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Extracto
TRIM familia de proteínas es una familia de genes evolutivamente conservados implicados en una serie de procesos críticos incluidos la inflamación, la inmunidad, antiviral y el cáncer. En un esfuerzo para perfilar los patrones de expresión de la superfamilia TRIM en varias líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), se encontró que la expresión de 10 genes TRIM incluyendo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59 , TRIM66 y TRIM70 se reguló de manera significativa en líneas celulares de cáncer en comparación con la línea normal de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE), mientras que la expresión de otros genes 7 TRIM incluyendo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 y TRIM76 fue significativamente abajo regulado en líneas celulares de cáncer en comparación con la de las células HBE. Como se ha informado TRIM59 para actuar como un proto-oncogen que afecta tanto a vías de señalización Ras RB y en modelos de cáncer de próstata, nos centramos aquí en el papel de TRIM59 en la regulación de la proliferación celular y la migración NSCLC. Nos informó que la proteína TRIM59 se incrementó significativamente en varias líneas celulares de cáncer. SiRNA inducida derribando de TRIM59 inhibió significativamente la proliferación y migración de las líneas de células de NSCLC mediante la detención del ciclo celular en fase G2. Por otra parte, TRIM59 derribando afectó a la expresión de un número de proteínas del ciclo celular incluyendo Cdc25C y CDK1. Por último, se derribaron TRIM59 y encontró que los niveles de expresión de la proteína p53 no regular al alza, por lo que hemos propuesto que TRIM59 puede promover el crecimiento de células NSCLC a través de otras vías, pero no la vía de señalización de p53
Visto:. Zhan W, T Han , Zhang C, Xie C, Gan M, Deng K, et al. (2015) TRIM59 promueve la proliferación y migración de células no pequeñas cáncer de pulmón de células mediante la regulación al alza del Ciclo Celular Las proteínas relacionadas. PLoS ONE 10 (11): e0142596. doi: 10.1371 /journal.pone.0142596
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: Abril 27, 2015; Aceptado: 23 de octubre de 2015; Publicado: 24 Noviembre, el año 2015
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Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este estudio fue parcialmente apoyado por becas JB Wang, de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81372823, 31360282), el Departamento de Educación de la provincia de Jiangxi (programa de Ciencia y Di Tecnología Luo), y una donación de MG Fu de los Institutos nacionales de Salud (AI103618).
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El motivo (TRIM) familia de proteínas tripartita compuesta por más de 70 miembros que están implicados en una amplia gama de procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular [1], la diferenciación [2], el desarrollo [3], la apoptosis [4], la inflamación y la inmunidad [5, 6]. La característica más llamativa de la superfamilia de proteínas TRIM es el orden altamente conservadas de los dominios en el motivo RBCC, que contiene un anillo de dominio, uno o dos motivos B-box y una bobina en espiral-región [7, 8]. La mayoría de las proteínas TRIM constituyen una nueva clase de dedo anular ligasas E3 ubiquitina individuales que promueven modificaciones post-traduccionales de diversos sustratos, incluidos ellos mismos [7]. Las proteínas TRIM también forman multimerización por medio de la auto-asociación a través de los dominios de doble espiral, que actúan como soportes para el montaje de varios complejos de proteínas que identifican los compartimentos subcelulares [9]. Durante la última década, mucha atención se ha cosechado en explorar el papel de las proteínas TRIM en la inmunidad innata a infecciones virales [10]. En los últimos años, varios grupos informaron que las proteínas TRIM también están actuando como oncogenes o supresores de tumores que implican en varios crecimiento del cáncer. Por ejemplo, Raheja et al. informó que TRIM3 es un supresor de tumores de buena fe, su capacidad de inhibir la proliferación de células depende de la NHL (llamado así por el nCL1, HT2A y repita LIN41) de dominio y su anillo de dominio [11]. TRIM16 inhibe la proliferación de células de neuroblastoma y la migración in vivo y la tumorigenicidad in vitro a través de cambios de expresión de ciclina D1 y p27 [12]. Trim28 aparece aumentada en muchos tipos de cáncer. En la etapa temprana de los tumores de pulmón, de alta trim28 se correlaciona con el aumento de la supervivencia general [1]. Por otra parte, trim28 reduce la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de pulmón modelo puenteando HDAC1 /interacciones E2F [1]. Recientemente, Zhou et al (2014) informó que en el tumor gástrico, TRIM59 interactúa con p53, promoviendo su ubiquitinación y degradación; TRIM59 podría promover la carcinogénesis gástrica a través de este mecanismo [13].
En un esfuerzo para perfilar el patrón de expresión de TRIM superfamilia en varias líneas celulares de cáncer, la expresión de varios genes incluyendo TRIM TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 y TRIM70 se reguló de manera significativa en líneas celulares de cáncer en comparación con la línea normal de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE), mientras que la expresión de otros genes TRIM incluyendo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 y TRIM76 fue significativamente las reguladas en líneas celulares de cáncer en comparación con la de las células HBE. Como se ha informado TRIM59 para actuar como un proto-oncogen que afecta tanto a las vías de señal RB en modelos de cáncer de próstata [14] Ras y, aquí nos centramos en el papel de TRIM59 en la regulación de la proliferación celular y la migración NSCLC. En primer lugar, encontramos que la proteína TRIM59 se incrementó significativamente en varias líneas celulares de cáncer. SiRNA inducida derribando de TRIM59 detenido significativamente la proliferación y migración de las líneas celulares de cáncer mediante la detención del ciclo celular en la fase G2.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
bronquiales humanas células epiteliales (HBE) eran de Sciencell Company y se hicieron crecer en medio de células del epitelio bronquial (Sciencell, 3211). No pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) (H1299, H292, A549) fueron de ATCC y la línea celular SPC-A1 fue un regalo del grupo del Dr. Wang Xuerong (Departamento de Farmacología de la Universidad de Medicina de Nanjing). líneas celulares de NSCLC se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco). Todas las células se cultivaron en una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C.
purificación de ARN y análisis Q-PCR
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen, 15596 -026). La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de reactivos PrimeScript TA con gDNA Borrador (Takara, RR047A). experimentos Q-PCR se llevaron a cabo utilizando el kit SYBR Green Premezcla Ex Taq II (Takara, RR820A) y RT-PCR System-Applied Bio-sistema. La cantidad relativa de la expresión de ARNm de los genes diana se calculó por el método comparativo Ct usando GAPDH como control. Todas las reacciones de Q-PCR se realizaron por triplicado. Los datos fueron adquiridos utilizando ABI ViiATM 7 instrumento sistema de PCR en tiempo real. Todos los cebadores para los 72 genes TRIM se validaron utilizando estándares universales de ADNc (BD Clontech). La cuantificación se realizó por el método de? Ct, con 18S o actina utilizados para la normalización. ARNm con tiempos de ciclo ≥ 34 fue determinante para ser detectados. los niveles de ARNm normalizados se expresan como unidades arbitrarias de los tiempos de ciclo transformadas usando 2
Ct. Los datos se oponían a log2 y organizados en un mapa de calor utilizando el software MEV (Instituto de Cáncer Dana-Farber, http://www.tm4.org/mev.html).
ensayo de suero de baja densidad de saturación y ensayo
para el ensayo de suero bajo, las células se sembraron a una densidad de 10
5 células en placas de 12 pocillos y se dejaron adherir durante la noche en medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Al día siguiente, el número de células se contó como los datos del día 0, se cambió el medio a RPMI 1640 suplementado con 1% de FBS y luego se cambian cada dos días durante 6 días. En los tiempos indicados, las células se tripsinizaron y se contaron con un hemocitómetro. Para el ensayo de densidad de saturación, 10
5 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. El medio se cambió cada dos días. La densidad celular se determinó contando las células en el sexto día.
Colonia ensayo de formación de
Colonia ensayo de formación se llevó a cabo con células H1299 que se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% FBS en 60 placas mm y transitoriamente transfectadas con ARNsi de control, TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 o sin tratar como un control positivo. Después de la transfección, las células se tripsinizaron, se contaron y se sembraron 500 células en placas de 6 pocillos, y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, se cambió el medio a RPMI 1640 + 5% de FBS. Todas las células se cultivaron después durante 2 semanas, con el medio de cambió cada segundo día. Las placas se fijaron con formaldehído al 4% y se tiñeron con 2% de cristal violeta. Las imágenes fueron obtenidas por una cámara digital.
ARNsi
El derribo de TRIM59 se llevó a cabo utilizando dos dúplex de Stealth Seleccionar RNAi distintos (Life Technologies Company). secuencias de oligonucleótidos específicos fueron: siRNA-1: GCCUCUCUAUCUGUUUACCAAAGUU; siRNA-2: UCCUCGUGUACUGCCAUGCUCUCAU; Cautela RNAi duplex control negativo de Life Technologies Company se utilizó como control. Los nucletides RNAi se transfectaron transitoriamente en células HBE o células de NSCLC mediante ARNsi SuperFectin reactivo de transfección (Pufei, Shanghai, 2103-100) y la relativa tumbar la eficiencia se determinó por el anticuerpo TRIM59.
ensayo de la cicatrización de heridas y arañazos la migración de ensayo
la migración celular transwell se midió utilizando un ensayo de cero [15]. H1299 células se sembraron en placas de 6 pocillos para crear una monocapa confluente de 90-100% de confluencia, a continuación, la monocapa se raspó en una línea recta para crear un "cero" por una punta de pipeta de 200 l. Después de la eliminación de los desechos y la adición de medio fresco que contenía FBS al 2%, las células se fotografiaron usando el microscopio de contraste de fases (Olympus IX71; ampliación: 200 ×; objetivo: LCAch20XPh; sin filtro, la cámara: DP72; exposición y Análisis de Imágenes: cellSens software; tamaño de píxel: 1,4 megapíxeles CCD monocromo). La distancia de migración se evaluó utilizando el software de imagen J (Institutos Nacionales de Salud, http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Una tasa de migración celular se calculó el área de migración relativa para cada tratamiento.
Ensayo de migración
Transwell se realizó utilizando cámaras transwell tamaño de poro 8μm (BD Falcon). Un total de 10
5 células en 0,2 ml de medio suplementado con 1% de SFB se sembraron en la cámara superior. La cámara inferior del dispositivo transwell se llenó con 500 l de RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Después de incubación a 37 ° C durante 10 horas, se eliminaron las células restantes en la superficie superior de la membrana. Se fijaron las células en la superficie inferior de la membrana, se tiñeron con cristal violeta y después se contaron con un microscopio óptico (Olympus IX71; ampliación: 40 ×; objetivo: UplanFl4XPh; sin filtro; cámara:;: software de cellSens exposición y Análisis de Imágenes DP72 ; tamaño de píxel: 1,4 megapíxeles CCD monocromo). Se obtuvieron imágenes de 400 células totales.
Análisis del ciclo celular
Se recogieron las células recién preparados y re-suspendieron en 0,5 ml de PBS. A continuación, las células se fijaron con alcohol 70% en hielo durante al menos 2 horas. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó con PBS una vez. pellet de células se resuspendió en 5 ml de PBS y luego se contaron las células. Re-suspendido 2 × 10
5 células con reactivo ciclo celular guayaba 400μl (Millipore, 4700-0160). Después de incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 15 minutos, el ciclo celular se analizó mediante la guayaba Millipore easyCyte ™ citómetro de flujo (Millipore).
inmunofluorescencia tinción
Las células se sembraron en 24 pocillos placas y se dejaron crecer durante 18-24 horas. Las células se fijaron con metanol frío durante 5 min a temperatura ambiente y se aclararon por PBS por tres veces. Luego, las células se bloquearon con suero de cabra normal 5%, 0,3% Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. El anticuerpo anti-PCNA (Abcam, ab92552) incubación se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, se aplicó de cabra conjugado con rodamina anticuerpo anti-conejo (Proteintech, SA00007-2) a temperatura ambiente durante 1 hora en un lugar oscuro. Las células se lavaron con PBS tres veces y luego se montan con DAPI Fluoromount-G medio de montaje (Southern Biotech, 0100-20). Por último, las células se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (Olympus IX83; ampliación: 200 ×; objetivo: LUCPlanFl20XPh; ajuste del filtro y el calendario: DAPI: Filtro BA420 y 220ms, PCNA: Filtro BA590 y 360ms; cámara: DP80, la exposición y análisis de imágenes: cellSens software; tamaño de píxel: 12,5 megapíxeles CCD a color). Se obtuvieron imágenes de Total de 600 células.
aislamiento de proteínas y Western blot
Las proteínas de los tejidos y las células se separaron mediante SDS-PAGE estándar 10%, seguido por la transferencia de las proteínas a una membrana de PVDF. Las proteínas fueron detectados por los siguientes anticuerpos primarios: TRIM59 (Sigma, R06835), ciclina B1 (Proteintech, 55004-1-AP), Cdc25C (Proteintech, 16485-1-AP), CDK1 (Proteintech, 19532-1-AP) , p53 (Proteintech, 10442-1-AP), PCNA (Abcam, ab92552) y β-actina (Santa Cruz, sc-4778) y seguido de incubación con un anticuerpo secundario. La tinción se realizó con el reactivo de detección de transferencia Western ECL. El anticuerpo para ß-actina se sirvió como control endógeno. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
Para cada experimento, se realizaron tres repeticiones independientes. Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar. La evaluación estadística se realizó mediante la prueba de la t de Student. La diferencia intergrupo se comparó usando análisis unidireccional de la varianza seguido de la prueba de Dunnett. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. *,
p Hotel & lt; 0,05 frente a control; **,
p Hotel & lt; 0,01 frente a control; ***,
p
. & Lt; 0,001 frente al control
Resultados
TRIM59 es altamente expresado en líneas celulares de cáncer
El cáncer de pulmón es el más tipo común de cáncer entre los hombres en todo el mundo. Los principales tipos principales de cáncer de pulmón son el carcinoma de células pequeñas de pulmón (SCLC) y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). NSCLC no es así respuesta a la quimioterapia y tiene una mayor mortalidad que SCLC [16]. En un esfuerzo por el perfil de los patrones de expresión de la familia de genes TRIM en líneas de células de NSCLC, se seleccionaron cuatro líneas celulares de NSCLC incluyendo H1299, SPC-A1, A549 y H292. La célula epitelial bronquial humana (HBE) se sirvió de control. Los niveles de mRNA de la familia de genes TRIM en estas líneas celulares se midieron por Q-PCR y se analizaron por software MEV (S1 Tabla). La expresión de varios genes TRIM incluyendo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 y TRIM70 se reguló de manera significativa en líneas celulares de cáncer en comparación con las células HBE (Figura 1A y 1B), mientras que la expresión de otros TRIM genes, incluyendo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 y TRIM76 fue significativamente las reguladas en líneas celulares de cáncer en comparación con la de las células HBE (figura 1A y S1 FIG). Los niveles de expresión de ARNm de otros 12 genes TRIM no se detectaron tanto en líneas celulares de cáncer o células HBE. Como se ha informado TRIM59 para actuar como un proto-oncogen que afecta tanto a las vías de señal RB en modelos de cáncer de próstata [14] Ras y, aquí nos centramos en TRIM59 en CPNM para futuras investigaciones.
(A) El ARNm los niveles de expresión de genes de la familia TRIM 60 en cuatro líneas celulares de NSCLC (H1299, H292, SPC-A1 y A549) y la línea celular humana normal del epitelio bronquial (HBE) se determinaron por Q-PCR. Los datos se organizaron en un mapa de calor mediante el uso de software de MEV. Los niveles relativos de expresión de los genes se muestran en la escala de color de 0-4,0435486 en combinación de colores rojo-verde-negro. (B) Los niveles de mRNA expresión de los genes TRIM incluyendo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 y TRIM70 fueron significativamente upregulated en líneas celulares de cáncer en comparación con la de las células HBE. (C) Representación esquemática de TRIM59. TRIM59 contiene un dominio de dedo anular (anillo), un dominio B-caja2 (B2), dos dominios de doble arrollamiento (CC) y un dominio transmembrana (TM). (D) La expresión de TRIM59 en 14 tipos de tejidos normales se comprobó mediante Western blot utilizando anticuerpos TRIM59. (E) La expresión de la proteína TRIM59 en cuatro líneas celulares de cáncer y línea de células HBE. Los lisados de las líneas celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpo TRIM59.
TRIM59 humana es una proteína de 403aa que contiene un anillo de dominio, un dominio caja B, de dos dominios espiral de la bobina y un dominio transmembrana en su extremo C-terminal (Fig 1C). Western blot mostró que TRIM59 era altamente enriquecido en la médula ósea y el bazo, el bajo nivel en el músculo y pulmón, indetectable en otros tejidos que fueron examinados (Fig 1D). Además, Western blot confirmó, además, que el nivel de proteína TRIM59 fue significativamente mayor en todas las líneas celulares de NSCLC que se examinaron de aquel en el HBE (Fig 1E). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que TRIM59 se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer y puede involucrar en la regulación del crecimiento NSCLC.
TRIM59 promueve la proliferación de células de NSCLC
Para examinar la función de TRIM59 en células de NSCLC, se compraron tres siRNAs que se dirigen a TRIM59 humana de Life Technologies Company. Estos siRNAs se transfectaron en la línea celular H1299. Después de 48 horas, el nivel de proteína de TRIM59 se detectó por Western blot. Como se muestra en las figuras inferior de la figura 2A, tanto siRNA-1 y siRNA-2 de manera eficiente derribado TRIM59 en diferentes líneas celulares en comparación con la de control de siRNA. A continuación, examinó los efectos de siRNA inducida por derribar de TRIM59 sobre el crecimiento bajo en suero de las líneas celulares de cáncer. Como se muestra en las figuras principales de la figura 2A, todas las células de NSCLC eran extremadamente eficaces en la cada vez mayor en el suero bajo, sin embargo, cuando fue derribado TRIM59, que eran incapaces de crecer en estas condiciones.
(A) ensayo de suero baja . Las líneas celulares de NSCLC indican transfectadas transitoriamente con TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, el control de siRNA o no transfectadas se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 1% de FBS. En los tiempos indicados, se tripsinizaron y se contaron las células. Los datos representan la media de tres experimentos independientes (media ± DE) (Top figuras). Inmunotransferencia de TRIM59 para comprobar la eficiencia desmontables de TRIM59 siRNAs en las líneas celulares indicadas (figuras inferiores). ensayo de densidad (B) Saturación. Las células de NSCLC indicados transitoriamente transfectadas con siRNA TRIM59-1, TRIM59 siRNA-2, el control de siRNA o no transfectadas se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS durante 6 días, tratadas con tripsina y se contaron. Los datos representan la media de tres experimentos independientes (media ± SD). ensayo de formación (C) Colonia. Quinientos H1299 células transfectadas transitoriamente con TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, el control de siRNA o no transfectadas se sembraron en placas de 6 pocillos en medio RPMI 1640 con 5% de FBS. Después de dos semanas, las células se fijaron y se tiñeron con cristal violeta. pozos representativos se fotografiaron y se muestran.
Se obtuvieron resultados similares cuando se examina la capacidad relativa de TRIM59 para permitir que las células NSCLC para aumentar su densidad de saturación. Las células tratadas con ARNsi TRIM59 fueron significativamente menos denso que el tratado con ARNsi de control o sin tratar. Del mismo modo, siRNA inducida derribando de TRIM59 retrasado significativamente el crecimiento de células de NSCLC, pero no se ve afectado de manera significativa el crecimiento de células HBE (Fig 2B). A continuación, se realizó los experimentos de formación de colonias. Como se muestra en la figura 2C, la derribando de TRIM59 redujo drásticamente la formación de colonias en células H1299. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que TRIM59 es esencial para la proliferación, la formación de colonias de líneas de células de NSCLC. Un estudio reciente sugiere que TRIM59 promueve el crecimiento tumoral gástrico al menos parcialmente a través de p53 [13]. A medida que las células H1299 es una línea celular supresión de p53 (información ATCC), nuestros resultados sugieren que TRIM59 se pueden orientar a otras proteínas para promover el crecimiento de células de NSCLC.
TRIM59 promueve la migración de células de NSCLC
Dado la capacidad de TRIM59 para promover el crecimiento de células de NSCLC y la formación de colonias, estamos interesados en examinar sus posibles efectos sobre la migración de células de NSCLC. Para explorar estos posibles efectos, se llevó a cabo la curación de heridas ensayo. Los resultados mostraron que las células H1299 migran y el área abierta creada por la "herida" fue casi curado después de 36 horas. Sin embargo, la curación de la zona abierta se atenuó notablemente cuando fue derribado TRIM59 (Figura 3A). Para demostrar aún más estos efectos, también hicimos transwell ensayo, como se muestra en la figura 3B, el número de células migradas se reduce mucho cuando TRIM59 fue derribado. Por lo tanto, derribando TRIM59 obstaculizado H1299 migración celular.
H1299 células (A) transitoriamente transfectadas con siRNA TRIM59-1, el control de siRNA o no transfectadas se cultivaron para crear una monocapa confluente de 90-100% de confluencia, a continuación, la monocapa fue raspada en una línea recta para crear un "cero". La extensión de la migración celular fue fotografiada en los tiempos indicados (cifras de la izquierda). Las heridas de rascar transversales fueron examinados y analizados mediante el software de imagen J en 3 sitios diferentes de cada área de la herida de las brechas en cada momento. Los resultados se presentan como media ± error estándar (figura de la derecha). (B) H1299 células transitoriamente transfectadas con siRNA control o TRIM59 siRNA-1 o TRIM59 siRNA-2 y se cultivaron con medio RPMI 1640 que contiene 10% de SFB durante 48 horas. A continuación, las células se trataron con tripsina y se sembraron en cámaras transwell. Después de la incubación durante 10 horas, se fijaron las células, se tiñeron, se fotografiaron y se contaron en cinco vistas al azar.
El derribo de TRIM59 detiene el ciclo celular en la fase G2 NSCLC
El derribo de TRIM59 inhibió NSCLC el crecimiento celular indicando que TRIM59 pudiera ocasionar perturbaciones en los eventos relacionados con el ciclo celular en células de NSCLC. Para examinar los efectos de TRIM59 derribando el ciclo celular, transfectadas TRIM59 siRNA o control de siRNA en células HBE o H1299, el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio. Como se muestra en la figura 4A y 4B, derribando de TRIM59 aumentado significativamente la proporción de fase G2 /M y la disminución de la proporción de S o fases G0 /G1 en comparación con la de siRNA de control tratado o células H1299 no tratados. Para definir con mayor precisión TRIM59 derribando la detención del ciclo celular de H1299 ya sea en la fase G2 o M, el próximo examinado el PCNA por tinción de inmunofluorescencia y Western Blot. Como se muestra en la figura 4C, encontramos que la anulación de TRIM59 en células H1299 drásticamente reducido regulado la tinción de PCNA. Además, que resultado western blot también mostró que el nivel de proteína PCNA se había reducido regulado (Figura 4D). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la disminución de la actividad proliferativa de células en TRIM59 derribando células fueron causados por la detención del ciclo celular en fase G2. Curiosamente, derribando de TRIM59 no tiene efecto evidente sobre el ciclo celular de las células HBE (Fig 4A y 4B), esto podría explicar por qué derribando de TRIM59 no tuvo efectos inhibidores significativos sobre el crecimiento de células HBE porque no tenía efectos sobre la célula células de ciclo.
HBE y H1299 fueron transfectadas transitoriamente con TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, el control de siRNA o no transfectadas se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS durante 48 horas. Se recogieron las células adherentes (A) y análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Los insertos mostraron que la proporción de células para cada fase y están marcados con diferentes colores (rosa: G0 /G1 fase, verde: la fase S, y gris: la fase G2 /M). (B) La relación de las células en cada fase se contó. (C) H1299 células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo anti-PCNA (rojo) y DAPI (azul). (D) Los niveles de expresión de proteínas de PCNA en células H1299 se comprobó mediante Western blot.
El derribo de TRIM59 disminuye la expresión de proteínas del ciclo celular
Para dilucidar el mecanismo de la célula ciclo detenido por TRIM59 derribando, se realizó Q-PCR para comprobar los niveles de mRNA de múltiples genes que juegan papeles esenciales en la fase G2 /M. Como se muestra en la figura 5A, los niveles de mRNA de Cdc2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 y Cdc25C se redujeron significativamente en las células tratadas TRIM59 siRNA comparación con la de control de las células tratadas con siRNA. Además, se examinaron los niveles de proteína de la ciclina B1, Cdc25C y CDK1 por Western blot. Como se muestra en la figura 5B, Cdc25C y CDK1 pero no ciclina B1 se redujo significativamente en las células tratadas TRIM59 siRNA en comparación con la de las células tratadas de control de siRNA. Estos resultados juntos sugieren que TRIM59 es importante para la regulación del ciclo celular por afectar a las proteínas del ciclo celular.
H1299 células transfectadas transitoriamente con TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 o de control de siRNA se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS durante 48 horas. (A) Los niveles de expresión de ARNm de G2 /M fase de los genes relacionados con CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 y Cdc25C fueron probados por cuantitativos PCR en tiempo real. (B) Los niveles de expresión de proteínas de CDK1 (también conocido como CDC2), Cdc25C y ciclina B1 se comprobó mediante Western blot con anticuerpos indicados.
TRIM 59 promueve el crecimiento de células de NSCLC no a través de la vía de señalización de p53
Zhou et al (2014) informó que en el tumor gástrico, TRIM59 interactúa con p53, promoviendo su ubiquitinación y degradación; TRIM59 podría promover la carcinogénesis gástrica a través de este mecanismo de [13]. Para investigar el mecanismo de TRIM59 estimular el crecimiento celular en las células NSCLC, derribaron TRIM59 y se verificaron los niveles de proteína de p53 en líneas celulares de cáncer y células HBE. Para células H1299, es una línea celular de p53 supresión, la proteína p53 no se pudo detectar. Curiosamente, para HBE, H292 y células A549, que son líneas celulares de tipo salvaje p53 [17], los niveles de proteína p53 no fueron afectados por TRIM59 derribando. Sin embargo, para las células SPC-A1, los niveles de proteína p53 fueron menores cuando TRIM59 fue derribado (figura 6). Tomados en conjunto, hemos propuesto que TRIM59 puede promover el crecimiento de células NSCLC a través de otras vías, pero no la vía de señalización de p53.
Cuatro tipos de células de NSCLC indicados y HBe células transitoriamente transfectadas con siRNA TRIM59-1, TRIM59 siRNA-2, ARNsi de control o no transfectadas se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de FBS durante 48 horas. Los niveles de expresión de proteína de p53 se comprobaron mediante western blot utilizando anticuerpos anti-p53 y anticuerpos anti-TRIM59.
Discusión y Conclusiones
AJUSTE proteínas comprenden una gran superfamilia y son importantes reguladores de la procesos celulares incluyendo la inflamación, la inmunidad, la proliferación celular y la apoptosis, y antiviral [1, 4-6, 10]. El objetivo de este estudio es identificar las proteínas TRIM que están potencialmente implicadas en la regulación de la proliferación, la formación de colonias y la migración de células de NSCLC. Utilizamos Q-PCR para un perfil de los niveles de expresión de los genes TRIM 72 en cuatro líneas celulares de cáncer y una línea normal de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE). Se encontró que los niveles de expresión de 10 genes TRIM incluyendo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 y TRIM70 se upregulated significativamente en las células NSCLC en comparación con la de las células HBE, mientras que los niveles de expresión de otros 7 TRIM genes incluyendo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 y TRIM76 fueron significativamente las reguladas en las células NSCLC en comparación con la de las células HBE. Aunque la mayor parte de las proteínas del ajuste son menos caracterizados, algunas proteínas TRIM desempeñan papeles importantes en los procesos celulares relacionados con el cáncer. Por ejemplo, TRIM3, TRIM16, TRIM29 y TRIM36 se han reportado para funcionar como supresores de tumores [18-21]. Curiosamente, TRIM7 se identificó como la proteína que interactúa con glucogenina y participa en la regulación del metabolismo de la glucosa celular [22]. Como la característica única en el metabolismo de las células del cáncer es esencial para el crecimiento y la migración de células cancerosas, sería importante para investigar más a fondo el papel de TRIM7 en el metabolismo celular de células de NSCLC. Además, TRIM67 ha informado de funcionar como un inhibidor de Ras [23]. La regulación a la baja de TRIM67 en células de NSCLC puede contribuir a la activación de la señalización de más de Ras y sobre el crecimiento de células de NSCLC.
Además, caracteriza la función biológica de TRIM59 en la proliferación, la formación de colonias y la migración de células de NSCLC . SiRNA inducida derribando de TRIM59 atenuó significativamente el crecimiento, la formación de colonias y la migración de células de NSCLC, pero no afectó significativamente el crecimiento de las células HBE. Sin embargo, en experimentos in vivo es necesario llevar a cabo para verificar estos resultados. Khatamianfar et al. TRIM59 recientemente identificado como un transductor de señal temprana en dos (SV40Tag y Ras) vías de oncogenes en modelos murinos de cáncer de próstata. Además, Zhou et al. También informó que TRIM59 promueve la tumorigénesis gástrica a través de la regulación por disminución de la abundancia de proteínas p53 y p53 supresión de señales aguas abajo. Para comprobar si TRIM59 promueve la proliferación de células de NSCLC también a través de la ruta de p53, derribaron TRIM59 y registramos la expresión de p53. Para células H1299, que es una línea celular p53 eliminación, para otras líneas celulares, no hay efectos o incluso disminuyeron p53. Así TRIM59 regula la proliferación y migración de células de NSCLC por la orientación otras proteínas que p53.
En conclusión, se ha identificado que TRIM59 es un potencial importante regulador de la proliferación y migración de células de NSCLC. SiRNA inducida derribando de TRIM59 inhibió significativamente la proliferación y migración de las líneas de células de NSCLC mediante la detención del ciclo celular en fase G2. Además, TRIM59 derribando afectó a la expresión de un número de proteínas del ciclo celular incluyendo Cdc25C y CDK1. Sin embargo, el papel fisiológico in vivo y los mecanismos de la proteína TRIM59 necesitan investigarse más a fondo.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Los niveles de expresión de mRNA de los genes TRIM incluyendo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 y TRIM76 fueron significativamente las reguladas en líneas celulares de cáncer en comparación con la de las células HBE
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142596. s001 gratis (TIF)
Tabla S1. El perfil de los patrones de expresión de genes de la familia TRIM en líneas celulares de cáncer.
Hemos seleccionado cuatro líneas celulares de cáncer, incluyendo H1299, SPC-A1, A549 y H292. La célula epitelial bronquial humana (HBE) se sirvió de control. Los niveles de mRNA de la familia de genes TRIM en estas líneas celulares se midieron por Q-PCR. El nivel de expresión de mRNA de los genes TRIM con tiempos de ciclo ≥ 34 se determinó que eran sin ser detectado. TRIM17, TRIM40, TRIM42, TRIM43, TRIM48, TRIM49, TRIM50, TRIM51, TRIM63, TRIM60, TRIM64 y Trim77 no se habían detectado. Medio: media; SD: error estándar; CT:.
Tiempo de ciclo doi: 10.1371 /journal.pone.0142596.s002 gratis (XLSX)