SCCOT. Hay informes contradictorios sobre la asociación de Pro72Arg polimorfismo con el riesgo de la CECA con estudios que informan asociación significativa con Pro72 [22], [23], [38], [39], Arg72 [40] o no [41], [42]. Curiosamente, el efecto puede variar dentro de la misma población [22], [40]. Nuestro análisis reveló que Pro72 alelo se asoció significativamente con SCCOT pero no con CECA, quizás reflejando diferencias en la biología de la CECA y SCCOT entre los indios. Es de destacar que un estudio reciente sugiere una diferencia significativa en la función de p53 entre Arg72 y el alelo Pro72. Sin embargo esta diferencia fue específica de tejido [43]. También se sugirió que Pro72 alelo podría ser más eficiente en la causa de la detención del ciclo celular [44] mientras que Arg72 alelo ha demostrado ser más eficaz en la inducción de apoptosis y la localización a la mitocondria [45]. Aunque se ha demostrado que Arg72 alelo podría estar dirigida de manera más eficiente por la proteína E6 del VPH [29], no detectamos ninguna asociación significativa en este estudio.
ausencia Similar a nuestros resultados, también se informó de otro estudio de la India de
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mutaciones en tumores CECA sin estabilización nuclear [46], a diferencia de los informes de otros países (54-55) indicando quizás una característica asociada exclusivamente con la población indígena. Además, la CECA
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espectro de mutaciones somáticas detectada en este estudio es similar a las observaciones hechas anteriormente de la India [47]. Baja proporción de G: C & gt; A: T transiciones en dinucleótidos CpG (atribuidas a la desaminación espontánea de la citosina) identificados en muestras CECA en este estudio está en consonancia con estudios previos de la India [47]. Mayor frecuencia de G: C & gt; A: T transiciones en los sitios CpG no se pueden atribuir a los agentes en los alimentos y el medio ambiente [48] alquilante. Es de destacar que se conocen nitrosaminas en las bebidas alcohólicas [49] y carne procesada [50] para aumentar el riesgo de esófago y cáncer de estómago, respectivamente. Los estudios CECA procedentes de Irán [51], así como el sur de Brasil [52] informaron de una asociación de hábito de beber té caliente con G: C & gt; A:. T transiciones
A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el Sólo el estudio para evaluar el estado de
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mutación en heterocigotos Pro /Arg, que se espera que proporcione información más precisa sobre el alcance de la asociación, ya que ambos alelos están presentes en los mismos antecedentes genéticos. Hemos observado que las mutaciones del dominio de unión al ADN de p53 se detectaron principalmente en Pro72 alelo (en comparación con el alelo Arg72) en CECA mientras que ni el alelo mutado preferentemente en SCCOT. Varios estudios sobre diversos tipos de cáncer informaron posible asociación de la mutación de dominio con Arg72 alelo [53] de unión al ADN de p53 [54], mientras que unos pocos informaron de lo contrario [24], [55]. Tal vez, la asociación puede variar de acuerdo con el origen étnico [24]. p53 mutado Arg72 se sugiere a ser más eficaz en comparación con Pro72 p53 en la unión y la inactivación de p73, un homólogo de p53 que puede transactivar p53 objetivos [56]. Además, los estudios anteriores también mostraron que mutado alelo Pro72 puede tener mayor potencial para inactivar p53 en sí [57]. Es de destacar que la CECA exhibe inactivación frecuente de p73 a través de la pérdida de heterocigosidad [58], con lo que quizás explique la mayor frecuencia de mutación en Pro72 alelo que causa la inactivación de p53.
Curiosamente, se observó la proteína truncando mutaciones asociadas exclusivamente con el Pro72 alelo en CECA. De nota, se espera que las mutaciones de truncamiento de abrogar completamente la función de p53, mientras que las mutaciones sin sentido se puede esperar que retienen la actividad parcial /alterada. Además, a diferencia de la mutación de truncamiento, las mutaciones de sentido erróneo en el dominio de unión al ADN de p53 pueden alterar la capacidad de p53 para unirse a genes de ADN y de destino transactivate pero pueden no afectar a las funciones de p53 exclusivos para otros dominios de la proteína [59]. Por lo tanto la inactivación completa de Pro72 podría ser más tumorigénico de Arg72 en CECA.
Conclusión
Este estudio ha revelado efecto de
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Pro72 alelo en el aumento del riesgo de SCCOT y sugirió que SCCOT puede tener diferencia biológica con otras formas de HNSCC. Una característica única de este estudio fue determinar la condición de mutación en muestras de heterocigotos para el polimorfismo de p53 Pro72Arg, lo que nos permitió concluir que Pro72 alelo mutado fue hecho preferentemente en CECA. Nuestros resultados apoyan las observaciones previos que sugieren un comportamiento diferente de los alelos p53 Pro72Arg en diferentes tipos de cáncer y grupos étnicos y sugieren función molecular distinta de Arg72 p53 y p53 Pro72 con respecto a la mutación asociada, en CECA. Otros estudios sobre otros tipos de cáncer deben llevarse a cabo para analizar la asociación del polimorfismo y mutación. Nuestros resultados se pueden extender a analizar el efecto del polimorfismo y mutación en la supervivencia y la respuesta a la quimioterapia /radioterapias paciente. Los estudios moleculares y funcionales de p53 mutante en Pro72 y fondo Arg72 podrían posiblemente dilucidar la actividad diferencial de p53. Por último, para dilucidar el efecto del polimorfismo en la mutación, los estudios con modelos animales pueden ayudar a comprender el papel de este polimorfismo en la tumorigénesis.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Análisis comparativo de la distribución de la CECA
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mutaciones en la India con la IARC
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base de datos a nivel de nucleótidos (Panel A), nivel del ADN (panel B) y el nivel de proteína (Grupo C ). Sin clasificación mutaciones silenciosas y reportados en la base de datos se omitieron de este análisis. La mutación p.V143_W146delinAV no se incluyó en el análisis (en el Panel C) debido a la complejidad de su efecto en el nivel de proteína
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114002.s001 gratis (EPS) sobre Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s002 gratis (DOCX)
Tabla S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s003 gratis (DOC) sobre Table S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s004 gratis (DOCX) sobre Table S4.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s005 gratis (DOC) sobre Table S5.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s006 gratis (DOCX)
documento S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s007 gratis (DOCX)
Documento S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0114002.s008 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Mukta Srinivasulu, del Instituto de Oncología MNJ & amp; Centro Regional del Cáncer, Hyderabad, el Dr. MohanaVamsy Chigurupati, los Dres. Sujith Patnaik, Subramanyeshwar Rao y NarasimhaRaju Kalidindi del Indo-Americana del Cáncer del Hospital & amp; Instituto de Investigación, Hyderabad, los Dres. Swarnalata Gowrishankar y Umanath K Nayak de los hospitales de Apolo, Hyderabad, por su ayuda en la recogida de muestras. Agradecemos al Dr. Kumarasamy Thangaraj, Centro para Celular & amp; Biología Molecular, Hyderabad, para la recolección de muestras de ADN de individuos sanos. PERE y RP se registran los estudiantes de doctorado de la Universidad de Manipal, Karnataka, India y la Universidad de Hyderabad, respectivamente. PERE y RP están agradecidos a la Comisión de Subvenciones Universidad (UGC), Gob. de la India y el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR), Gob. de la India, respectivamente, para las becas de investigación junior y senior.