Extracto
Antecedentes
A pesar de su respuesta inicial positiva a la terapia de ablación hormonal, los cánceres de próstata, invariablemente se repiten en las formas más agresivas, resistente al tratamiento. La falta de comprensión de las alteraciones genéticas subyacentes para la transición de andrógeno-dependientes (AD) para el crecimiento del cáncer de próstata ADI afecta nuestra capacidad de desarrollar estrategias terapéuticas orientado a los objetivos para el tratamiento eficaz del cáncer de próstata IDA.
Metodología /Principales conclusiones
Por selección de un banco de quinasas humanas activadas, se han identificado
TPL2
, que codifica una serina /treonina quinasa, como conducir el crecimiento del cáncer de próstata IDA. activación TPL2 por sobre-expresión, ya sea de tipo salvaje o una forma constitutivamente activada del TPL2 crecimiento inducido por ADI, mientras que la supresión de
TPL2
expresión y su actividad de la quinasa en células de cáncer de próstata ADI inhibió la proliferación celular en condiciones de andrógenos-agotado . Lo más importante,
TPL2
es upregulated en ADI cánceres de próstata, tanto de la
PTEN
supresión modelo del ratón y los especímenes clínicos de cáncer de próstata.
Conclusiones /Importancia
conjunto, estos datos sugieren que
TPL2
quinasa juega un papel crítico en la promoción de la ADI la progresión del cáncer de próstata. Por otra parte, la supresión de TPL2 disminuye el crecimiento del cáncer de próstata IDA y una alta frecuencia de TPL2 sobreexpresión en muestras de cáncer de próstata ADI humanos valida TPL2 como un objetivo para el tratamiento de esta enfermedad mortal
Visto:. Jeong JH, Bhatia A , Toth Z, Oh S, KS Inn, CP Liao, et al. (2011)
TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2)
activación Promueve andrógenos (IDA) Crecimiento de la próstata agotamiento-independiente del cáncer. PLoS ONE 6 (1): e16205. doi: 10.1371 /journal.pone.0016205
Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de génomique Fonctionnelle de Lyon, Francia |
Recibido: 7 Septiembre, 2010; Aceptado: December 8, 2010; Publicado: 18 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Jeong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado y apoyado por el Departamento de Defensa 060868 y ACS subvención GRI-58-007-48 a JHJ, NIH subvenciones CA 109147 y 136924 R01 CA al GAC, NIH subvenciones CA 59705 y CA 113392 al PRB, y CA082057, CA31363, CA115284, AI083025, DE019085, CA148616, Fundación Hastings, y la Fundación Fletcher Jones a JUJ. (Http://cdmrp.army.mil/, http://www.cancer.org/, http://www.nih.gov/, http://www.fletcherjonesfdn.org/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata afecta a 1 de cada 6 hombres estadounidenses, con más de 2 millones viven actualmente con la enfermedad. La cirugía es eficaz, con casi el 100% de los pacientes restantes libres de cáncer durante varios años si la enfermedad se detecta a tiempo y las células cancerosas están confinadas a la próstata [1]. Sin embargo, una vez que el cáncer se extiende más allá de la glándula prostática, el resultado es casi siempre fatal. Dado que las células de cáncer de próstata requieren la testosterona para alimentar su crecimiento y la supervivencia, la terapia de privación de andrógenos ha sido diseñado para detener el crecimiento del cáncer por cualquiera de detener la producción de la testosterona o la prevención de la hormona de actuar sobre las células de cáncer de próstata [2]. A pesar de la respuesta positiva inicial a la terapia hormonal, las células del cáncer de próstata, invariablemente se repiten en una forma agresiva, el agotamiento del andrógeno-independiente (IDA). Mientras alteraciones genéticas asociadas con la iniciación y la progresión del cáncer de próstata se han estudiado intensamente [3], [4], [5], [6], [7], las que subyacen la transición de la dependiente de andrógenos (AD) a ADI de próstata el crecimiento del cáncer son relativamente menos bien comprendido. Esta falta de comprensión afecta nuestra capacidad de desarrollar estrategias terapéuticas orientado a los objetivos para el tratamiento eficaz del cáncer de próstata IDA.
En la presencia de andrógenos, el receptor de andrógenos (AR) se somete a la fosforilación, la dimerización y translocación en el núcleo, en el que se une a elementos de respuesta a andrógenos (ARE) sitios, resultando en la activación transcripcional de los genes diana [8]. Sin embargo, los datos de peso, incluyendo RNAi desmontables y la introducción de los antagonistas del receptor de andrógenos (AR), indican que la AR es todavía necesario para el crecimiento del cáncer de próstata ADI [9], [10], [11]. Por lo tanto, en condiciones de andrógenos-agotado, las células de cáncer de próstata ADI parecen desarrollar estrategias intracelulares que activan la vía de señalización AR. Se han propuesto muchos mecanismos subyacentes: el aumento de
AR
expresión a través de
AR
amplificación de genes, aumento de
AR
sensibilidad través de la estabilidad mejorada y AR localización nuclear, amplió AR especificidad ligando a través de mutaciones en su dominio de unión a ligando, y el aumento de la actividad de AR a través de modificaciones post-traduccionales [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Por otra parte, la activación de otras vías de transducción de señales, tales como la activación de BCL-2, también puede pasar por alto el requisito de la activación de AR para la proliferación y supervivencia de células de cáncer de próstata [19]. Por último, una subpoblación preexistente de las células de cáncer de próstata con ADI progenitor /células madre rasgos puede llegar a ser dominante en condiciones de andrógenos empobrecido en [20].
Muchos estudios revelan que la activación de la vía RAS /RAF /MEK /ERK puede ser correlacionada con el crecimiento del cáncer de próstata ADI [5], [13], [21], [22]. Recientemente, un modelo de ratón genéticamente modificado (GEM), en el que la expresión de un potente activador de la señalización de RAS-MAPK, B-RAF
E600, está dirigido al epitelio de la próstata usando un sistema de tet-inducible, desarrolló adenocarcinoma invasivo , y esto siguió progresando a lesiones ADI indolentes después de la castración [23]. Sin embargo, intuitivamente, la activación de mutaciones en la vía RAS /RAF /MEK /ERK son poco frecuentes en los cánceres de próstata humanos, aunque los bucles de factores de crecimiento autocrinos y paracrinos parecen activar la vía [24], [25]. Es importante destacar que un estudio reciente propone que los reordenamientos cromosómicos de la quinasa RAF es una fuente adicional de MEK /ERK señalización de activación, lo que contribuye al desarrollo del cáncer de próstata y la progresión [26].
Con el fin de identificar nuevos genes relacionados con la quinasa para el crecimiento del cáncer de próstata ADI, que exhibió una biblioteca de quinasas humanos activados. A continuación, se presenta la identificación de una serina /treonina quinasa,
TPL2
, como conducir el crecimiento del cáncer de próstata IDA a través de la activación de la vía de señalización de MEK /ERK y NF-kB. Esto proporciona una pista para encontrar fuentes adicionales de MEK /ERK vía de activación de los cánceres de próstata ADI. Por otra parte, la supresión de TPL2 disminuye el crecimiento del cáncer de próstata IDA y una alta frecuencia de TPL2 sobreexpresión en muestras de cáncer de próstata ADI humanos valida TPL2 como un objetivo para el tratamiento de esta enfermedad mortal.
Resultados
La identificación de TPL2, por selección de una biblioteca de quinasas humanos activados
para identificar nuevos genes de quinasa relacionados con el crecimiento del cáncer de próstata ADI, que exhibió una biblioteca de 354 quinasas humanas activadas compone de 98 marcos de lectura abiertos relacionados quinasa ( ORFs) y 256 quinasas humanos clonados en un vector compatible gateway retroviral destino, pWN-MF-DEST, en el que se añadieron una secuencia de miristoilación y una etiqueta FLAG-epítopo (MF) a la N-terminales de cada ORF introducido [27] . Como una lectura de la pantalla, se utilizó una construcción de reporte que contiene el
cis-regulador
región promotora (5,8 kb que contiene un
AR
potenciador) del antígeno prostático específico (
PSA
) gen, que está altamente expresado en el epitelio de la próstata normal y en tumores de próstata [28], [29]. La actividad promotor /potenciador puede ser medida por un fundido
Luciferase
gen indicador (Figura 1A). Con el fin de identificar posibles genes quinasa capaz de inducir la actividad transcripcional del
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador
región en condiciones de andrógenos-agotado, cada construcción quinasa, junto con el plásmido indicador , fue co-transfectadas en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos que contenía LNCaP células andrógeno-dependientes (AD-LNCaP) cultivadas en medios suplementados con R1881, un andrógeno sintético (Figura 1A). Veinticuatro horas después de la transfección, las células-AD LNCaP fueron incubadas con el medio que contiene 10% de suero bovino fetal tratado con carbón vegetal (CS-FBS) sin R1881. Después de 24 horas de incubación, la actividad transcripcional de la
PSA
potenciador /promotor
cis
región-regulador en condiciones de andrógenos-agotado se midió mediante ensayos de luciferasa. Fuera de 354 genes de quinasa humanos activados, la expresión de
TPL2
génica en células LNCaP-AD indujo el mayor nivel de actividad transcripcional de PSA en ausencia de R1881 (Figura 1B superior). Como controles, otros oncogenes, como
RAF
y
RAS Windows que previamente han sido conocidos por estar asociados con el crecimiento del cáncer de próstata IDA, se incluyeron [5], [22], [23] , [26], [30]. De hecho su expresión induce la actividad transcripcional del
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador
región en condiciones de andrógenos-agotado para algunos, pero de menor extensión que
TPL2
. Sin embargo, cuando se probó en el receptor de andrógenos (AR) negativos-DU-145 células de cáncer de próstata,
TPL2
no indujo la actividad transcripcional IDA, lo que sugiere que la expresión del RA es necesario que el IDA activación transcripcional del
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador región
inducida por
TPL2 gratis (Figura 1B media; por favor, tenga en cuenta el cambio en la escala del eje Y). Por otro lado, las células de andrógenos agotamiento independiente C4-2B (ADI-C4-2B) mostraron altos niveles endógenos de la actividad transcripcional de la
PSA
potenciador /promotor
cis
región en-regulador la ausencia de R1881 (Figura 1B inferior). Estos datos plantean la posibilidad de que preexistente alteraciones genéticas y epigenéticas en las células ADI-C4-2B contribuyen al alto nivel endógeno de la actividad transcripcional ADI impulsado por el
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador
región. Debe tenerse en cuenta la inducción de la actividad transcripcional de la
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador región
por
TPL2
sobreexpresión en células LNCaP-AD fue más sorprendente (mayor de 20 veces) en niveles bajos (0.1~0.001 nM) de R1881, que es comparable a los niveles fisiológicos de andrógenos en pacientes que han sido sometidos a cirugía de castración (Figura 1C). Además, la activación transcripcional IDA se suprime con un tratamiento inhibidor TPL2 cuando sea con TPL2 sobreexpresión en células LNCaP-AD o simplemente con la expresión endógena en las células TPL2 ADI-C4-2B (Figura 1D). Para poner a prueba la posibilidad de que el alto nivel endógeno de la actividad transcripcional de la IDA
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador región
en las células ADI-C4-2B puede ser debido a una mayor expresión TPL2, comparamos el nivel de expresión de
TPL2 Hoteles en células LNCaP-AD y ADI-C4-2B. De hecho, las células ADI-C4-2B mostraron un mayor nivel de
TPL2
expresión que en las células LNCaP-AD (Figura S1A). Además, en las células C4-2B, la actividad PSA potenciador /promotor responde a los bajos niveles de expresión TPL2 exógena, pero no a altos niveles de expresión TPL2 (Figura S1B). Es posible que los altos niveles de expresión TPL2 exógeno en las células C4-2B, que ya expresan un mayor nivel de expresión TPL2 endógeno de las células LNCaP, dan lugar a efectos adversos sobre la actividad PSA potenciador /promotor. Por lo tanto, hemos identificado
TPL2
como un oncogén candidato, que puede estar asociado con el crecimiento del cáncer de próstata ADI.
(A) Representación esquemática de la identificación de genes candidatos que pueden inducir la activación transcripcional de un
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador región
reportero construir en condiciones de andrógenos empobrecido en células LNCaP dependientes de andrógenos. Myr, secuencia de miristoilación; SON, elementos de respuesta a andrógenos; CS-FBS, suero bovino fetal tratado con carbón vegetal. (B) la actividad LUC relativa (la
actividad PSA
potenciador /promotor de luciferasa se normalizaron a la actividad de beta-galactosidasa pGL3) se midió después de 24 horas de incubación con 10% CS-FBS sin R1881 (excepto para el segundo columna con 10% FBS + CS-1 nM R1881 como control), después de la co-transfección de plásmidos que expresan formas constitutivamente activadas de los genes de quinasa indicados. Los valores de inducción de plegado (LUC actividad relativa dividida por la actividad basal LUC relativa del control de vectores) se indican en el gráfico para las células LNCaP. actividades LUC relativa sobre
TPL2
expresión se indican en rojo. Aumentos estadísticamente significativos en las actividades de LUC en comparación con el control sin tratamiento vector R1881 están marcados con * (p & lt; 0,05). (C) la actividad LUC relativa con el aumento de concentración de R1881 en células LNCaP transitoriamente co-transfectadas con plásmidos que expresan ya sea miristoilada
TPL2
o con el vector vacío. Aumentos estadísticamente significativos en la actividad LUC en comparación con cada concentración de R1881 que corresponde con el control del vector están marcados con * (p & lt; 0,05). (D) la actividad LUC relativa al aumentar la concentración de inhibidor TPL2 ya sea en células LNCaP-AD transitoriamente co-transfectadas con plásmidos que expresan myristoylated
TPL2
o en células AI-C4-2B no transfectadas. LUC actividades relativas con /sin R1881 se indican en negro como controles. Aumentos estadísticamente significativos en las actividades de LUC en comparación con el control sin tratamiento vector R1881 están marcados con * (p & lt; 0,05). Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces con cada uno por triplicado, y cada columna representa la media ± desviación estándar.
TPL2 activación induce la ADI Crecimiento de AD Las células del cáncer de próstata
Para verificar si
TPL2
está asociado funcionalmente con el crecimiento de células de cáncer de próstata ADI, que investigó las consecuencias funcionales de la sobreexpresión o supresión de
TPL2
en células de cáncer de próstata IDA o AD, respectivamente. En primer lugar, para determinar si
TPL2
sobreexpresión es suficiente para promover el crecimiento del cáncer de próstata IDA, establecimos líneas celulares estables AD-LNCaP que sobreexpresan o bien N-terminal de tipo salvaje-myc etiquetados [
myc-TPL2
(WT)], una forma constitutivamente activado con una deleción de los 70 aminoácidos en su extremo C-terminal [
una forma quinasa inactiva de
TPL2
(? C)], o > [
myc-TPL2 gratis (D270A)] usando el vector pBabe-puro (Figura 2A). La expresión de cada gen transducido fue confirmada por Western blot (Figura 2B). Curiosamente, la expresión de
myc-TPL2 gratis (? C) mutante constitutivamente activado fue inferior a la de
myc-TPL2 gratis (WT) y
myc-TPL2
mutante D270A pesar que tiene el más alto nivel de fósforo-ERK, una molécula de señalización aguas abajo (Figura 2B). Para eliminar la posibilidad de efectos a nivel de la expresión, se estableció otro conjunto de líneas celulares estables AD-LNCaP que sobreexpresan o bien C-terminal de tipo salvaje marcada con FLAG (
TPL2
en peso de bandera), un constitutivamente forma activada con una deleción de 70 aminoácidos en el extremo C-terminal (
TPL2
-delC-bandera), o una forma inactiva de la quinasa-
TPL2 gratis (
TPL2 CD - inactiva-flag) utilizando el vector pEF-IRES-Puro (Figura S2). Esta condición también mostró la menor expresión de
TPL2
-delC-bandera que
TPL2
en peso de bandera y
TPL2
-inactive-flag (Figura S2), lo que sugiere que la expresión de una forma constitutivamente activa de
TPL2
encima de los niveles fisiológicos pueden tener efectos adversos en la célula. Sin embargo, independientemente
TPL2
niveles de expresión, las células LNCaP que expresan bien en general
myc-TPL2 gratis (WT) o Myc
TPL2 gratis (? C) mostró aceleró la proliferación celular en andrógenos privados, -baja y condiciones Ricos en comparación con las células LNCaP que expresan el vector solo o Myc
TPL2
mutante (D270A) (Figura 2C). En particular, las células LNCaP que expresan myc-
TPL2
(? C) mostraron aumentos estadísticamente significativos en la proliferación celular en comparación con las células control (LNCaP-GFP) bajo la condición de andrógenos agotado y a bajos niveles de R1881 (0,01 nM y 0,1 nM) a los 3, 6, 9 días (* valor de p & lt; 0,05). Datos similares se obtuvieron con líneas celulares estables construidos con el vector pEF-IRES-Puro (Figura S2). Por lo tanto, estos datos indican que
TPL2
la activación por sobre-expresión, ya sea de tipo salvaje o una forma constitutivamente activa de TPL2 conduce a la promoción del crecimiento de las células ADI-AD LNCaP.
(A ) Esquema de líneas celulares LNCaP que sobreexpresan estables establecidos ya sea
GFP
, una de tipo salvaje etiqueta myc
TPL2
[
myc-TPL2 gratis (WT)], un myc etiquetadas forma constitutivamente activa de
TPL2
con un truncamiento de los ácidos 70 aminoácidos en su extremo C-terminal [
myc-TPL2 gratis (? C)], o una forma inactiva quinasa-myc-etiquetados de
TPL2
[
myc-TPL2 gratis (D270A)] usando el vector de expresión pBabe-puro. (B) Análisis de transferencia Western para detectar la expresión de la
TPL2
constructos anteriores (como se indica con las flechas en rojo). β-actina se utilizó como control para la carga de la misma cantidad de proteínas. (C) ensayos de MTT para medir la proliferación celular de las líneas celulares estables por encima en ausencia o con niveles bajos de R1881 (0,01 nM, 0,1 nM, y 1 nM). aumentos estadísticamente significativos en la proliferación celular en comparación con las células control (LNCaP-GFP) están marcados con * (p & lt; 0,05).
La supresión de la expresión TPL2 o la inhibición de su actividad quinasa en ADI cáncer de próstata células provoca una menor proliferación fenotipos
a continuación, para determinar si las células del cáncer de próstata ADI dependen de
TPL2
para su crecimiento celular IDA, suprimimos
TPL2
expresión o actividad, ya sea por caída o por tratamiento inhibidor TPL2, respectivamente shRNA mediada. Como se muestra en la Figura S1,
TPL2
expresión era es mayor en las células ADI-C4-2B que en las células LNCaP-AD. La disminución de expresión de
TPL2 Hoteles en células ADI-C4-2B por desmontables shRNA mediada utilizando el vector de pLKO.1-TRC fue confirmado por Western blot (Figura 3A). células ADI-C4-2B con una disminución de expresión de
TPL2
mostró la tasa de proliferación reducida considerablemente en condiciones de andrógenos empobrecido (Figura 3B). Se confirmó estos datos por el sistema mediada desmontables shRNA adicional utilizando el vector lentiviral pGIPZ (Figura S3). Además, el crecimiento celular de las células ADI ADI-C4-2B también se redujo significativamente en el tratamiento de un inhibidor de TPL2 [Figura 3C; La concentración inhibitoria 50% (IC
50) de 4,0 M se determinó como en la figura S4]. La supresión de la MEK /ERK vía en células de ADI-C4-2B con el tratamiento de TPL2 se confirmó por Western blot (Figura 3D). En conjunto, estos datos indican que
TPL2
activación es necesaria para la eficiente el crecimiento de las células ADI ADI-C4-2B.
(A) Análisis de transferencia Western para mostrar la cantidad de
TPL2
expresión en las líneas celulares estables que expresan los C4-2B shRNAs indicadas usando el vector lentiviral pLKO.1-TRC en el momento de la siguiente ensayo MTT. β-actina se utilizó como control para la carga de la misma cantidad de proteínas. ensayos (B) de MTT para medir la proliferación celular de las líneas celulares estables en ausencia de R1881. * P & lt; 0,05. (C) ensayos de MTT para medir la proliferación celular de las células C4-2B agotamiento independiente de andrógenos con el tratamiento de inhibidor de TPL2 (4 M). (D) La supresión de la vía MEK /ERK en las células ADI-C4-2B al aumentar la concentración de un inhibidor de TPL2 fue confirmada por Western blot.
TPL2 activación Promueve el crecimiento del cáncer de próstata ADI en el PTEN Supresión Modelo de ratón
Anteriormente, se había demostrado que la eliminación bialélico PTEN condicional en el epitelio de próstata podría inducir adenocarcinoma que recapitula la mayoría de las características histopatológicas de cáncer de próstata humano [31], [32], [33]. Más importante, la ablación de andrógenos de estos ratones por castración quirúrgica condujo a la aparición de ADI el crecimiento del cáncer de próstata (Figura 4A) [33]. Recientemente, se establecieron líneas celulares de cáncer de próstata a partir de los cánceres de próstata primarios de la
PTEN
supresión modelo [34]. Después del cultivo a largo plazo de estas células en condiciones de andrógenos-agotado, las células de cáncer de próstata como ADI designadas como células "E" evolucionado después de una muerte celular masiva inicial de células de AD. Además, también se establecieron líneas celulares de cáncer de próstata por cáncer de próstata recurrente IDA que se desarrolló después de la castración quirúrgica y celdas con nombre "CE" [34]. A diferencia de las células E, estas líneas de células CE se andrógenos agotamiento independiente desde el principio de tal modo que no existía la muerte celular masiva inicial en condiciones de andrógenos empobrecido. Para investigar si
TPL2
activación es fisiológicamente relevante para el crecimiento del tumor IDA
in vivo
, que primero se compararon los niveles de expresión de
TPL2
entre E líneas celulares (E2 y E4) y líneas celulares CE (CE1, CE2, CE3 y). líneas de células CE (CE1, CE2, CE3 y) mostraron niveles más altos de
TPL2
expresión en comparación con líneas celulares E (E2 y E4) por western blot e inmunohistoquímica (Figura 4B y 4C). Curiosamente, las líneas celulares E mostraron niveles ligeramente más altos de
AR
expresión de líneas de células CE, lo que sugiere que las líneas celulares E pueden haber adquirido crecimiento ADI aunque AR sobreexpresión (Figura 4B). El crecimiento de las células ADI de células CE (CE1, CE2, CE3 y) era más notablemente afectados que las células E (E2 y E4) cuando se tratan con niveles crecientes de un inhibidor de TPL2 (Figura 4D). En conjunto, estas observaciones sugieren que
TPL2
también se requiere para el crecimiento de células de cáncer de próstata ADI eficiente en el modelo de ratón.
(A) Esquema de la "Pb-Cre4 :: Pten
f /f :: β-Actinp-GFP
f /f-Luc "modelo de ratón, en el que
PTEN
alelos se suprimen homocigótica y
luciferasa
se expresa en el epitelio de la próstata por la próstata-específico
probasina
promotor (Pb) impulsada Cre expresión de la recombinasa. Estos ratones compuesto desarrollado próstata Neoplasia intraepitelial (PIN), adenocarcinoma invasivo de próstata y cáncer de próstata metastásico en los tiempos indicados. Lo más importante, la ablación de andrógenos de estos ratones por castración quirúrgica condujo a la aparición del crecimiento del cáncer de próstata ADI a veces varía de 7 a 28 semanas después de la castración en todos los ratones vivos. líneas celulares de cáncer de próstata E2 y E4 se establecieron inicialmente a partir de células de cáncer de próstata primario antes de la castración que más tarde se convirtió en el crecimiento ADI cultivo a largo plazo en condiciones de andrógenos-agotado. Sin embargo, se establecieron líneas celulares de cáncer de próstata CE1, CE2, CE3 y de los cánceres de próstata ADI después de la castración. Fotos (200X) son representativos de morfologías celulares de células E2 y CE1. (B) Análisis de transferencia Western para comparar los niveles de expresión de AR y TPL2 entre líneas E de células (E2 y E4) y líneas de células CE células (CE1, CE2, CE3 y).
β-actina
se utilizó como control para la carga de la misma cantidad de proteínas. AD, dependiente de andrógenos; ADI, el agotamiento de andrógeno-independiente; y AR, receptor de andrógenos. (C) El análisis inmunohistoquímico para examinar
TPL2
expresión en AD y de próstata ADI cánceres de
PTEN
supresión modelo de ratón. tejido duodeno humano que expresa altos niveles de TPL2 endógeno se utilizó como control positivo (superior derecha). Como control negativo, el tejido se tiñó sólo con el anticuerpo secundario (superior izquierda). PCA, el adenocarcinoma de próstata. (D) ensayos de MTT para medir la proliferación celular de las células E (E2 y E4) y células CE (CE1 y CE3) con el tratamiento de diferentes niveles de inhibidor TPL2 (0, 1, 5, o 10 mM). disminuciones estadísticamente significativas en la proliferación celular en comparación con el tratamiento con vehículo están marcados con * (p & lt; 0,05).
TPL2 expresión está regulada positivamente en muestras de cáncer de próstata humanos ADI
Finalmente, para validar la relevancia clínica de
TPL2
acción quinasa en el crecimiento del cáncer de próstata humano IDA, se analizó la frecuencia de
TPL2
expresión en ADI especímenes de cáncer de próstata humano utilizando microarrays de tejidos (TMA). Se evaluó la inmunotinción TPL2 de 12 normales (N), 52 hormona naïve (HN), 52 hormono-resistente (AR), 26 con hormonas ingenuo metastásico (HN Met), y 12 metastásico refractario a las hormonas (HR Met) se fija con formalina muestras incluidas en parafina. La Figura 5A muestra fotografías representativas de la expresión de TPL2 normal de la próstata, cáncer de próstata hormono-ingenuo, y de próstata humana TMA muestras de cáncer de próstata refractario a hormonas. Como se muestra en la Figura 5B, la frecuencia global de tinción TPL2 aumentó en las muestras de hormonas naïve (34,8%) y de la hormona refractario (36,5%) en comparación con muestras normales de la próstata (18,2%). Los aumentos son más significativos en las muestras de cáncer de próstata metastásico con 46,2% (p & lt; 0,05) de la hormona metastásico-naïve y 41,7% de las muestras metastásicos refractarios a las hormonas, lo que sugiere que la expresión TPL2 también puede estar asociada con la metástasis del cáncer de próstata. En particular, tanto la puntuación de tinción media global y la frecuencia de las muestras con un esfuerzo fuerte mayor puntuación con la progresión del cáncer de próstata (Figura 5B). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la expresión de TMA TPL2 está regulada positivamente con la progresión del cáncer de próstata.
(A) fotos representante de cada uno de próstata normal (N), el cáncer de próstata hormona-naïve (HN), hormona-refractario cáncer de próstata (HR), el cáncer de próstata metastásico hormono-naïve (HN Met), y el cáncer de próstata metastásico hormono-resistente (HR Met) de los microarrays de tejidos de próstata humano manchadas. expresión TPL2 se detectó mediante análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo contra TPL2. (B) Análisis estadístico de expresión TPL2 en cada grupo de N, HN, HR, HN Met, muestras de AR se reunió con los microarrays de tejidos de próstata humanos teñidos en cuanto a las puntuaciones medias de tinción y el porcentaje de tinción. Las diferencias estadísticamente significativas en la puntuación de tinción media está marcado con * (p & lt; 0,05). se indican los números totales de las muestras para cada grupo. intensidad de la tinción se puntuó de forma independiente por dos patólogos urológicos con 0 (sin manchas), 1 (tinción débil), 2 (tinción intermedia), y 3 (fuerte tinción) para cada muestra.
Discusión
el cáncer de próstata puede ser fácilmente tratada y curada si se detecta en sus primeras etapas, cuando el crecimiento del tumor todavía está confinado a la próstata. Sin embargo, una vez que el cáncer se extiende más allá de la glándula de la próstata, el tratamiento se hace difícil, aunque se utilizan las opciones de tratamiento, como la terapia de radiación, terapia hormonal y la quimioterapia con diferentes grados de efectividad. La aparición de una forma más agresiva, el agotamiento de andrógeno-independiente (IDA) de cáncer de próstata es la complicación frecuente y la razón para el fracaso de la terapia hormonal. Por lo tanto, los estudios relacionados con la identificación y caracterización de la genética subyacente el crecimiento del cáncer de próstata ADI son críticos para el desarrollo futuro de estrategias terapéuticas impulsado diana para el tratamiento eficaz del cáncer de próstata ADI. En este estudio, mediante el cribado de una biblioteca de quinasas humanas activadas, hemos identificado y caracterizado un gen quinasa,
TPL2
, que aparece para impulsar el crecimiento del cáncer de próstata IDA. Más importante aún,
TPL2
es upregulated en ADI cánceres de próstata, tanto de la
PTEN
supresión modelo del ratón y los especímenes clínicos de cáncer de próstata. Estos datos sugieren fuertemente que
TPL2
quinasa juega un papel fundamental en la promoción de la progresión del cáncer de próstata IDA.
TPL2
, también conocida como la progresión del tumor locus 2, que codifica una producto con una deleción de su región C-terminal se clonó inicialmente como un gen transformante de una línea celular de carcinoma de tiroides humana, y se llamó
cuna
(cáncer de tiroides Osaka) [35]. Casi al mismo tiempo, también fue identificada como una proteína quinasa asociada con el desarrollo de linfoma de células T, cuando se descubrió que la leucemia murina de Moloney genoma proviral se había integrado en el último intrón del
TPL2
gen que resulta en una deleción de su C-terminal [36]. Un estudio de ratón transgénico mostró que sólo los ratones transgénicos que expresan una forma delecionada C-terminal de
TPL2
bajo el control de un proximal
Lck
promotor desarrollaron linfoma de células T, lo que sugiere que el C-terminal dominio de tipo salvaje
TPL2
juega un papel inhibitorio en su actividad quinasa [37]. De hecho, el C-terminal suprimido TPL2 ha aumentado la estabilidad y una actividad de la quinasa específica más alta que el tipo silvestre. Además, TPL2 interactúa con un regulador negativo, la proteína NF-kappa B-inhibidor NF-κB1 p105 a través de su C-terminal, y por lo tanto el C-terminal suprimido TPL2 es insensible a p105 regulación negativa [38], [39]. Curiosamente,
TPL2
expresión es también regulada al alza en aproximadamente el 40% de las muestras de cáncer de mama humano, que pueden ser causados por un aumento de
TPL2
número de copias de genes [40]. Por lo tanto, es importante determinar si la activación de señalización TPL2 en muestras de cáncer de próstata humano puede ser debido ya sea a la mutación genética en una región C-terminal o un aumento del número de copias del gen. Nuestros datos muestran que TPL2 se expresa a un nivel más alto en las células ADI-C4-2B que en las células LNCaP-AD, lo que contribuye al alto nivel endógeno de ADI activación transcripcional del
PSA
potenciador /promotor de
cis-regulador región
en las células ADI-C4-2B (Figura S1). También se comparó la
TPL2
secuencias de dos líneas celulares, pero no detectó ninguna diferencia en la secuencia, lo que sugiere que el fenotipo de las células C4-2B ADI no está asociado con mutaciones específicas en el
TPL2
gene. Además, un estudio previo mostró que el nivel de mRNA de
TPL2
en la próstata del ratón aumentó después de la castración quirúrgica, pero posteriormente disminuyeron después de la re-administración de testosterona [41]. Estos datos sugieren que los microarrays
TPL2
expresión en la próstata es inversamente regulado por la testosterona a nivel de transcripción. Por lo tanto, es posible que la disminución de nivel de andrógenos con la terapia hormonal puede aumentar la expresión TPL2, lo que resulta en la supervivencia de células de cáncer de próstata y la proliferación bajo condiciones de andrógenos empobrecido. Esta hipótesis está bajo una investigación activa.
En la presencia de andrógenos, AR se somete a la fosforilación, la dimerización, y la translocación en el núcleo, en el que se une a sitios, resultando en la activación transcripcional de los genes diana [8] . Sin embargo, varios informes indican que AR es todavía necesario para el crecimiento del cáncer de próstata ADI [9], [10]. En cuanto a los mecanismos subyacentes de crecimiento del cáncer de próstata ADI mediada por TPL2, una pregunta es si esta acción requiere la expresión y actividad de AR. La abrogación de la activación del promotor de PSA mediada por TPL2 en DU-145 células de cáncer de próstata AR-negativos sugiere que
TPL2
mediada por el crecimiento del cáncer de próstata IDA puede ser aún depende de la actividad de AR.