Extracto
Los informes recientes han indicado que
KRAS
y
TP53
mutaciones predecir la respuesta a la terapia en el cáncer colorrectal. Sin embargo, poco se sabe acerca de la relación entre estas dos alteraciones genéticas comunes. Micro-ARN (miARN), una clase de ARN no codificante implicado en procesos celulares, han sido cada vez más vinculado a
KRAS
y
TP53
. La hipótesis de que letal-7a (let-7a) miARN regula
KRAS
través de
TP53
. Para investigar la relación entre el
KRAS, TP53
, y let-7a, hemos utilizado HCT116
KRAS
mut
células de cáncer colorrectal humano con cuatro modificaciones genotípicas diferentes en
TP53
(
TP53
- /-, TP53
+/-, TP53
mut /+, España y
TP53
mut /-
). El uso de estas células se observó que la actividad de K-Ras fue mayor en las células con el mutante o caída de un
TP53
alelos, lo que sugiere que de tipo salvaje
TP53
puede suprimir la actividad de K-Ras. Let-7a estaba presente en HCT116
KRAS
mut
células, aunque no hubo correlación entre el nivel de let-7a y
TP53
estado genotipo. Para explorar cómo let-7a puede regular K-Ras en los diferentes
TP53
células genotipo que utilizamos inhibidor-7a dejar que demostró una mayor actividad y K-Ras en todos los
TP53
, lo cual corrobora informes anteriores que vamos-7a regula K-Ras. Para evaluar las posibles implicaciones clínicas de esta red de regulación, se analizó la influencia de
TP53
genotipo y let-7a inhibición sobre la supervivencia de células de cáncer de colon después de la quimiorradioterapia (CRT). Hemos observado que las células con pérdida completa de tipo salvaje
TP53
alelos (
- /- o
- /mut) eran resistentes a la TRC después del tratamiento con 5-fluorouracilo y radiación. El aumento adicional en la actividad de K-Ras con la inhibición let-7a no afectó la supervivencia de estas células. En contraste, las células de tipo salvaje simple o doble
TP53
alelos fueron moderadamente sensibles a la CRT y la resistencia exhiben cuando se inhibió let-7a. En resumen, nuestros resultados muestran un sistema regulador complejo que implica
TP53
,
KRAS
, y let-7a. Nuestros resultados pueden proporcionar pistas para comprender y orientar estas interacciones en el cáncer colorrectal
Visto:. Luu C, Heinrich EL, Duldulao M, Arrington AK, Fakih M, García-Aguilar J, et al. (2013)
TP53 Restaurant and Let-7a micro-ARN Regular K-Ras actividad en las células HCT116 cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (8): e70604. doi: 10.1371 /journal.pone.0070604
Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia |
Recibido: Marzo 4, 2013; Aceptado: 21 de junio de 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Luu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la 4
º cáncer más común y la 2
ª causa más común de muerte por cáncer en los EE.UU. [1]. Los avances recientes han mejorado los resultados en el CCR han incluido la identificación de biomarcadores moleculares pronósticos y predictivos precisos [2] - [4]. Estos han incluido alteraciones genéticas en
KRAS
y
TP53
, que se detecta con frecuencia en pacientes con CCR.
KRAS
mutaciones están presentes en aproximadamente 30-50% de CRC, sino también en 17 a 25% de todos los tumores humanos [2], [5] - [7]. Del mismo modo,
TP53
alteraciones son comunes en pacientes con CCR (casi el 50%) [8]. Ambas funciones pronósticos y predictivos se han identificado para ambos genes [9]. Nuestro propio grupo y otros han demostrado recientemente que la detección de los concurrentes
KRAS
y
TP53 mutaciones
, con una incidencia del 5% al 20% en pacientes con CRC, en correlación con la resistencia a La quimiorradioterapia neoadyuvante ( CRT) en pacientes con cáncer rectal [10] - [12]. A pesar de la frecuencia de estas mutaciones en el CCR, poco se sabe acerca de las interacciones entre los dos genes.
El vínculo entre estos dos genes alterados con frecuencia en el CCR puede estar en micro-ARN (miARN), una clase de no ARN que funciona en la regulación transcripcional y más específicamente puede influir en la regulación de la proliferación celular y la apoptosis [13], [14] de codificación. Los informes recientes han sugerido que la actividad supresora de tumores de miARN 7a letal (let-7a) puede ser debido a su asociación con
KRAS
y que la inhibición del crecimiento del tumor puede ocurrir por la supresión de la expresión de K-Ras por let- 7a [15], [16]. Emergentes datos clínicos sugieren que la expresión intra-tumor let-7a se correlaciona con la respuesta tumoral y la supervivencia global en pacientes con cáncer colorrectal metastásico que reciben factor de crecimiento epidérmico (EGFR) agentes de direccionamiento en ambos
KRAS
de tipo salvaje y de los mutantes [17 ]. Estudios adicionales han especulado que el papel de
TP53 Hoteles en la reparación del ADN y la apoptosis puede en parte ser regulada por miRNAs, incluyendo let-7a [18], [19]. Por lo tanto, una red de regulación compleja para
TP53
y
KRAS
puede estar vinculado por let-7a.
Para investigar las posibles interacciones entre los
TP53
,
KRAS
, y let-7a, se analizó una familia única de líneas celulares de cáncer colorrectal con mutante
KRAS Opiniones y modificaciones en
TP53
genotipo. Estas células nos permitió examinar los cambios en la expresión y la actividad de K-Ras que se correspondían con las variaciones en
TP53
genotipo. Por otra parte, hemos sido capaces de interrogar mejor el papel de let-7a en la fijación de mutante
KRAS Opiniones y diversas
TP53
genotipos. Nuestros resultados indican nuevos aumentos en la actividad de K-Ras con diferentes
TP53
genotipos. Sin embargo, no hemos encontrado una clara relación entre el nivel de let-7a y
TP53
genotipo. No obstante, los cambios en la actividad de K-Ras fueron regulados por let-7a. Este primer informe de
TP53 Restaurant and let-7a regulación de la actividad de K-Ras proporciona pistas para comprender mejor la compleja interacción entre los
TP53
y
KRAS
.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
La línea celular humana CRC HCT116, que alberga un único mutante
KRAS
alelo y el doble de tipo salvaje
TP53
(
TP53
+ /+
) alelos, se modificó en cuatro líneas celulares estables con diferentes
TP53
genotipos (
TP53
- /-, TP53
+/-, TP53
mut /+, España y
TP53
mut /-
). La líneas celulares modificadas de los padres y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Bert Vogelstein (Universidad de Johns Hopkins, Baltimore, MD) [20]. Los alelos mutantes y knockout fueron ambos utilizados para evaluar las diferencias potenciales entre los dos alelos, como se sugiere en informes anteriores [21]. Todas las líneas celulares se evaluaron mediante la extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la secuencia para
KRAS
y
TP53
mutaciones genéticas para verificar genotipos. Las células se mantuvieron en medio McCoy 5A (Irvine Scientific; Santa Ana, CA) con suero bovino fetal 10% (Omega Scientific; Tarzana, CA) y 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (Invitrogen; Carlsbad, CA) a 5% de CO
2 a 37 ° C
inmunotransferencia
Los lisados celulares se recogieron usando tampón RIPA. (Invitrogen, Carlsbad, CA), además de inhibidores de la proteasa (Thermo Scientific, Rockford, IL). Veinte microgramos de proteína se separaron en 12% de geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore; Bedford, MA). Las membranas se bloquearon durante 1 h con leche en polvo no grasa 5% y se sondaron durante la noche con anticuerpos primarios. Después del lavado, las membranas se marcaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (BioRad; Hercules, CA). Las membranas fueron desarrolladas utilizando un sustrato quimioluminiscente (Amersham Pharmacia; Piscataway, NJ) y la imagen. Los anticuerpos utilizados fueron: anti-K-Ras (Millipore) y anti-GAPDH (Señalización Celular, Danvers, MA)
K-Ras Actividad
actividad
K-Ras se midió utilizando las Ras. activación Ensayo ELISA Kit (Millipore). En breve, los lisados celulares se incubaron con Raf-1 Ras dominio de unión -agarosa (RBD). Raf-1-RBD se utilizó para capturar la proteína K-Ras unida a GTP activo, que después se detecta mediante la adición de un anti-K-Ras-anticuerpo (Millipore). Después se añadió un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Un luminómetro fue usado para medir las señales después de la adición de un reactivo quimioluminiscente (Perkin-Elmer; Shelton, CT). Dado que se realizaron ensayos para evaluar los cambios relativos en la actividad de K-Ras entre los diferentes
TP53
genotipos, la actividad de K-Ras de la de los padres
TP53
+ /+ se estableció como línea de 1. Para los ensayos con inhibidor de let-7a, cada genotipo actuó como su propio control. Tres ensayos independientes se realizaron para cada línea celular, y la absorbancia ± la desviación estándar (SD) se representó significan para cada línea.
transcripción inversa
RT-PCR se realizó utilizando el Taqman ® ensayo miRNA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. En pocas palabras, la transcripción inversa se realizó usando los reactivos proporcionados Multiscribe RT ™ Master Mix además lisados celulares y los cebadores específicos let-7a (Invitrogen). Las reacciones se realizaron en un ciclador térmico a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, y 85 ° C durante 5 min.
Time-PCR real
RT-PCR se realizado utilizando las células Taqman® miARN a Kit CT ™ (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió el producto de RT para el cóctel de PCR (reactivo de ensayo Taqman® miRNA más proporcionado mezcla maestra Taqman®) y las reacciones de RT-PCR se realizaron a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C en el Applied Biosystems 7500 rápido sistema de RT-PCR (Foster City, CA). Cada muestra se ensayó por triplicado
Let-7a Inhibidor
Let-7a fue inhibida por los inhibidores miRIDIAN miARN (Dharmacon; Lafeyette, CO). Siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HCT116 (3 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche. Después se transfectaron con 100 nM de inhibidor miRIDIAN miARN para 24 h. Las células fueron incubadas por un período adicional de 48 h antes de ser utilizado en ensayos.
quimiorradioterapia
HCT116 células fueron tratadas con CRT de acuerdo con un protocolo establecido [22]. Después de un total de 72 h de incubación con el inhibidor de let-7a, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se trataron entonces con 4 nM 5-fluorouracilo (5-FU) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO) durante 16 h tras lo cual fueron expuestos a 4 Gy de radiación. La exposición al fármaco se detuvo 6 horas después del tratamiento de radiación por medio de intercambio. Las células que no habían sido tratados con inhibidor de let-7a fueron tratados de manera similar con CRT
Determinación de la viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo basado en ATP (Cell Titer-Glo;. Promega ; Madison, WI) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HCT116 (5 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Se añadió reactivo de células Titulación-Glo y la lisis celular inducida. La luminiscencia se registró con un luminómetro. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la viabilidad promedio, como un porcentaje de la viabilidad de las células no tratadas
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo en el software de Microsoft Excel. (Microsoft; Redmond, WA). Cada punto de datos representa el valor medio de tres experimentos independientes. Las condiciones de control y de tratamiento se compararon mediante la prueba t de Student y las diferencias entre las líneas de células se compararon por análisis de varianza (ANOVA). valor de p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
K-Ras concentraciones de proteína no depende de
TP53 Mutación
Estado
Para determinar el efecto de diferentes
TP53
genotipos sobre la expresión de K-Ras, ensayo de western blot se realizó para comparar los niveles de proteína. Nuestros resultados muestran que los niveles de expresión del gen KRAS no fueron influenciados por los diferentes
TP53
genotipos (Figura 1A) que sugieren que
TP53
no regula la expresión de la proteína K-Ras.
a) células HCT116 con las variaciones observadas en
TP53
se recogieron y se lisaron por Western Blot para la expresión de K-Ras estado de la mutación. GAPDH se utilizó como control de carga. B) Actividad K-Ras se midió en todas las líneas celulares utilizando un ensayo ELISA desplegable Raf. Los resultados mostrados representan la media de 3 experimentos independientes realizados por triplicado con respecto a
TP53
+ /+ células, p & lt; 0,05. Las barras de error muestran la desviación estándar (DE).
Efecto de
TP53
estado de la mutación sobre el K-Ras Actividad
El efecto de
TP53
genotipo sobre la actividad de K-Ras se midió usando un ensayo de pull-down Raf. Descubrimos que la actividad de K-Ras fue más bajo en
TP53
+ /+
células. El aumento de la actividad de K-Ras fue más pronunciada en
TP53
mut /-, seguido por
TP53
- /-, España TP53
+ /mut, y TP53
- /+ (44%, 32%, 20%, y 10% de incremento, respectivamente, p & lt; 0,05) (Figura 1B). Estos resultados muestran que la actividad de K-Ras fue menor en las células de tipo salvaje
TP53
alelos; y los niveles más altos fueron identificados en las células con la pérdida homocigótica del tipo salvaje TP53 alelos.
Let-7a se expresa en todas las líneas HCT116
Let-7a expresión en líneas celulares HCT116 se midió por qPCR. expresión let-7a se detectó en todas las líneas celulares (Figura 2A). No hubo un patrón de cambio en los niveles de let-7a que correspondía a alteraciones en
TP53
genotipo.
A) expresión let-7a se midió a través de QRT-PCR. Los datos mostrados representan un solo QRT-PCR realizó por triplicado. B) Las células se transfectaron con 100 nM de inhibidor de let-7a para 24 h. Proteínas para el control y para las células inhibidas let-7a se recogieron de inmunotransferencia para la expresión de K-Ras. GAPDH sirvió como control de carga
Let-7a no regula los valores de proteína K-Ras
Let-7a se inhibió la expresión génica & gt;. 90% por qPCR. los niveles de proteína K-Ras se evaluaron a través de los
TP53
genotipos en la presencia o ausencia de let-7 inhibición. los niveles de proteína K-Ras no se alteraron por la inhibición let-7a (Figura 2B).
let-7a regula negativamente K-Ras Actividad
El efecto de la inhibición let-7a sobre el K-Ras también se determinó la actividad. Con la inhibición let-7a, la actividad de K-Ras aumentado en todos los
TP53
genotipos (Figura 3). Se encontró que la actividad de K-Ras se incrementó en 50% a 112% en comparación con let-7a células que expresan (p & lt; 0,05). El porcentaje de aumento en la actividad de K-Ras en todas las líneas celulares no estaba claramente asociado con
TP53
genotipo y si knockout mutantes o alelos estaban presentes.
Se recogieron lisados celulares después de 72 h de incubación y se sometieron a un ensayo de Raf-desplegable que mide la actividad de K-Ras. Los datos mostrados representan tres experimentos realizados por triplicado. Las barras de error muestran SD. * P & lt;. 0,05
Las células de tipo salvaje
TP53
Los alelos son sensibles a la inhibición de la CRT y let-7a reduce la respuesta a la TRC
Las células que albergan diferentes
TP53
genotipos fueron tratados con TRC y la viabilidad celular se midió (Figura 4). Las células que carecen de cualquier TP53 de tipo salvaje
alelo fueron resistentes a la TRC, mientras que las células que albergan un solo tipo salvaje
TP53
alelo exhibió aproximadamente el 50% de muerte celular. tratamiento CRT se realizó de nuevo con let-7a inhibición, que disminuyó la muerte celular inducida por CRT en casi un 20% en las células que alberga al menos una de tipo salvaje
TP53
alelo (p & lt; 0,05). Las células con pérdida homocigotos de tipo salvaje
TP53
alelos (
- /- y
mut /-), lo que se correlaciona con la actividad más alta de K-Ras (véase la Figura 1B), exhibió ningún cambio en la viabilidad celular, independientemente de los cambios en los niveles de expresión let-7a.
Las células con diferentes
TP53
estado +/- let-7a inhibidor fueron tratados con 5-FU seguida de radiación. se midió la viabilidad celular. Los datos mostrados representan la viabilidad media como porcentaje de células no tratadas. * P & lt; 0,05, ** p & gt;. 0,05
Discusión
KRAS
y
¿Cuáles son TP53 mutaciones somáticas comunes con predictivo y pronóstico valor en pacientes con CCR. La detección de seleccionar
KRAS
mutaciones se ha asociado con un mayor riesgo de recaída de la enfermedad y la muerte [23] y ha pronosticado resistencia a las terapias anti-EGFR en el CCR [9]. Del mismo modo, seleccione
TP53
alteraciones se han asociado con malos resultados en el CCR [8]. También hemos informado de que la detección simultánea de
TP53
y
KRAS
mutaciones en los pacientes que recibieron CRT neoadyuvante para el cáncer rectal predijo el fracaso de la respuesta patológica completa [10]. En esta investigación, hemos tratado de comprender mejor una posible interacción entre los dos genes. Se identificaron let-7a como un posible vínculo entre el
TP53
y
KRAS
. caracterización previa de let-7a ha revelado su papel en el control de la progresión del ciclo celular y la división en pulmón y colon humanos [24], [25]. Por otra parte, Johnson et al. [15] descubrieron que controlada negativamente
KRAS
expresión let-7 en el cáncer de pulmón. Además, Ruzzo et al. [17] informó de una mejora de la supervivencia global en pacientes con niveles elevados de let-7a dentro de un
KRAS
mutante población con cáncer colorrectal tratados con terapia anti-EGFR, lo que sugiere un papel inhibidor tumoral para let-7a en
KRAS
activadas con tumores.
TP53
ha sido conocido para regular transcripcionalmente la expresión de miRNAs [26], [27]. Por lo tanto, hemos teorizado la existencia de una serie de medidas reguladoras de
TP53
a let-7a a
KRAS
. Descubrimos que la actividad oncogénica K-Ras estaba regulado por
TP53
genotipo y let-7a; y los cambios tanto en la respuesta a la TRC. influidos
En nuestro estudio hemos utilizado células que albergan diversas CRC
TP53
genotipos. Estas células se obtuvieron a partir de una línea celular de sus padres que alberga la ganancia de función
KRAS mutación
situado en el codón 13 [28], [29]. No hay justificación para la utilización de células con nocaut y mutante
TP53
alelos en nuestro estudio. A pesar de la pérdida común de tipo salvaje
TP53
alelos, el nocaut y mutante
TP53
alelos no son iguales. Pérdida total de
alelos TP53
resultados en la correspondiente pérdida de actividad supresora de tumores, mientras que el mutante
TP53
alelos pueden expresar las proteínas p53 que pierden actividad supresora de tumores, sino también adquirir propiedades oncogénicas [21]. Sin embargo, en esta investigación hemos podido encontrar diferencias consistentes entre KO y mutante
TP53
alelos con respecto a K-Ras actividad al inicio del estudio y en respuesta a let-7a inhibición, ni en respuesta a la TRC.
Como se ha señalado anteriormente, hemos observado cambios en la actividad de K-Ras con la inhibición de la expresión let-7a. Sin embargo, no se observaron cambios correspondientes en la expresión de la proteína K-ras, que se contradice con los informes anteriores que demuestra la regulación miARN let-7 de K-Ras expresión [30], [31]. Sin embargo, nuestros resultados son consistentes con los mecanismos de regulación establecidos de miARN. De hecho, los genes miARN puede regular genes a través de una variedad de mecanismos de la traducción del ARNm a la estabilidad en el citoplasma de la actividad del ciclo celular [14], [24]. Las diferencias entre nuestros resultados y los de los informes anteriores también podría ser debido a las diferencias entre las especies o líneas celulares utilizadas. Por lo tanto, mientras que la expresión de K-Ras se mantuvo sin cambios por la inhibición let-7a, nuestros experimentos mostraron que la actividad de K-Ras se vio afectada por let-7a. Además, las células que albergan homocigotos de tipo salvaje
TP53
alelos expresan la menor actividad de K-Ras, lo que sugiere que de tipo salvaje
TP53
alelos puede suprimir la actividad de K-Ras. Por otra parte, nuestros resultados son consistentes con un informe en el cáncer de páncreas, mostrando un aumento en la actividad de K-Ras mutante cuando
KRAS
fue emparejado con el mutante
TP53
[32]. Por último, la actividad de K-Ras aumenta claramente cuando let-7a se inhibió independientemente de
TP53
genotipo, lo que sugiere una mayor regulación let-7a de la actividad de K-Ras.
La quimioterapia y la radiación son componentes importantes de la gestión multimodal de pacientes quirúrgicos con cáncer de recto; y CRT neoadyuvante se ha asociado con downstaging de la enfermedad y la disminución de la recurrencia local [33], [34]. En nuestra investigación, descubrimos que las células que carecen de tipo salvaje
TP53
alelos fueron resistentes a la TRC y no exhibió la muerte celular cuando son tratados con TRC. En contraste, las células con al menos un alelo de tipo salvaje (
TP53
+ /+, TP53
mut /+
, y
TP53
- /+) tenía aproximadamente el 50% la muerte celular cuando son tratados con TRC. Estos resultados son consistentes con los resultados de nuestros ensayos clínicos anteriores, en el que los pacientes con mutaciones dobles (
KRAS
y
TP53
) no lograron demostrar una respuesta patológica completa tras el tratamiento con CRT neoadyuvante [10]. Cuando let-7a expresión fue inhibido (que conduce a un aumento de la actividad de K-Ras), las células que carecen de tipo salvaje
TP53
alelos (
TP53
- /- Opiniones y
mut /-
) tuvieron una supervivencia celular 100%. Sin embargo, en células que albergan al menos una de tipo salvaje
TP53
alelo (anteriormente mostrando algunos la muerte celular), supervivencia celular aumentó en respuesta a let-7a inhibición. Estos resultados tienen dos implicaciones importantes: (1)
TP53
genotipo influye en la actividad de K-Ras y puede predecir la respuesta a la TRC y (2) let-7a niveles de expresión influyen en la actividad de K-Ras y pueden alterar la respuesta a la TRC.
En resumen, nos proporcionan información sobre los mecanismos potenciales que vinculan
KRAS
,
TP53
, y let-7a. Aunque dobles mutantes son relativamente raros, la condición parece tener un fenotipo deficiente con la resistencia a la TRC. Nuestros resultados contribuyen a una mejor comprensión de la conexión entre el
KRAS
y
TP53
. El conocimiento de las vías de vinculación de
KRAS
,
TP53
, y let-7a pueden proporcionar una mayor comprensión de los mecanismos que impulsan los pobres fenotipo observado en ciertas mutaciones en el CCR. Aunque reconocemos que las limitaciones de este estudio incluyen la falta de
en
in vivo de modelado
y las limitaciones de la línea de una célula, nuestra atención se centró en la investigación del potencial de la diafonía entre let 7a y p53, lo que se demuestra claramente en nuestro modelo. Es factible que esta interacción puede ser línea celular específica o puede depender de otras vías aberrantes en HCT-116 (MSI-H,
PIK3
mutante). El trabajo futuro se centrará en la investigación de los posibles mecanismos de interacción entre let-7a y p53 a través de diferentes líneas de células colorrectales y con perfiles moleculares diferentes.